技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂及其制备方法。
背景技术
白内障是眼睛内晶状体发生混浊，由透明变成不透明，阻碍光线进入眼内，从而影响了视力。初期混浊对视力影响不大，而后渐加重，明显影响视力甚至失明。在世界范围内白内障是致盲的首要病因，现在世界上大约有2000万人是由于白内障而致盲，另有1亿白内障患者需要手术恢复视力，在大多数的非洲和亚洲国家，白内障至少占盲人的一半。现代药理学研究表明，葛根素和灯盏乙素是天然的非选择性钙离子通道阻滞剂，具有很强的抗炎、抗氧化、抗纤维化、降低眼压、免疫抑制作用。在抑制眼部炎症反应，防治白内障、青光眼、增生性玻璃体视网膜病变、视网膜母细胞瘤等眼病中显示广阔的应用前景。
随着生物药剂学的发展和眼部药代动力学研究的不断深入，大量研究结果表明，传统的眼用制剂如滴眼液、敷眼剂、洗眼液、眼膏等，存在药物剂量损失大、视觉敏锐性差、生物利用度低等问题。特别是对于需要长期治疗的眼病，即使反复使用也难以达到长效目的，使用高浓度药物还可能引起眼部刺激性和全身毒性反应。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
本发明的第二个目的是提供一种葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的制备方法。
本发明的技术方案概述如下:
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取脂质材料，灯盏乙素，加入溶剂无水乙醇，加热至50-70℃，在搅拌下溶解，得均一第一油相；蒸馏水为第一水相；
(2)另取卵磷脂和胆固醇，加入甲醇乙醇混合液超声溶解，并加入增溶剂，得均一第二油相；再将葛根素，稳定剂，渗透促进剂和阳离子材料加入pH为6.0-7.0的磷酸盐缓冲液中搅拌至完全溶解，得到第二水相；
(3)将第一油相加入第一水相中，在200-400rpm下搅拌1-2h，得第一初乳液；再将第二油相加入第二水相中，在200-400rpm下搅拌1-2h，得第二初乳液；
(4)在搅拌下将第一初乳液滴加至第二初乳液中，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合初乳液；
(5)在功率300-450W的条件下，将混合初乳液超声3-10min，即得葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
优选的是：各原料的比例优选为：脂质材料20-42mg，灯盏乙素1mg，稳定剂4-12mg，卵磷脂1mg，胆固醇1mg，增溶剂1mL，葛根素1mg，渗透促进剂0.1-0.5mg和阳离子材料12-20mg。
脂质材料优选为单油酸甘油酯、甘油单亚油酸酯、二甘油油酸酯、磷脂酰乙醇胺、二亚油酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、植烷三醇中的一种或几种。
稳定剂优选为普朗尼克F127和聚乙烯醇中的一种或两种混合物。
优选地，甲醇乙醇的体积比为1：1。
增溶剂优选为吐温80，聚乙二醇400，甘油中的一种或几种。
渗透促进剂优选为Gelucire 44/14、Labrasol、Solutol HS 15、Transcutol P、Transcutol HP中的一种或几种混合物。
阳离子材料优选为羧甲基壳聚糖，十八烷基羧甲基壳聚糖季铵盐和羟丙基壳聚糖中的一种或几种。
上述方法制备的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
本发明的优点：
本发明的优点：
(1)本发明的制剂具有巨大的膜表面积，载药能力强；能够同时包封亲水性、亲脂性及两亲性药物分子，亲水性药物包封于纳米粒的水道中，亲脂性药物包封于纳米粒的脂质双层膜中。
(2)葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼具有与生物膜类似的微观结构，在体内降解为甘油和脂肪酸，具有良好的生物相容性。
(3)制备材料中的阳离子材料具有较高的生物黏附性，适合作为局部黏膜给药系统的载体。
(4)葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒属于自稳定分散体系，制剂的长期稳定性较高。
(5)能够减少给药次数，提高患者用药的依从性。
(6)具有包封并保护药物、增加溶解度、提高稳定性和促进药物吸收的作用。
(7)能够采用传统方法灭菌,制备工艺相对简单。
附图说明
图1为葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒粒径结果图。
图2为罗丹明B脂质纳米粒制剂和罗丹明B溶液在不同时间点的眼部滞留结果图。其中图2a为罗丹明B溶液；图2b为罗丹明B脂质纳米粒制剂，M1：角膜表面，M2：内眼角。
图3为葛根素脂质纳米粒眼用制剂及药物溶液(葛根素和灯盏乙素的pH为6.8的磷酸缓冲盐溶液)在房水中的药时曲线；
图4为灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂及药物溶液(葛根素和灯盏乙素的pH为6.8的磷酸缓冲盐溶液)在房水中的药时曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
Gelucire 44/14、Labrasol、Solutol HS 15、Transcutol P、Transcutol HP由法国Gattefosse SAS集团出售。
实施例1
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取32.0mg单油酸甘油酯，1mg灯盏乙素加入1mL溶剂无水乙醇，加热至60℃，在搅拌下溶解，得均一第一油相；蒸馏水为第一水相；
(2)另取1mg卵磷脂和1mg胆固醇，加入1mL体积比为1:1的甲醇乙醇混合液超声溶解，并加入1mL吐温80，得均一第二油相；再将1mg葛根素，4.44mg普朗尼克F127，0.5mg Gelucire 44/14和20mg十八烷基羧甲基壳聚糖季铵盐加入2mL pH为6.8的磷酸盐缓冲液中搅拌至完全溶解，得到第二水相；
(3)将第一油相加入第一水相中，在400rpm下搅拌2h，得第一初乳液；再将第二油相加入第二水相中，在400rpm下搅拌2h，得第二初乳液；
(4)在搅拌下将第一初乳液滴加至第二初乳液中，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合初乳液；
(5)在功率450W的条件下，将混合初乳液超声5s，间隔5s，共超声5min，即得葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
取实施例1制备的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂通过粒径测定仪测定粒径分布，平均粒径为181nm。见图1。
实施例2
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取15mg甘油单亚油酸酯，15mg二甘油油酸酯，1mg灯盏乙素加入0.67mL溶剂无水乙醇，加热至50℃，在搅拌下溶解，得均一第一油相；蒸馏水为第一水相；
(2)另取1mg卵磷脂和1mg胆固醇，加入1mL体积比为1:1的甲醇乙醇混合液超声溶解，并加入1mL甘油，得均一第二油相；再将1mg葛根素，4.44mg普朗尼克F127，0.3mg Labrasol和20mg羟丙基壳聚糖加入2mL pH为7.0磷酸盐缓冲液中搅拌至完全溶解，得到第二水相；
(3)将第一油相加入第一水相中，在200rpm下搅拌1h，得第一初乳液；再将第二油相加入第二水相中，在200rpm下搅拌1h，得第二初乳液；
(4)在搅拌下将第一初乳液滴加至第二初乳液中，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合初乳液；
(5)在功率300W的条件下，将混合初乳液超声5s，间隔5s，共超声3min，即得葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
实施例3
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取10mg磷脂酰乙醇胺、20mg二亚油酰磷脂酰乙醇胺、12mg 1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱，1mg灯盏乙素加入1.66mL溶剂无水乙醇，加热至60℃，在搅拌下溶解，得均一第一油相；蒸馏水为第一水相；
(2)另取1mg卵磷脂和1mg胆固醇，加入1mL体积比为1:1的甲醇乙醇混合液超声溶解，并加入1mL聚乙二醇400，得均一第二油相；再将1mg葛根素，12mg普朗尼克F127，0.2mg Solutol HS 15和20mg羧甲基壳聚糖加入pH为6.0的磷酸盐缓冲液中搅拌至完全溶解，得到第二水相；
(3)将第一油相加入第一水相中，在200rpm下搅拌2h，得第一初乳液；再将第二油相加入第二水相中，在200rpm下搅拌2h，得第二初乳液；
(4)在搅拌下将第一初乳液滴加至第二初乳液中，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合初乳液；
(5)在功率400W的条件下，将混合初乳液超声5s，间隔5s，共超声10min，即得葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
实施例4
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)取10mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、10mg植烷三醇、1mg灯盏乙素加入0.83mL溶剂无水乙醇，加热至70℃，在搅拌下溶解，得均一油相；蒸馏水为第一水相；
(2)另取1mg卵磷脂和1mg胆固醇，加入1mL体积比为1:1的甲醇乙醇混合液超声溶解，并加入0.5mL吐温80和0.5mL聚乙二醇400，得均一第二油相；再将1mg葛根素，2mg普朗尼克F127，2mg聚乙烯醇，0.1mg渗透促进剂(Transcutol P和Transcutol HP的质量比为1:1)，6mg十八烷基羧甲基壳聚糖季铵盐、6mg羟丙基壳聚糖加入2mL pH为7.0的磷酸盐缓冲液中搅拌至完全溶解，得到第二水相；
(3)将第一油相加入第一水相中，在400rpm下搅拌1h，得第一初乳液；再将第二油相加入第二水相中，在400rpm下搅拌1h，得第二初乳液；
(4)在搅拌下将第一初乳液滴加至第二初乳液中，搅拌均匀，冷却至室温，得到混合初乳液；
(5)在功率400W的条件下，将混合初乳液超声5s，间隔5s，共超声10min，即得葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂。
实施例5
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的体外释放考察
取实施例1制备得到的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂进行考察。本实验采用的释放介质pH为6.8的磷酸缓冲盐溶液，采用膜透析法考察葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的体外释药特性。
具体实验步骤为：
精密称取葛根素3.25mg，灯盏乙素4.88mg，加入适量pH为6.8的磷酸缓冲盐溶液溶解后，定容至10mL，为葛根素和灯盏乙素的混合溶液，简称药物溶液。
分别精密量取2.0mL葛根素和灯盏乙素脂质液晶纳米粒眼用制剂和药物溶液置于透析袋中，两端用透析袋夹夹紧，置于含60mL释放介质的烧杯中，设置磁力搅拌器转速为200rpm，温度为34±0.5℃。分别于0.5、1、1.5、2、3、4、5、7、9、12h取样1mL，同时补加等温同体积的释放介质。用HPLC法测定药物释放量，每个样品进行三次平行实验。
累计释放量(Qn)和累积释放百分率(F％)分别由公式(1)和公式(2)求得：
式中Qn为各时间点的累积释放量；F％为各时间点的累积释放百分率；t(min)为取样时间点；Cn为第n个取样时间点的实测药物浓度；V0为溶出介质总体积；Vi为每次取样体积；Ci为第i个取样时间点实测药物浓度；C0为总药物浓度。
葛根素体外释放拟合结果见表1。灯盏乙素体外释放拟合结果见表2。
表1葛根素体外释放拟合结果
表2灯盏乙素体外释放拟合结果
将实施例1的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的释放数据进行零级、一级、Higuchi扩散方程拟合并进行回归分析，比较各回归方程的相关系数。所得的拟合方程中以Higuchi方程和Ritger-Peppas方程的R值最高，说明葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂具有缓释作用。
实施例6
实施例1制备的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的的角膜透过性考察
将家兔耳缘静脉注射空气致死。死后迅速取出眼球，除去巩膜、虹膜、晶状体等多余组织，分离出角膜。将新鲜离体角膜固定在Franz扩散池的供给池和接收池之间，使上皮层面向供给池，内皮层朝向接收池。在供给池中分别加入葛根素和灯盏乙素脂质液晶纳米粒眼用制剂和药物溶液1.0mL。将供给池密封，防止蒸发；在接收池中装满pH为6.8的磷酸缓冲盐溶液并排除气泡。整套装置置于透皮扩散实验仪中，恒温水浴温度为(34±0.5)℃。实验开始后，分别于计时后的40，80，120，180，240min从接收池中取样4.5mL，同时补充等体积同温度的磷酸缓冲盐溶液，样品经0.45μm微孔滤膜过滤后，取续滤液进行HPLC测定。
离体角膜渗透参数由以下公式(3)求得：
其中为线性的斜率(μg/min)，60为分与秒的比例，A为角膜面积，C0为初始药物浓度(μg/mL)。
离体兔角膜生理活性的维持对实验稳定至关重要，而角膜水化值是体外评价物质对该组织刺激性的重要指标，正常的角膜水化值为76％～80％，超过83％，即可判定角膜受到一定程度的损伤，故可通过水化值判断葛根素和灯盏乙素脂质液晶纳米粒眼用制剂对角膜的刺激性。小心除去巩膜组织，将体外实验后暴露于扩散介质的角膜区域称其质量，记为mb；60℃干燥12h后再次称其质量，记为ma。角膜水化值按如下公式(4)计算:
离体角膜水化值结果见表3，结果表明各种制剂的HL％均小于83％，说明各种制剂对离体角膜未造成损伤。
表3离体角膜水化值(n＝3)
离体角膜透过参数见表4。
表4离体角膜透过参数
离体角膜透过实验结果表明，与药物溶液相比，制剂中葛根素的Papp增加了2.01倍，灯盏乙素的Papp增加了1.23倍，脂质纳米粒可以显著提高葛根素和灯盏乙素的角膜透过性。
实施例7
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的滞留时间考察
将实施例1的葛根素和灯盏乙素等量替换为罗丹明B同法制备罗丹明B脂质纳米粒制剂进行小动物活体成像，将罗丹明B 3.25mg，4.88mg溶解于10mLpH为7.0的磷酸缓冲盐溶液中制成罗丹明B溶液作为对照考察处方的滞留性(325μg/mL，488μg/mL)。
实验前先观察并记录每只家兔角膜、虹膜及结膜情况，已有病变或炎症者，剔除不用。实验时，每只兔眼用微量加样器准确滴入样品20μL，所有样品都小心滴入结膜囊内，大约内外眦的中间位置，并且滴加后轻轻闭合双睑30s，然后家兔耳缘静脉注射10％的水合氯醛5mL进行全身麻醉并在0，10，30，60，90，120，180min不同时间点进行成像观察。
结果如图2所示，表明脂质纳米粒在眼部的滞留时间明显延长。
实施例8
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的药代动力学考察
(1)微透析探针的植入
手术前三天每天给予氧氟沙星滴眼剂两次，以预防可能发生的眼部炎症。手术前0.5和4h后，家兔耳缘静脉注射100U·kg-1肝素钠，以防止由于炎症反应引起前房内纤维生成。眼部注射0.4ml利多卡因麻醉，用开睑器撑开眼睑，开始手术。用10#针头在眼角部位角膜缘处做贯通性穿刺，抽去针头，调整探针的位置使渗析窗全部浸入房水中，探针两端分别在内眼角和外眼角固定。创口处滴入氧氟沙星眼药水防止感染。经过一天恢复期和消炎药水的洗净期，待创口完全愈合前房充盈后，开始体内药物动力学实验。
(2)兔眼房水内药物代谢动力学实验
以pH为6.8的磷酸缓冲盐溶液为灌注液，流速设定为3.0μL·min-1，冲洗0.5h后，在结膜囊内分别滴入200μL药物溶液，葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂，同时开始收集样品，在最初的1h内每10min收集样品，然后每隔20min收集样品，所有样品直接进高效液相测定。
(3)研究采用非房室模型计算药动学参数，葛根素结果见表5。灯盏乙素结果见表6。
表5葛根素局部给药后药动学参数
表6灯盏乙素局部给药后药动学参数
表5中葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒的Cmax为葛根素溶液的1.69倍；AUC为葛根素溶液的2.33倍；T1/2为葛根素溶液的3.62倍；表6中葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒的Cmax为灯盏乙素溶液的1.12倍；AUC为灯盏乙素溶液的2.32倍；T1/2为灯盏乙素溶液的4.23倍；表明葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂能够提高药物在房水中的溶解度，从而提高生物利用度。葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂及药物溶液中的葛根素在房水中的药时曲线见图3。
葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂及药物溶液中的灯盏乙素在房水中的药时曲线见图4。
实验证明，实施例2、3、4制备的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂的体外释放考察、角膜透过性考察、滞留时间考察和药代动力学考察，与实施例1制备的葛根素和灯盏乙素脂质纳米粒眼用制剂效果相似。