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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610547719.6 (22)申请日 2016.07.12 (71)申请人 成都东山兰韵农业有限公司 地址 610103 四川省成都市龙泉驿区同安 镇上平村二组 (72)发明人 陈泽彬 宋林贵 (74)专利代理机构 成都元信知识产权代理有限 公司 51234 代理人 孙法胜 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种墨兰培养繁殖方法 (57)摘要 本发明涉及植物培养繁殖技术领域， 具体涉 及一种墨兰培养繁殖方法， 包括以下步骤： 。
2、材料 选取、 材料消毒、 诱导培养、 增殖培养、 生根培养、 移栽； 通过本发明能使培养后的苗株成苗率高， 栽培后适应性强， 苗株长势良好， 通过生物技术 手段在短时间内， 满足了商业化生产的需求， 为 企业规模化、 产业化提供了技术支持。 本发明的 成本低， 以1/2MS培养基为基础母液， 并且采用其 他营养物来代替价格昂贵的椰子汁作为营养液， 其大量元素的用量为标准MS培养基的大量元素 用量的一半， 在对平均叶长、 芽平均伸长高度以 及大芽百分比不受影响的前提下， 显著降低了培 养基的制备成本。 权利要求书1页 说明书5页 CN 106171987 A 2016.12.07 CN 1061。
3、71987 A 1.一种墨兰培养繁殖方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)材料选取： 选取当天挖取的无病虫害长势良好的墨兰， 采用假鳞茎为外植体， 去除 多余的叶片； (2)材料消毒： 用软刷毛将选取的墨兰假鳞茎在水池中进行初步清洗， 去除表面的泥 沙， 然后用洗洁精清洗干净， 置于流水下冲洗60min， 将墨兰假鳞茎置于超净工作台上用体 积分数为75的酒精消毒30s， 再用无菌水冲洗5次， 然后用质量分数为0.2的氯化汞溶液 分23次共消毒67min， 每次用氯化汞溶液消毒后将墨兰假鳞茎用无菌水漂洗5次， 并用 消毒滤纸吸干表面水分， 最后在放入质量分数为4的次氯酸钠溶液中消毒57mi。
4、n， 消毒 后用无菌水冲洗68次， 用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用； (3)诱导培养： 将消毒后的墨兰假鳞茎， 接种在芽诱导培养基中进行培养， 所述芽诱导 培养基为： 1/2MS+0.40.8mg/L 6-BA+0.050.08mg/L NAA+2535g/L蔗糖+68g/L琼脂 +13g/L蛋白胨+3040mg/L赤霉素， pH值为5.8； 培养条件： 培养温度2325， 光照时间 为13h/d， 光照强度为13001500lx； (4)增殖培养： 将诱导培养后的墨兰假鳞茎用无菌手术刀切成23cm茎段， 然后转移至 芽增殖培养基中， 所述芽增殖培养基为： 1/2MS+12mg/L。
5、 6-BA+0.10.2mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+68g/L琼脂+36g/L蛋白胨+5060mg/L赤霉素， pH值为5.8； 培养条件： 培养 温度2325， 光照时间为13h/d， 光照强度为15001800lx； (5)生根培养： 将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株切下， 转移到生根 培养基中， 所述生根培养基为： 1/2MS+1.41.6mg/L 6-BA+0.050.08mg/L NAA+2535g/ L蔗糖+68g/L琼脂+13g/L蛋白胨， pH值为5.8； 培养条件： 培养温度2325， 光照时间 为13h/d， 光照强度为17002000lx； (6。
6、)移栽： 当生根培养试管苗生长至23cm高， 根24条， 叶12片时， 将试管苗放在自 然光下炼苗57天， 打开瓶盖炼苗12天； 然后取出培养苗， 用清水洗净附着在根部的培养 基， 清洗时注意不要损害根部， 然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中， 保持 湿度和通风， 空气湿度为7585， 温度为2025。 2.根据权利要求1所述的一种墨兰培养繁殖方法， 其特征在于： 所述芽诱导培养基为： 1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+2g/L蛋白胨+35mg/L赤霉素， pH 值为5.8。 3.根据权利要求1所述的一种墨兰培养繁殖方法。
7、， 其特征在于： 所述芽增殖培养基为： 1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5g/L蛋白胨+55mg/L赤霉素， pH 值为5.8。 4.根据权利要求1所述的一种墨兰培养繁殖方法， 其特征在于： 所述生根培养基为： 1/ 2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2g/L蛋白胨， pH值为5.8。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106171987 A 2 一种墨兰培养繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及植物培养繁殖技术领域， 具体涉及一种墨兰培养繁殖方法。 背景技术 000。
8、2 墨兰又名报岁兰， 是兰科兰属地生植物。 假鳞茎卵球形， 包藏于叶基之内。 叶带形， 近薄革质， 暗绿色。 花葶从假鳞茎基部发出， 直立， 较粗壮， 一般略长于叶； 花的色泽变化较 大， 较常为暗紫色或紫褐色而具浅色唇瓣， 也有黄绿色、 桃红色或白色的， 一般有较浓的香 气； 萼片狭长圆形或狭椭圆形； 花瓣近狭卵形； 唇瓣近卵状长圆形； 蕊柱稍向前弯曲， 两侧有 狭翅； 花粉团4个， 成2对， 宽卵形。 蒴果狭椭圆形， 花期10月至次年3月。 生于林下、 灌木林中 或溪谷旁湿润但排水良好的荫蔽处， 海拔300-2000米。 分布于中国、 印度、 缅甸、 越南、 泰国、 日本琉球群岛等。 00。
9、03 然而， 传统的墨兰培育往往存在繁殖速度慢等缺陷， 难以满足商业化生产的需求。 因此， 人们多数采用组织培养的方法对墨兰进行快速繁殖。 但现有的组织培养往往成苗率 低、 长势不好。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种成苗率高、 长势良好、 成本低的墨兰培养繁殖方法。 0005 为了达到上述目的， 本发明采用的技术方案为： 一种墨兰培养繁殖方法， 包括以下 步骤： 0006 (1)材料选取： 选取当天挖取的无病虫害长势良好的墨兰， 采用假鳞茎为外植体， 去除多余的叶片； 0007 (2)材料消毒： 用软刷毛将选取的墨兰假鳞茎在水池中进行初步清洗， 去除表面的 泥沙， 然后用洗洁精清。
10、洗干净， 置于流水下冲洗60min， 将墨兰假鳞茎置于超净工作台上用 体积分数为75的酒精消毒30s， 再用无菌水冲洗5次， 然后用质量分数为0.2的氯化汞溶 液分23次共消毒67min， 每次用氯化汞溶液消毒后将墨兰假鳞茎用无菌水漂洗5次， 并 用消毒滤纸吸干表面水分， 最后在放入质量分数为4的次氯酸钠溶液中消毒57min， 消 毒后用无菌水冲洗68次， 用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用； 0008 (3)诱导培养： 将消毒后的墨兰假鳞茎， 接种在芽诱导培养基中进行培养， 所述芽 诱导培养基为： 1/2MS+0.40.8mg/L 6-BA+0.050.08mg/L NAA+2535。
11、g/L蔗糖+68g/L 琼脂+13g/L蛋白胨+3040mg/L赤霉素， pH值为5.8； 培养条件： 培养温度2325， 光照 时间为13h/d， 光照强度为13001500lx； 0009 (4)增殖培养： 将诱导培养后的墨兰假鳞茎用无菌手术刀切成23cm茎段， 然后转 移至芽增殖培养基中， 所述芽增殖培养基为： 1/2MS+12mg/L 6-BA+0.10.2mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+68g/L琼脂+36g/L蛋白胨+5060mg/L赤霉素， pH值为5.8； 培养条件： 培 养温度2325， 光照时间为13h/d， 光照强度为15001800lx； 0010 (5)生根培。
12、养： 将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株切下， 转移到 说 明 书 1/5 页 3 CN 106171987 A 3 生根培养基中， 所述生根培养基为： 1/2MS+1.41.6mg/L 6-BA+0.050.08mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+68g/L琼脂+13g/L蛋白胨， pH值为5.8； 培养条件： 培养温度2325， 光照 时间为13h/d， 光照强度为17002000lx； 0011 (6)移栽： 当生根培养试管苗生长至23cm高， 根24条， 叶12片时， 将试管苗放 在自然光下炼苗57天， 打开瓶盖炼苗12天； 然后取出培养苗， 用清水洗净附着在根部的 培。
13、养基， 清洗时注意不要损害根部， 然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中， 保持湿度和通风， 空气湿度为7585， 温度为2025。 0012 如上所述的一种墨兰培养繁殖方法， 进一步说明为， 所述芽诱导培养基为： 1/2MS+ 0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+2g/L蛋白胨+35mg/L赤霉素， pH值为 5.8。 0013 如上所述的一种墨兰培养繁殖方法， 进一步说明为， 所述芽增殖培养基为： 1/2MS+ 1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5g/L蛋白胨+55mg/L赤霉素， pH。
14、值为 5.8。 0014 如上所述的一种墨兰培养繁殖方法， 进一步说明为， 所述生根培养基为： 1/2MS+ 1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+2g/L蛋白胨， pH值为5.8。 0015 本发明的有益效果是： 通过本发明能使培养后的苗株成苗率高， 栽培后适应性强， 苗株长势良好， 通过生物技术手段在短时间内， 满足了商业化生产的需求， 为企业规模化、 产业化提供了技术支持。 本发明的成本低， 以1/2MS培养基为基础母液， 并且采用其他营养 物来代替价格昂贵的椰子汁作为营养液， 其大量元素的用量为标准MS培养基的大量元素用 量的一半， 在对平均。
15、叶长、 芽平均伸长高度以及大芽百分比不受影响的前提下， 显著降低了 培养基的制备成本。 具体实施方式 0016 下面结合实施例对本发明做详细的阐述。 0017 本发明提供的一种墨兰培养繁殖方法， 包括以下步骤： 0018 (1)材料选取： 选取当天挖取的无病虫害长势良好的墨兰， 采用假鳞茎为外植体， 去除多余的叶片； 0019 (2)材料消毒： 用软刷毛将选取的墨兰假鳞茎在水池中进行初步清洗， 去除表面的 泥沙， 然后用洗洁精清洗干净， 置于流水下冲洗60min， 将墨兰假鳞茎置于超净工作台上用 体积分数为75的酒精消毒30s， 再用无菌水冲洗5次， 然后用质量分数为0.2的氯化汞溶 液分23。
16、次共消毒67min， 每次用氯化汞溶液消毒后将墨兰假鳞茎用无菌水漂洗5次， 并 用消毒滤纸吸干表面水分， 一般消毒用的0.1氯化汞溶液灭菌效果不佳， 而浓度较高的氯 化汞溶液又易使外植体失去活性， 抑制芽的诱导， 而本培育方法采用质量分数为0.2的氯 化汞溶液能较好起到灭菌作用而又对其活性影响较小， 并且采用分23次操作， 能更好的 保护外植体活性， 使外植体的发芽率大大增加。 最后在放入质量分数为4的次氯酸钠溶液 中消毒57min， 消毒后用无菌水冲洗68次， 用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中 备用； 0020 表1为采用上述消毒方法对墨兰假鳞茎进行处理后， 放置于芽诱导培养基中进行 。
17、培养， 对培养后墨兰假鳞茎发芽率的试验结果： 说 明 书 2/5 页 4 CN 106171987 A 4 0021 0022 由表1可以看出， 采用质量分数为0.2的氯化汞溶液能较好起到灭菌作用而又对 其活性影响较小， 并且采用分23次操作， 能更好的保护外植体活性， 使外植体的发芽率大 大增加。 最后用质量分数为4的次氯酸钠溶液中消毒57min， 能更好起到灭菌作用； 0023 (3)诱导培养： 将上述消毒后的墨兰假鳞茎， 接种在芽诱导培养基中进行培养， 所 述芽诱导培养基为： 1/2MS+0.40.8mg/L 6-BA+0.050.08mg/L NAA+2535g/L蔗糖+6 8g/L琼。
18、脂+13g/L蛋白胨+3040mg/L赤霉素， pH值为5.8； 培养条件： 培养温度2325， 光照时间为13h/d， 光照强度为13001500lx； 诱导培养的时间一般为3040天； 0024 表2为芽诱导培养基成分及其用量 0025 0026 表2中所述的MS基础培养基为现有技术， 这里不做详细阐述； 表2中所述的6-BA为 说 明 书 3/5 页 5 CN 106171987 A 5 6-苄氨基腺嘌呤， 又可以叫做细胞分裂素； 所述NAA为萘乙酸； 作为优选所述芽诱导培养基 为： 1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+2g/L蛋。
19、白胨+35mg/L赤霉 素， pH值为5.8， 即为表2中芽诱导培养基3的成分和用量； 0027 (4)增殖培养： 将诱导培养后的墨兰假鳞茎用无菌手术刀切成23cm茎段， 然后转 移至芽增殖培养基中， 所述芽增殖培养基为： 1/2MS+12mg/L6-BA+0.10.2mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+68g/L琼脂+36g/L蛋白胨+5060mg/L赤霉素， pH值为5.8； 培养条件： 培 养温度2325， 光照时间为13h/d， 光照强度为15001800lx， 增殖培养时间一般为40 50天； 0028 表3为芽增殖培养基成分及其用量 0029 0030 表3中所述的6-BA为6。
20、-苄氨基腺嘌呤， 又可以叫做细胞分裂素； 所述NAA为萘乙酸； 作为优选所述芽增殖培养基为： 1/2 MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼 脂+5g/L蛋白胨+55mg/L赤霉素， pH值为5.8， 即为表3中芽增殖培养基1的成分和用量； 0031 (5)生根培养： 将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株切下， 转移到 生根培养基中， 所述生根培养基为： 1/2MS+1.41.6mg/L 6-BA+0.050.08mg/L NAA+25 35g/L蔗糖+68g/L琼脂+13g/L蛋白胨， pH值为5.8； 培养条件： 培养温度2325， 。
21、光照 时间为13h/d， 光照强度为17002000lx， 生根培养的时间一般为2030天； 0032 表4为生根培养基成分及其用量 说 明 书 4/5 页 6 CN 106171987 A 6 0033 0034 表4中所述的6-BA为6-苄氨基腺嘌呤， 又可以叫做细胞分裂素； 所述NAA为萘乙酸； 作为优选所述生根培养基为： 1/2MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+ 2g/L蛋白胨， pH值为5.8， 即为表4中芽增殖培养基1的成分和用量； 0035 (6)移栽： 当生根培养试管苗生长至23cm高， 根24条， 叶12片时， 将试管苗放。
22、 在自然光下炼苗57天， 打开瓶盖炼苗12天； 然后取出培养苗， 用清水洗净附着在根部的 培养基， 清洗时注意不要损害根部， 然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中， 保持湿度和通风， 空气湿度为7585， 温度为2025； 通过本发明能使培养后的苗株成 苗率高， 栽培后适应性强， 苗株长势良好， 通过生物技术手段在短时间内， 满足了商业化生 产的需求， 为企业规模化、 产业化提供了技术支持。 0036 本发明并不限于上述实例， 在本发明的权利要求书所限定的范围内， 本领域技术 人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106171987 A 7 。