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1、(10)申请公布号 CN 102578039 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102578039 A *CN102578039A* (21)申请号 201110001490.3 (22)申请日 2011.01.06 A01K 67/027(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院医药生物技术研究 所 地址 100050 北京市宣武区南纬路 2 号医药 生物技术研究所 (72)发明人 张靖溥 丁存宝 蒋建东 赵晔 (54) 发明名称 人 HCV 基因的斑马鱼肝脏复制模型 (57) 摘要 本。
2、发明涉及人 HCV 基因的斑马鱼肝脏复制模 型， 具体涉及利用基因重组和分子生物学方法获 得的两种斑马鱼 HCV 亚复制子模型 ： 斑马鱼正向 HCV 亚复制子模型和斑马鱼反式 HCV 亚复制子模 型。 可用以研究HCV基因组复制的分子机制， 评估 药效和研究治疗策略等。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 2 页 1/1 页 2 1. 一种斑马鱼正向 HCV 亚复制子模型， 其特征在于利用小鼠肝核因子基因 HNF4a 启动 子调控下游基因表达， 顺序连接HCV 5UTR-core、。
3、 脑心肌炎病毒内核糖体进入位点IRES、 报告基因 EGFP 和 HCV IRES-NS5B-3 UTR 基因序列， 构建了 HCV 亚复制子基因表达构件 pHHIGI5B ； 将此构件显微注射斑马鱼受精卵， 经 HNF4a 启动子转录产生 mRNA， 由于此构件含 有HCV的5UTR、 core、 NS5B和3UTR， 具备了HCV病毒的亚复制子结构， 因此， 此mRNA可 做为复制模版， 在 HCV RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (NS5B) 的作用下， 产生负链的亚复制子 RNA。 荧光显微镜下可观察到 EGFP 荧光在肝脏区域的表达。 2. 一种斑马鱼反向 HCV 亚复制子模型， 其。
4、特征在于通过向斑马鱼受精卵共注射 两 种 HCV 基 因 表 达 质 粒 而 组 成， pIresDsRed-5B 可 在 CMV promoter 指 导 下 分 别 表 达 HCV RNApolymerase(NS5B) 蛋 白 和 红 色 荧 光 蛋 白 ； pRVIresCore-GFP-3N 构 件 可 在 CMV promoter 指导下分别产生反义的 HCV 5 UTR-core 和 IRES-EGFP 转录产物 (antisense-transcripts)， 以及正链 HCV 3 UTR。当由 pIresDsRed-5B 产生 NS5B(HCV RNA-dependant R。
5、NA polymerase) 时， 由 pRVIresCore-GFP-3N 转录的反义 RNA 就能够作为 复制模版， 在 RNA 依赖的 RNA 聚合酶作用下复制产生互补的 mRNA， 并被翻译成 EGFP 和 core 蛋白。荧光显微镜下可在同一条斑马鱼幼体肝脏区观察到绿色荧光和红色荧光， 直观地证 明该亚复制子复制过程的存在。 3. 用 HCV 阳性药物利巴韦林 (ribavirin)、 候选药物苦参素 (Oxymatrine) 及其类似物 DM-122对斑马鱼亚复制子模型进行验证。 反式亚复制子模型中， 加入利巴韦林后core的正 义 RNA 明显降低， 并呈剂量依赖性， 而反义 R。
6、NA 则无明显变化， 说明利巴韦林主要抑制 core 的正义 RNA 产生， 即抑制复制的过程。苦参素和 DM-122 也都呈剂量依赖性抑制 core 的正 义 RNA 产生， 对 core 的反义 RNA 无明显抑制作用。顺式亚复制子模型也得到类似的结果。 这些结果初步说明斑马鱼 HCV 亚复制子模型可以用于抗 HCV 药物筛选。同时也证明苦参素 及其类似物对于 HCV 的复制具有抑制作用。 权 利 要 求 书 CN 102578039 A 2 1/2 页 3 人 HCV 基因的斑马鱼肝脏复制模型 发明领域 0001 本发明涉及人 HCV 基因的斑马鱼肝脏复制模型， 具体的， 涉及利用基因重。
7、组和分 子生物学方法获得的两种斑马鱼 HCV 亚复制子模型 ： 斑马鱼正向 HCV 亚复制子模型和斑马 鱼反式 HCV 亚复制子模型。 0002 发明背景 0003 丙型肝炎病毒 (HCV) 是一种具包膜的正链单股 RNA 病毒。持续性 HCV 感染是发展 成肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。 当前在丙型肝炎的预防和治疗中存在的问题是 ： HCV疫 苗研究尚未获得突破进展 ； 耐药问题严重， 急需新型的抗 HCV 药物。而 HCV 研究主要障碍是 缺乏合适的细胞模型及小动物模型。这极大的限制了 HCV 新药的研究及丙型肝炎的防治工 作。 0004 HCV core 蛋白作为结构蛋白在病毒的致病。
8、性方面具有重要作用 ； HCV 非结构蛋白 (NS)， 则更多在病毒的复制、 多蛋白产物的切割、 HCV 与宿主细胞间相互作用等过程中发挥 重要作用， 因此研究 HCV 非结构蛋白的作用机制， 利用这些蛋白作为靶点筛选新药具有重 要的理论意义和实用价值。 斑马鱼属脊椎动物， 其生长发育过程、 组织系统结构与人有很高 的相似性， 两者在基因和蛋白质的结构和功能上也表现很高的保守性， 因此斑马鱼是研究 人类疾病发生机理的优良模式动物。 斑马鱼具有个体小、 养殖成本低的优点， 是高通量药物 筛选的惟一脊椎动物模型。利用突变体或转基因鱼， 甚至野生型斑马鱼均可较方便地进行 小分子化合物的筛选， 筛选出。
9、的化合物可用做进一步的临床测试。 因此， 我们尝试利用斑马 鱼建立 HCV 复制模型。 发明内容 0005 本发明的一个方面， 涉及斑马鱼正向 HCV 亚复制子模型。利用小鼠肝核因子基因 HNF4a启动子调控下游基因表达， 顺序连接HCV 5UTR-core、 脑心肌炎病毒内核糖体进入 位点 IRES、 报告基因 EGFP 和 HCV IRES-NS5B-3 UTR 基因序列， 构建了 HCV 亚复制子基因 表达构件 pHHIGI 5B。将此构件显微注射斑马鱼受精卵， 经 HNF4a 启动子转录产生 mRNA， 由 于此构件含有 HCV 的 5 UTR、 core、 NS5B 和 3 UTR，。
10、 具备了 HCV 病毒的亚复制子结构， 因 此， 此 mRNA 可做为复制模版， 在 HCV RNA 依赖的 RNA 聚合酶 (NS5B) 的作用下， 产生负链的 亚复制子 RNA。荧光显微镜下可观察到 EGFP 荧光在肝脏区域的表达。western-blot 可检 测到 21kD core 蛋白带和 NS5B 蛋白带。RT-PCR 可检测出亚复制子负链 RNA 的存在， 说明注 射该基因构件的斑马鱼体内存在 HCV 亚复制子的复制过程。原位杂交实验也进一步证实斑 马鱼幼体肝区存在亚复制子负链 RNA。综上， 斑马鱼正向 HCV 亚复制子模型是成功的。 0006 本发明的另一方面， 涉及斑马鱼。
11、反式 HCV 亚复制子模型。该模型通过向斑马鱼 受精卵共注射两种 HCV 基因表达质粒而组成， pIresDsRed-5B 可在 CMV promoter 指导下 分别表达 HCV RNA polymerase(NS5B) 蛋白和红色荧光蛋白 ； pRVIresCore-GFP-3N 构件 可在 CMV promoter 指导下分别产生反义的 HCV 5 UTR-core 和 IRES-EGFP 转录产物 (antisense-transcripts)， 以及正链 HCV 3 UTR。当由 pIresDsRed-5B 产生 NS5B(HCV 说 明 书 CN 102578039 A 3 2/2。
12、 页 4 RNA-dependant RNA polymerase) 时， 由 pRVIresCore-GFP-3N 转录的反义 RNA 就能够作 为复制模版， 在 RNA 依赖的 RNA 聚合酶作用下复制产生互补的 mRNA， 并被翻译成 EGFP 和 core 蛋白。结果显示， 在荧光显微镜下可以在同一条斑马鱼幼体肝区观察到绿色荧光和 红色荧光， 可直观地证明该业复制子复制过程的存在。RT-PCR 验证了复制产物正链 HCV5 UTR-core-IRES-EGFP-HCV 3 UTR 的存在。Western blot 结果进一步证实了 core 和 NS5B 蛋白 ( 来自复制产生的 mR。
13、NA) 在共注射斑马鱼体内的表达。此外， 利用原位杂交技 术， EGFP 和 core 的正义和反义 RNA 探针均在斑马鱼幼体肝区检测到阳性信号 ； NS5B 的反 义探针也检测到阳性信号， 并且信号主要集中在斑马鱼的肝脏区域。而对照组 ( 只注射了 pRVIresCore-GFP-3N 基因构件 ) 由于缺少 HCV RNA polymerase， 由 CMV promoter 转录出 的反义的 RNA 不能被 “复制” 产生互补的 mRNA， 也未产生 HCVCore 和 GFP 蛋白。综上所述， 所构建的 HCV 反式亚复制子斑马鱼模型同样是成功的。 0007 我们利用 RT-PCR 。
14、检测了两种亚复制子注射的斑马鱼幼体中 HCV 感染容易引起肝 脏病变的一些基因 markers 的表达变化， 乙酰辅酶 A 羧化酶 (Acc)、 类肝素酶 (heparanase) 在注射的斑马鱼幼体的表达水平明显升高， 表明已开始发生肝细胞脂肪变性。提示 HCV 亚 复制子导入斑马鱼肝脏后， 不仅具有复制功能， 还可导致肝脏发生类似人体和哺乳类动物 模型的 HCV 病变。这些结果表明， 这两种斑马鱼 HCV 复制模型是成功的。用 HCV 阳性药物 利巴韦林 (ribayirin)、 候选药物苦参素 (Oxymatrine) 及其类似物 DM-122 对斑马鱼亚复 制子模型进行验证。反式亚复制。
15、子模型中， 加入利巴韦林后 core 的正义 RNA 明显降低， 并 呈剂量依赖性， 而反义 RNA 则无明显变化， 说明利巴韦林主要抑制 core 的正义 RNA 产生， 即 抑制复制的过程。苦参素和 DM-122 也都呈剂量依赖性抑制 core 的正义 RNA 产生， 对 core 的反义 RNA 无明显抑制作用。顺式亚复制子模型也得到类似的结果。这些结果初步说明斑 马鱼 HCV 亚复制子模型可以用于抗 HCV 药物筛选。同时也证明苦参素及其类似物对于 HCV 的复制具有抑制作用。利用斑马鱼 HCV 复制子模型作为研究平台， 可用以研究 HCV 基因组 复制的分子机制， 评估药效和研究治疗策略等。同时这些结果也为利用斑马鱼作为 HCV 研 究的动物模型增强了信心。 说 明 书 CN 102578039 A 4 。