技术领域
本发明涉及微球制备技术领域，具体为一种能实现阿霉素和碳酸氢钠的缓释微球及其制备技术，以及在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
肝细胞癌（HCC）是世界范围内非常常见的恶性肿瘤，死亡率高。对于较小的肿瘤，手术切除和肝移植仍然是最有效的治疗方案；然而，大多数患者被诊断为晚期HCC或者患有潜在的慢性肝脏疾病，无法进行手术切除（Bruix J, Sherman M，Hepatology, 2011, 53(3):1020;El-Serag H B, New England Journal of Medicine, 2011, 365(12):1118-1127.）。此外，肝脏移植的器官供体短缺，并且移植费用高昂，也限制了肝脏移植的应用。全身性的化学治疗又有较大的毒副作用，且影响生活质量。而栓塞治疗对于人体的创伤较小，且操作简单易行，安全可靠，目前已经在临床上广泛应用。
栓塞治疗利用了影像学技术，实现了基于导管的动脉内治疗；其中，药物洗脱珠动脉化疗栓塞（DEB-TACE）近年来受到了大量关注。2007年，有学者对DEB-TACE在HCC患者上的安全性、药代动力学和疗效进行了评价；试验表明，患者对于DEB-TACE的耐受性良好（Varela M; Real MI; Burrel M; Forner A; Sala M; Brunet M; Ayuso C; Castells L; Montañá X; Llovet JM; Bruix J, Journal of Hepatology, 2007, 46(3):474-481.）。同样在2007年，有相关报道表明包载阿霉素的微球对于HCC患者具有较好的疗效，并且没有表现出明显的剂量依赖性毒性（Poon R T, Tso W K, Pang R W, et al, Clinical Gastroenterology & Hepatology the Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association, 2007, 5(9):1100.）。在2012年，有相关报道表明了DEB-TACE在将近300名早期和中期HCC患者中具有很好的疗效（Malagari K, Pomoni M, Moschouris H, et al, Cardiovascular & Interventional Radiology, 2012, 35(5):1119;Burrel M, Reig M, Forner A, et al, Journal of Hepatology, 2012, 56(6):1330-5.）。
HCC作为一种实体瘤，体内肿瘤的生长对葡萄糖具有很大的依赖性。葡萄糖缺乏情况下，肿瘤细胞将启动一系列的细胞信号通路途径，最终导致死亡。实体肿瘤由于血管发育不完善，很多区域处于葡萄糖缺乏的状态，但是肿瘤细胞却能很好地适应葡萄糖缺乏的环境。对此，有学者发现乳酸可以使肿瘤细胞抵抗葡萄糖缺乏导致的死亡。乳酸能使细胞处于休眠状态，降低了肿瘤细胞对葡萄糖的消耗。同时乳酸还抑制了葡萄糖缺乏所能激活的凋亡通路，并诱导细胞自噬，使得细胞能够存活更久。因此，乳酸在肿瘤部位大量存在，形成偏酸性的肿瘤微环境，有利于肿瘤的生长，转移和再生（Wu H, Ding Z, Hu D, et al, Journal of Pathology, 2012, 227(2):189; Peppicelli S, Toti A, Giannoni E, et al, Cell Cycle, 2016, 15(14):1908-1918.）。
在常规的栓塞治疗中，栓塞材料阻塞肿瘤动脉的同时，也会抑制乳酸从肿瘤中排除。乳酸对肿瘤细胞具有很强的保护作用，从而降低了栓塞治疗的疗效。有相关报道表明在进行栓塞治疗的同时，往肿瘤部位注射碳酸氢钠溶液中和乳酸，能降低肿瘤部位乳酸的浓度，提高栓塞治疗的疗效（Chao M, Wu H, Jin K, et al, Elife, 2016, 5.）。在此治疗方案中，碳酸氢钠是以注射液的形式给予，因此给予的碳酸氢钠注射液很快从肿瘤组织中流失，全身分布，难以长时间持肿瘤组织偏碱性的环境。
本发明采用油包油包固体（S/O/O）乳化溶剂挥发法制备阿霉素碳酸氢钠共载微球，能有效包载阿霉素和碳酸氢钠，并实现阿霉素和碳酸氢钠的缓释。阿霉素碳酸氢钠共载微球与肿瘤细胞共孵育之后，碳酸氢钠能从微球中释放并中和肿瘤微环境中的乳酸，与阿霉素的细胞毒性产生协同作用，表现出较强的抗肿瘤效果。
发明内容
本发明的目的提供一种能实现阿霉素和碳酸氢钠共载和缓释的微球，此微球能有效包载阿霉素和碳酸氢钠，并实现阿霉素和碳酸氢钠的缓释，表现出较强的抗肿瘤效果。
本发明的目的是通过以下方式实现：
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球的制备方法，包括碳酸氢钠、阿霉素和微球壁材, 微球壁材为乙基纤维素、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的其中一种，所述的步骤如下：
1）将阿霉素溶解于氯仿中，制得阿霉素氯仿溶液；
2）将碳酸氢钠溶解于水中，制得碳酸氢钠水溶液；
3）将微球壁材和吐温80分散于乙腈或丙酮中，充分溶解，制得微球壁材溶液；
4）将阿霉素氯仿溶液注入到快速搅拌的微球壁材溶液中，继续搅拌1min后，在快速搅拌的同时注入碳酸氢钠水溶液，制得阿霉素碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相；
5）以含有司班80的大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的步骤4制得的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至乙腈或丙酮挥发完全；
6）对步骤5的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤三次，再自然干燥，收集固体得到阿霉素碳酸氢钠共载微球；
7）将收集到的阿霉素碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为81.6-82.8%。
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球的制备方法，包括阿霉素和微球壁材, 微球壁材为乙基纤维素、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的其中一种，所述的步骤如下：
1）将阿霉素溶解于氯仿中，制得阿霉素氯仿溶液；
2）将微球壁材和吐温80分散于乙腈或丙酮中，充分溶解，制得微球壁材溶液；
3）将阿霉素氯仿溶液注入到快速搅拌的微球壁材溶液中，制得阿霉素纳米混悬液，即内油相；
4）以含有司班80的大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的步骤4制得的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至乙腈或丙酮挥发完全；
5）对步骤4的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤三次，再自然干燥，收集固体得到阿霉素碳酸氢钠共载微球；
6）将收集到的阿霉素碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为81.6-82.8%。
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球的制备方法，包括碳酸氢钠、微球壁材, 微球壁材为乙基纤维素、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的其中一种，所述的步骤如下：
1）将碳酸氢钠溶解于水中，制得碳酸氢钠水溶液；
2）将微球壁材和吐温80分散于乙腈或丙酮中，充分溶解，制得微球壁材溶液；
3）将碳酸氢钠水溶液注入到快速搅拌的微球壁材溶液中，制得碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相；
4）以含有司班80的大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的步骤4制得的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至乙腈或丙酮挥发完全；
5）对步骤4的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤三次，再自然干燥，收集固体得到阿霉素碳酸氢钠共载微球；
6）将收集到的阿霉素碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为81.6-82.8%。
作为优选方案，称取阿霉素碳酸氢钠共载微球，加三氯甲烷破坏，使包载的阿霉素游离，用荧光分光光度法测得微球中阿霉素负载量为0.5-0.6%。
作为优选方案，称取阿霉素碳酸氢钠共载微球，加二氯甲烷破坏，使包载的碳酸氢钠游离，然后用去离子水萃取碳酸氢钠，用酸碱滴定法测得微球中碳酸氢钠负载量为3.87-4.67%。
本发明的有益效果是：提供阿霉素碳酸氢钠共载微球的制备方法，并在肿瘤治疗中的应用，阿霉素碳酸氢钠共载微球可实现阿霉素和碳酸氢钠的缓释，阿霉素碳酸氢钠共载微球与肿瘤细胞共孵育之后，碳酸氢钠能从微球中释放并中和肿瘤微环境中的乳酸，与阿霉素的细胞毒性产生协同作用，显著提高肿瘤细胞的抑制率。
附图说明：
图1为微球中碳酸氢钠的体外释放情况的曲线图；
图2为微球中阿霉素的体外释放情况的曲线图；
图3为微球的体外抗肿瘤效果的比对图。
具体实施方式
本发明用以下实施例予以解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例1
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球制备方法，包括碳酸氢钠160mg、阿霉素40mg和微球壁材，微球壁材为乙基纤维素1000mg。
阿霉素碳酸氢钠共载微球的制备方法如下：
步骤1将40mg阿霉素溶解于2ml氯仿中，制得阿霉素氯仿溶液;
步骤2将160mg碳酸氢钠溶解于2ml水中，制得碳酸氢钠水溶液;
步骤3将1000mg乙基纤维素和200mg吐温80分散于20ml乙腈中，充分溶解，制得乙基纤维素乙腈溶液;
步骤4将阿霉素氯仿溶液注入到快速搅拌的乙基纤维素乙腈溶液中，继续搅拌1min后，保持快速搅拌并注入碳酸氢钠水溶液，制得阿霉素碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相。
步骤5以含有6g司班80的180ml大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至20ml乙腈挥发完全。
对步骤5的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤3遍，自然干燥，收集固体得到阿霉素碳酸氢钠共载微球。
将步骤6收集到的阿霉素碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为81.6%。
称取50mg阿霉素碳酸氢钠共载微球，加二氯甲烷破坏，使包载的碳酸氢钠游离，然后用去离子水萃取碳酸氢钠，用酸碱滴定法测得微球中碳酸氢钠负载量为4.67%。
称取50mg阿霉素碳酸氢钠共载微球，加三氯甲烷破坏，使包载的阿霉素游离，用荧光分光光度法测得微球中阿霉素负载量为0.6%。
通过激光粒度分析仪测得微球的数均粒径为252μm。
实施例2
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球的制备方法，包括阿霉素40mg和微球壁材，微球壁材为乙基纤维素1000mg。
阿霉素碳酸氢钠共载微球的制备方法如下：
步骤1将40mg阿霉素溶解于2ml氯仿中，制得阿霉素氯仿溶液;
步骤3将1000mg乙基纤维素和200mg吐温80分散于20ml乙腈中，充分溶解，制得乙基纤维素乙腈溶液;
步骤4将阿霉素氯仿溶液注入到快速搅拌的乙基纤维素乙腈溶液中，制得阿霉素碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相。
步骤5以含有6g司班80的180ml大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至乙腈挥发完全。
对步骤5的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤3遍，自然干燥，收集固体得到阿霉素共载微球。
将步骤6收集到的阿霉素共载微球称重，测得回收率为82.1%。
称取50mg阿霉素共载微球，加三氯甲烷破坏，使包载的阿霉素游离，用荧光分光光度法测得微球中阿霉素负载量为0.6%。
通过激光粒度分析仪测得微球的数均粒径为230μm。
实施例3
一种碳酸氢钠共载微球的制备方法，包括碳酸氢钠160mg和微球壁材，微球壁材为乙基纤维素1000mg。
碳酸氢钠共载微球的制备方法如下：
1）将160mg碳酸氢钠溶解于2ml水中，制得碳酸氢钠水溶液；
2）将1000mg乙基纤维素和200mg吐温80分散于20ml乙腈中，充分溶解，制得微球壁材溶液；
3）将碳酸氢钠水溶液注入到快速搅拌的微球壁材溶液中，制得碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相；
4）以含有6g司班80的180ml大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的步骤4制得的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至20ml乙腈挥发完全；
5）对步骤4的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤三次，再自然干燥，收集固体得到碳酸氢钠共载微球。
6）将收集到的碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为82.8%。
称取50mg碳酸氢钠共载微球，加二氯甲烷破坏，使包载的碳酸氢钠游离，然后用去离子水萃取碳酸氢钠，用酸碱滴定法测得微球中碳酸氢钠负载量为4.67%。
通过激光粒度分析仪测得微球的数均粒径为344μm。
实施例4
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球制备方法，包括碳酸氢钠160mg、阿霉素40mg和微球壁材，微球壁材为聚乳酸1000mg。
阿霉素碳酸氢钠共载微球的制备方法如下：
步骤1将40mg阿霉素溶解于2ml氯仿中，制得阿霉素氯仿溶液;
步骤2将160mg碳酸氢钠溶解于2ml水中，制得碳酸氢钠水溶液;
步骤3将1000mg聚乳酸和200mg吐温80分散于20ml丙酮中，充分溶解，制得聚乳酸丙酮溶液;
步骤4将阿霉素氯仿溶液注入到快速搅拌的聚乳酸丙酮溶液中，继续搅拌1min后，保持快速搅拌并注入碳酸氢钠水溶液，制得阿霉素碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相。
步骤5以含有6g司班80的180ml大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至20ml丙酮挥发完全。
对步骤5的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤3遍，自然干燥，收集固体得到阿霉素碳酸氢钠共载微球。
将步骤6收集到的阿霉素碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为82.5%。
称取50mg阿霉素碳酸氢钠共载微球，加二氯甲烷破坏，使包载的碳酸氢钠游离，然后用去离子水萃取碳酸氢钠，用酸碱滴定法测得微球中碳酸氢钠负载量为3.58%。
称取50mg阿霉素碳酸氢钠共载微球，加三氯甲烷破坏，使包载的阿霉素游离，用荧光分光光度法测得微球中阿霉素负载量为0.5%。
通过激光粒度分析仪测得微球的数均粒径为263μm。
实施例5
一种阿霉素及碳酸氢钠共载微球制备方法，包括碳酸氢钠160mg、阿霉素40mg和微球壁材，微球壁材为聚乳酸-羟基乙酸1000mg。
阿霉素碳酸氢钠共载微球的制备方法如下：
步骤1将40mg阿霉素溶解于2ml氯仿中，制得阿霉素氯仿溶液;
步骤2将160mg碳酸氢钠溶解于2ml水中，制得碳酸氢钠水溶液;
步骤3将1000mg聚乳酸和200mg吐温80分散于20ml丙酮中，充分溶解，制得聚乳酸丙酮溶液;
步骤4将阿霉素氯仿溶液注入到快速搅拌的聚乳酸丙酮溶液中，继续搅拌1min后，保持快速搅拌并注入碳酸氢钠水溶液，制得阿霉素碳酸氢钠纳米混悬液，即内油相。
步骤5以含有6g司班80的180ml大豆油为外油相，在25℃将内油相加入到不停搅拌的外油相中，制得S/O/O乳剂，继续搅拌至20ml丙酮挥发完全。
对步骤5的溶液离心去上清液，得到的固体用正己烷洗涤3遍，自然干燥，收集固体得到阿霉素碳酸氢钠共载微球。
将步骤6收集到的阿霉素碳酸氢钠共载微球称重，测得回收率为82.1%。
称取50mg阿霉素碳酸氢钠共载微球，加二氯甲烷破坏，使包载的碳酸氢钠游离，然后用去离子水萃取碳酸氢钠，用酸碱滴定法测得微球中碳酸氢钠负载量为3.87%。
称取50mg阿霉素碳酸氢钠共载微球，加三氯甲烷破坏，使包载的阿霉素游离，用荧光分光光度法测得微球中阿霉素负载量为0.5%。
通过激光粒度分析仪测得微球的数均粒径为279μm。
微球中碳酸氢钠缓释效果评价
精密称取实施例1所制得的阿霉素碳酸氢钠共载微球和实施例3所制得的碳酸氢钠微球各80mg，置于含有4mL去离子水的释放管中，37℃，100rpm恒温振荡。在预设的时间点取样，每次取1mL上清液并加入1mL新鲜释放介质。用酸碱滴定法测定样品中的碳酸氢钠含量，测得微球中碳酸氢钠的体外释放情况（图1）。由微球中碳酸氢钠的体外释放情况可知，通过微球包载后，碳酸氢钠能缓慢从微球中释放，并且持续释放达到72h。因此，微球能有效延缓碳酸氢钠的释放。
微球中阿霉素缓释效果评价
精密称取实施例1所制得的阿霉素碳酸氢钠共载微球和实施例2所制得的阿霉素微球各10mg，置于含有20mL释放介质（PBS）的释放管中，37℃，100rpm恒温振荡。在预设的时间点取样，每次取1mL上清液并加入1mL新鲜释放介质。用荧光分光光度法测定样品中的阿霉素浓度，测得微球中阿霉素的体外释放情况（图2）。由微球中阿霉素的体外释放情况可知，通过微球包载后，阿霉素能缓慢从微球中释放，并且持续释放达到28天。因此，微球能有效延缓阿霉素的释放。
微球的体外抗肿瘤效果评价
在实施1的制备后，取对数生长期的VX2和Bel-7402细胞，以5×104个/mL的细胞密度接种于12孔Transwell细胞板，每孔1mL。培养24h后，在Transwell小室中分别加入30mg的实施例3所制得的碳酸氢钠微球、实施例2所制得的阿霉素微球和实施例1所制得的阿霉素碳酸氢钠共载微球，每个小室补充0.5mL含有10%（v/v）胎牛血清的DMEM高糖培养液，未加微球的细胞作为空白对照，每孔设置3个平行组。微球和细胞共孵育48h之后，每孔加入200μL的5mg/mL的MTT，孵育4h，弃上清液，每孔加入1mL的DMSO以溶解紫色的沉淀物甲瓒，96rpm恒温水平振荡30 min，然后每孔移出200μL液体至96孔板，用酶联检测仪在570 nm处测定吸光值A。
细胞存活率(%)= (AT/AC )×100%
式中AT为实验组570 nm处的吸光值，AC为空白对照组570 nm处的吸光值。根据吸光度值计算各实验组细胞存活率。由微球的体外抗肿瘤效果可知，碳酸氢钠微球，阿霉素微球和阿霉素碳酸氢钠共载微球在体外都能杀伤肿瘤细胞，且阿霉素碳酸氢钠共载微球的细胞毒性最强。