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1、(10)申请公布号 CN 102665421 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102665421 A *CN102665421A* (21)申请号 201080024157.8 (22)申请日 2010.03.30 61/164,856 2009.03.30 US A01N 55/02(2006.01) A61K 31/555(2006.01) (71)申请人 尼基制药公司 地址 美国新泽西州 (72)发明人 胡适满谢希巴拉德朗 (74)专利代理机构 北京万慧达知识产权代理有 限公司 11111 代理人 杨颖 张一军 (54) 发明名称 治疗骨质疏松的方法 (57) 摘要 。
2、公开了一种治疗骨质疏松症的方法和相关方 法。这些方法通常包括给予需治疗患者有效剂量 的三 (8- 喹啉 ) 合镓 (III) 或其类似物。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2011.11.30 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2010/029285 2010.03.30 (87)PCT申请的公布数据 WO2010/114861 EN 2010.10.07 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 通式。
3、 (I) 表示的化合物或者它的药学上可接受的盐在制备用于减少患者破骨细胞 骨吸收的药物中的应用， 其中 R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。 2. 通式 (I) 表示的化合物或者它的药学上可接受的盐在制备用于治疗或者预防骨质 疏松症的药物中的应用， 其中 R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。 3. 权利要求 2 中的应用， 其中所述药物用于治疗或者预防绝经后女性骨质疏松症 (PMO)。 4. 权利要求 2-3 中任何。
4、一个应用， 其中所述药物用于骨质疏松症患者中减少骨相关事 件诸如骨折的风险或发生率、 减少骨质流失、 或者增加骨含量。 5. 权利要求 2-4 任何一个应用， 其中所述药物用于治疗或预防男女性患者糖皮质激素 性骨质疏松症 (GIO)。 6. 权利要求 1 或 2 的应用， 其中所述药物用于因前列腺癌或乳腺癌而接受激素剥夺疗 法的癌症患者治疗或预防或减少骨质疏松、 低骨质密度、 骨质流失或骨相关事件比如骨折 的风险。 7.权利要求1或2的应用， 其中所述药物用于治疗或延缓与牙周病、 骨折或假体周围骨 溶解相关的局部性骨质流失。 8. 通式 (I) 表示的化合物或者它的药学上可接受的盐在制备用于治。
5、疗或预防佩吉特 病的药物中的应用， 权 利 要 求 书 CN 102665421 A 2 2/2 页 3 其中 R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。 9. 通式 (I) 表示的化合物或者它的药学上可接受的盐在制备用于预防或者延缓癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤或多发性骨髓瘤 ) 骨转移的发生的药物中的应用， 其中 R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。 10. 通式 (I) 表示的化合物或者它的药。
6、学上可接受的盐在制备用于治疗或预防或减少 与癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤， 多发性骨髓瘤或神经内分泌瘤 ) 相关的低 骨质密度、 骨质流失、 骨质疏松或骨相关事件 ( 如骨折 ) 的风险的药物中的应用， 其中 R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。 11. 通式 (I) 表示的化合物或者它的药学上可接受的盐在制备用于治疗骨转移癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤或多发性骨髓瘤 ) 的药物中的应用， 其中 R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金。
7、属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。 12. 权利要求 1-11 中任何一个应用， 其中所述化合物是三 (8- 羟基喹啉 ) 合镓 (III)。 权 利 要 求 书 CN 102665421 A 3 1/7 页 4 治疗骨质疏松的方法 0001 相关专利申请 0002 本申请案主张 2009 年 3 月 30 日提交的美国临时专利申请案第 61/164,856 号之 权益及优先权， 该申请案之整体揭示内容全文包括附图以引用的方式并入本文中。 技术领域 0003 本发明一般涉及疾病治疗的方法， 特别是一种治疗骨质疏松症和相关疾病的方 法。 背景技术 0004 骨质疏。
8、松症是一种困扰全世界数百万人的主要的健康问题。 它在绝经后的女性中 最为普遍， 但也存在于很大一部分 50 岁以上的男性人群中。在糖皮质激素治疗的患者和由 于前列腺或者乳腺癌而经过激素剥夺疗法的患者中， 骨质流失和骨质疏松症特别严重。在 骨质疏松患者中， 骨矿密度(BMD)和骨矿含量(BMC)的减少导致骨脆性和骨折风险的增加。 骨质疏松症可能严重影响了预期寿命和生活质量。 0005 直到被发现与高癌症发生率相关之前， 雌激素补偿疗法在很长一段时间里是主要 的预防绝经后女性骨质疏松症的方法。 例见， Prentice et al.， Am.J.Epidemiol.， 170(1) ： 12-23。
9、(2009). 二磷酸盐在 20 世纪 90 年代中期首先被开发出来， 而且成为主要的骨质疏 松症医药治疗方法。但是， 口服二磷酸盐不易吸收而且经常与食管炎症相关。最近， 作用 于 RANKL 的抗体比如 denosumab 在减少骨吸收上表现出作为有效替代者的前景。例见， McClung et al.， N.Engl.J.Med.， 354(8) ： 821-31(2006). 发明摘要 0006 已经惊人地发现三(8-喹啉)合镓(III)(tris(8-quinolinolato)gallium(III)， 三 (8- 羟基喹啉 ) 合镓 (III) 对抑制破骨细胞骨吸收， 减少骨质流失和。
10、治疗骨质疏松症非 常有效。因此， 第一方面， 本发明提供了一种减少患者中破骨细胞骨吸收的方法， 包括给予 需治疗的患者以足够抑制破骨细胞骨吸收的剂量的一种通式 (I) 表示的化合物或者此化 合物的一种药学上可接受的盐 ( 例如三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)。 0007 第二方面， 提供了一种治疗骨质疏松症的方法包括给需治疗的患者摄入有效治 疗剂量的一种通式 (I) 表示的化合物或者此化合物的一种药学上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato)gallium(III)。在一种实施方案中， 这种方法被用来治疗或预防 女性绝经后骨质疏松症 (PMO)。在另外一种实。
11、施方案中， 此方法被用来治疗、 预防或者减少 由于前列腺癌或者乳腺癌而经过激素剥夺疗法(hormone-deprivation therapy)的患者的 骨质流失或骨相关事件(比如骨折)的风险或发生率。 在另一种实施方案中， 此方法被用来 对开始或持续进行系统的糖皮质激素治疗的男性和女性中糖皮质激素性骨质疏松症 (GIO) 的预防和治疗。 0008 另一方面， 本发明提供了一种通过给需治疗的患者摄入有效治疗剂量的一种通式 说 明 书 CN 102665421 A 4 2/7 页 5 (I) 表示的化合物或者此化合物的一种药学上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato) 。
12、gallium(III) 来治疗佩吉特 (Paget s) 病的方法。 0009 此外， 本发明也提供了一种预防， 或延迟癌症的骨转移发作的方法， 包括给经确 定或诊断患有癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤或者多发性骨髓瘤 (multiple myeloma) 但没有骨转移的患者摄入有效治疗剂量的一种通式 (I) 表示的化合物或者此化 合物的一种药学上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato)gallium(III)， 从而预防， 或延迟癌症骨转移的发作。 0010 本发明进一步提供了一种治疗， 预防或减少患有骨转移癌症的患者的骨质流失或 骨相关事件。
13、 ( 比如骨折 ) 的风险和发生率的方法， 包括诊断患者患有已经转移到骨骼的癌 症， 并且给患者摄入有效治疗剂量的一种通式 (I) 表示的化合物或者此化合物的一种药学 上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato)gallium(III)。 0011 另一方面， 本发明提供了一种通过给需治疗的患者摄入有效治疗剂量的一种通式 (I) 表示的化合物或者此化合物的一种药学上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato) gallium(III) 来治疗、 预防或减少患有神经内分泌瘤患者的骨质流失或骨相关事件 ( 比 如骨折 ) 的风险和发生率的方法。 001。
14、2 本发明进一步提供了治疗骨转移癌的方法， 包括诊断患者患有已经转移到骨骼的 癌症， 并且给患者摄入有效治疗剂量的一种通式 (I) 表示的化合物或者此化合物的一种药 学上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato)gallium(III)。 0013 另一方面， 本发明提供了具有下面分子式 (I) 的化合物或者此化合物的一种药学 上可接受的盐 ( 例如， tris(8-quinolinolato)gallium(III) 的一种用途， 用于制备一种 药物， 这种药物可以减少破骨细胞骨吸收、 以及治疗、 预防或延迟骨质疏松症的发作， 治疗 或预防或延迟佩吉特病 (Paget。
15、 s) 发作， 或者治疗、 预防、 或延迟癌症骨转移， 或者治疗已 经骨转移的癌症。 0014 本发明的以上所述及其它优点和特征以及实现这些特征和优势的方式， 在考虑下 面有关本发明的详细描述以及所附的表现优选范例性实施方案的例子之后将会更加明了。 0015 附图概述 0016 图 1 是一个曲线图， 显示用三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 处理能抑制破骨细胞的分 化。 0017 图 2 显示三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)(“药物” ) 显著抑制组织蛋白酶 K， NFAT2 和 TRAP 基因表达。 0018 图 3 是一个柱状图， 显示相比于未服用的卵巢切除小鼠， 给切。
16、除卵巢的小鼠每日 服用三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)(“每日服药” ) 表现出与增高的骨矿密度相关。 0019 图 4 是一个柱状图， 显示相比于不进行药物治疗的卵巢切除小鼠， 对卵巢切除小 鼠每日的三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 治疗 (“每日服药” ) 与血清骨钙素的减少显著相关。 0020 发明详述 0021 本发明在部分程度上是基于这一发现 ： tris(8-quinolinolato)gallium(III) ( 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 化合物对抑制破骨细胞的成熟或形成， 减少骨吸收， 预防骨 质流失， 从而维持或增加哺乳动物的骨矿密度。 。
17、0022 因此， 一方面， 本发明提供了一种在患者中减少破骨细胞骨吸收的方法， 包括用足 说 明 书 CN 102665421 A 5 3/7 页 6 以抑制破骨细胞骨吸收的剂量的通式 (I) 表示的一种镓络合物或者它的一种药学上可接 受的盐来对需要治疗的患者进行治疗 ： 0023 0024 其中R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基SO3M， M是一种金属离子， 并且R2代表氢， 或 者R1是Cl且R2是I。 这种方法导致破骨细胞骨吸收的减少和相关症状的缓解， 比如骨相关 事件 ( 例如， 骨质流失和 / 或骨矿密度的减少 )。换言之， 本发明提供有效剂量的通式 (I) 表示的化合物或者它的药学。
18、上可接受盐的在制备一种药物中的应用， 其药物用于在哺乳动 物包括人类中减少破骨细胞骨吸收、 预防或减缓骨质流失、 预防或减缓骨矿密度的降低、 或 者预防或减少骨相关事件 ( 例如， 骨折、 骨质流失， 等等 ) 的发生。 0025 在首选实施方案中， 镓络合物为 tris(8-quinolinolato) gallium(III)或它的一种药用可接受的盐。 0026 另外一方面， 本发明提供了一种治疗、 预防骨质疏松症或者延迟骨质疏松症发生 的方法， 其中包括用有效治疗剂量的通式 (I) 表示的镓络合物或者它的一种药学上可接受 的盐来对患者治疗、 预防或延缓发作 ： 0027 0028 其中 。
19、R1代表氢， 一种卤族元素或磺酸基 SO3M， M 是一种金属离子， 并且 R2代表氢， 或者 R1是 Cl 且 R2是 I。换言之， 本发明提供有效剂量的通式 (I) 表示的化合物或者它的 药学上可接受盐的在制备一种药物中的应用， 其药物用于治疗、 预防骨质疏松症或延缓骨 质疏松症的发生。 0029 在首选实施方案中， 镓络合物为三(8-羟基喹啉)合镓(III)或它的一 种药学上可接受盐。 0030 因此， 本发明提供了一种治疗骨质疏松症或骨质缺失的方法， 包括用有效治疗剂 量的三 (8- 羟基喹啉 ) 合镓 (III) 来治疗需治患者。本发明也提供了一种在需此类治疗的 说 明 书 CN 1。
20、02665421 A 6 4/7 页 7 患者中(比如， 存在发生骨质疏松症的倾向或增高的骨质疏松风险)减缓骨矿密度降低， 延 缓骨质疏松症或者增加骨矿密度的方法， 包括用足以减缓骨矿密度的降低、 增加骨矿密度、 增加骨质含量、 或者延迟骨质疏松症的发生的剂量的三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 来治疗患 者。 0031 骨质疏松症一般是以全身性的骨质流失或低骨矿密度为特征的。 本发明的方法对 治疗或延迟任何全身性的骨质流失或低骨矿密度的发生， 包括但不限于骨质疏松症， 比如 绝经后骨质疏松症， 类固醇或糖皮质激素性骨质疏松症， 关龄骨质疏松症， 风湿关节炎或癌 症诱发的骨质疏松症， 。
21、骨质软化， 特发性骨质疏松， 或者佩吉特病。 0032 在本发明各种方法的各种实施方案中， 可有选择性地包括诊断出一个需治疗或预 防的患者。例如， 患有骨质疏松症或骨质缺乏或低骨矿密度的患者可以用该技术领域内的 任何诊断方法或标准得到诊断， 比如通过使用如双能X射线吸收测量法(DXA或DEXA)， 血清 标记物， X 射线等等来测定骨矿密度 (BMD)。 0033 而且， 对于有发生骨质疏松症或者全身或局部的骨质流失风险的患者的诊断方法 在这个技术领域内是众所周知的。例如， 存在与骨质流失和发生骨质疏松症的增高可能性 显著相关的风险因素的患者都可以鉴定出来。已知的骨质疏松症风险因素包括但不仅限。
22、 于， 绝经后， 类固醇或糖皮质激素的使用， 年龄特别是在女性中， 疾病比如风湿性关节炎、 骨 软化和佩吉特病、 牙周病、 骨折以及假体周围骨溶解。此外， 患有骨转移或无骨转移的某些 类型的癌症的患者， 以及由于前列腺癌或乳腺癌而经受激素消融治疗 (hormone ablation therapy) 的患者， 都存在骨质流失、 骨折、 高发的骨相关事件以及骨质疏松症的风险。 0034 因此， 在某些实施方案中， 本发明的方法通过给需要此类治疗、 预防或延缓的女性 患者摄入通式(I)表示的化合物(比如三(8-羟基喹啉)-镓(III)， 以对女性绝经后骨质 疏松症 (PMO) 进行治疗， 或者预防。
23、或延缓发作。在其它的实施方案中， 此方法则用来在骨质 疏松症患者中减少骨折， 骨相关事件的风险或发生率， 或者来减少骨质流失或增加骨含量。 0035 在其他实施方案中， 这方法用于在男性和女性中治疗、 预防或延缓糖皮质激素性 骨质疏松症 (GIO) 或者骨相关事件， 特别是那些由于慢性疾病开始或继续接受全身性糖皮 质激素疗法 ( 例如每日剂量相当于 7.5 毫克或更高的强的松 ) 的患者中的糖皮质激素性骨 质疏松症 (GIO) 或者骨相关事件的发生， 其中包括给需要此类治疗、 预防或延缓的患者摄 入通式 (I) 表示的化合物 ( 比如三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)。 0036 在另。
24、外一些其他的实施方案中， 这方法应用于治疗、 预防或延缓由于前列腺癌或 乳腺癌而接受激素剥夺疗法的患者的骨质疏松症， 特别是骨质流失或骨折或骨相关事件的 发作， 或者减少这种风险， 通过给此类患者摄入通式 (I) 表示的化合物 ( 例如， 三 (8- 羟基 喹啉 )- 镓 (III)。 0037 在另一些实施方案中， 这方法应用于治疗、 预防或延缓与癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺 癌， 前列腺癌， 淋巴瘤， 多发性骨髓瘤或神经内分泌瘤 ) 相关的骨质疏松症或低骨矿密度或 骨质流失或骨相关事件如骨折的发生或减少此类风险。具体地说， 本发明的化合物可以给 确诊为患有伴随骨转移或无骨转移癌症的患者 。
25、( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤， 多 发性骨髓瘤或神经内分泌瘤 ) 摄入， 从而治疗、 预防或延缓骨质疏松症特别是骨质流失、 低 骨矿密度、 骨折、 或骨相关事件(例如， 严重的骨疼痛， 病理性骨折， 脊髓压迫)的发生， 或者 减少这种风险。尤其， 神经内分泌瘤常常导致异常的甲状旁腺素水平， 而且常与低骨矿密 说 明 书 CN 102665421 A 7 5/7 页 8 度， 骨质流失， 骨质疏松或骨相关事件相关。 因此， 在特定的实施方案中， 本发明提供了一种 在患有神经内分泌瘤的患者中治疗、 预防低骨矿密度、 骨质流失、 骨质疏松或骨相关事件， 或者减少它们的发生率或风险。
26、。 0038 此外， 本发明亦可用于治疗或延迟任何局部性骨质流失， 比如相关的牙周炎， 骨 折， 假肢周围骨溶解的发生。 0039 在另一种实施方案中， 本发明通过给需治疗的患者摄入有效治疗剂量的通式 (I) 表示的化合物或其一种药学上可接受的盐 ( 例如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 用于治疗 或预防佩吉特病。 0040 而且， 破骨细胞和骨吸收的抑制可以预防或抑制肿瘤细胞转移到骨骼和在骨中生 长。因此， 本发明也提供了一种预防、 或延缓癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤或 多发性骨髓瘤)骨转移的发作， 包括给确定患有或诊断为癌症(例如， 肺癌， 乳腺癌，。
27、 前列腺 癌， 淋巴瘤或多发性骨髓瘤 ) 但无骨转移的患者摄入有效治疗剂量的通式 (I) 表示的化合 物或其一种药学上可接受的盐 ( 例如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)， 从而预防或延缓癌细 胞骨转移的发生， 和 / 或延长无骨转移的存活。在一种实施方案中， 这方法进一步包括一个 诊断患有癌症(例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤或多发性骨髓瘤)但不伴随骨转移的 患者的步骤。 0041 此外， 也提供了一种治疗骨转移癌症的方法， 包括确定患者患有已经转移到骨骼 的癌症 ( 例如， 肺癌， 乳腺癌， 前列腺癌， 淋巴瘤或多发性骨髓瘤 )， 并且给患者摄入有效治 疗剂量的通。
28、式 (I) 表示的化合物或其一种药学上可接受的盐 ( 例如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)。 0042 按照本发明的方法， 有效治疗剂量的通式 (I) 表示的化合物或其一种药学上可接 受的盐 ( 例如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 可以作为单一药物单独使用， 或是与一种或多 种其他的药物 ( 例如， 抗癌药物和抗骨质疏松药物 ) 联合。例如， 本发明的化合物可给正在 接受补钙和 / 或维生素 D 的患者服用。 0043 这里用到的 “用 . 治疗 .” 意思是给患者服用一化合物或引起患者体内形成此 化合物。 0044 根据本发明， 提供了通式(I)表示的一种化合物。
29、或者它的药学上可接受盐(例如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 的在制备一种药物中的应用， 其药物用于减少破骨细胞骨吸 收、 治疗或预防骨质疏松症、 低骨矿密度或骨相关事件如骨折。 0045 通式 (I) 表示的化合物可以通过皮下注射、 肌肉注射或静脉注射、 或口服或其它 合适的方法， 按患者每千克的体重 0.01-1000mg 的剂量给与病人。活性成分可以在预定的 间隔摄入， 比如一天 4 次。应该了解的是， 上面提到的剂量范围只是示范性的， 而并不是想 限制本发明的范围。活性化合物的有效治疗剂量可能根据各种因素而不同， 这些因素包括 但不仅限于， 所使用化合物的活性、 患者体内。
30、活性化合物的稳定性、 所要缓解的病症的严重 程度、 所治疗患者的总体重、 给药的途径、 活性化合物在患者体内吸收的容易程度、 分布、 排 泄， 所治疗患者的年龄和敏感性等等， 这些对技术人员来说都是显而易见的。 摄入量可因各 种因素随着时间变化而调整。 0046 例如， 化合物三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 可以以封闭的明胶胶囊或压制药片的 形式口服。胶囊和药片可以结合合适的药用载体如粘合剂， 药用辅料， 润滑剂， 和甜味剂或 说 明 书 CN 102665421 A 8 6/7 页 9 芳香剂通过任何常用的技术来制备。 0047 合适的口服剂型也可以是悬浮液， 糖浆， 口香糖， 。
31、饼干， 酏剂诸如此类的形式。 若需 要的话， 也可以包括常用的调节味道、 口感、 颜色和形状的辅料。 此外， 为便于不能吞咽的患 者通过肠饲管进行摄取， 活性药物可以溶于适当的亲脂性植物油载体如橄榄油、 玉米油和 红花油。注射剂型比如缓冲溶液或悬浮液在本技术领域内众所周知。 0048 依据本发明的另一个方面， 提供了一种医药试剂盒， 包括一个容器里的一个单位 剂型的分子式 (I) 表示的化合物或其一种药学上可接受盐 ( 如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) ； 也可以还包括根据本发明方法的试剂盒使用说明书。 对技术人员来说显而易见， 单 元剂型的治疗化合物的剂量由本发明方法中使用于。
32、患者的剂量决定的。 在试剂盒中， 例如， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 可以按 0.01-3000mg 单位剂量包含在药片或胶囊或其他合适 的剂型中。 实施例 0049 1. 体外三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 对破骨细胞的影响 0050 从两只 1-2 月大的小鼠的腿骨和胫骨中剥离出小鼠骨髓细胞， 吸附于 100mm 培养 皿内的培养基里(alpha MEM添加10高温灭活的胎牛血清， 100u/ml的青霉素， 100g/ml 链霉素和 2mM 左旋谷氨酰胺 )， 37， 5 CO2下孵育过夜。 0051 第二天， 非贴壁细胞经颗粒化后以每 cm2200,000 个。
33、细胞接种。破骨细胞前体细胞 在有 30ng/ml 的 sRANKL 和 30ng/ml 的 M-CSF 的存在下培养且分别用三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 或 GaNO3或 DMSO( 作为对照 ) 处理。培养液 3 天后更换， 6 天后获得成熟的破骨细胞。 对于三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 的处理， 将三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 溶解于 DMSO 配 制成药物原液， 加入培养基达到终浓度为 0.2nM， 2nM， 0.02M， 0.2M， 2M， 20M， 50M， 或 100M。最后， 对破骨细胞制剂使用 Sigma 公司的白细胞酸性磷酸酶试剂盒 。
34、(leukocyte acid phosphatase kit)进行TRAP染色并对TRAP着色的多核细胞计数。 特别是， 进行TRAP 染色和每个陷窝的 5 个区域都进行拍照。对含有大于 3 个核的细胞进行计数。图 1 显示用 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 处理可以显著抑制破股前体细胞融合进多核细胞， 从而抑制破 骨细胞的分化 / 形成 (3 个样品的平均值 标准差 ； 相比于 DMSO 和 GaNO3(3.9M， 39M) p 0.05)。 0052 分离 RNA 进行破骨细胞标记基因 (TRAP， 组织蛋白 K 和 NFAT2) 的基因表达分析。 从进行过 DMSO 或三 。
35、(8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 处理过的破骨细胞中提取总 RNA， 而 mRNAs 的 测定则使用 RT-PCR。用 - 肌纤蛋白标定 mRNAs 的相对水平然后表示成 DMSO 处理后细胞的 刺激倍数。图 2 表示三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)( “drug” ) 明显抑制组织蛋白 K、 NFAT2 和 TRAP 基因的表达。 0053 总之， 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 对抑制破骨细胞的分化和成熟非常有效。 0054 2. 体外三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 的效果 0055 SD 雌性大鼠 (100-125g， 大约 12 周龄 ) 购于 。
36、Taconic 公司 (Hudson， New York)。 这些大鼠被分为 5 组， 每组 8 只。其中 4 组切除卵巢， 而另一组为假手术组。这些大鼠通过 以下方式进行处理 ： 组 1 切除卵巢的大鼠每周的第 1 天到第 5 天口服 15mg/kg 的三 (8- 羟 基喹啉 )- 镓 (III)(“daily” ) ； 组 2 切除卵巢的大鼠每周的第一天口服 75mg/kg 的三 说 明 书 CN 102665421 A 9 7/7 页 10 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)(“weekly” ) ； 组 3 切除卵巢的大鼠每周的第一天口服 38mg/kg 的 Ga(NO3)3(“w。
37、eekly” ) ； 组 4 切除卵巢的大鼠仅仅给予安慰剂 (0.1的羧甲基纤维素 ) ； 组 5 大鼠为假手术组， 仅给予安慰剂 (0.1的羧甲基纤维素 )。实验的最后 ( 第一次给予 化合物后的 32 天 ) 将实验动物麻痹。通过 pixiMUSX 射线光度计介导的双能 X 射线吸收测 量法测量胫骨的骨质密度 (BMD) 和骨质含量 (BMC)。如图 3 所示， 每天摄入三 (8- 羟基喹 啉 )- 镓 (III) 的卵巢切除大鼠 (“daily drug” ) 相比于卵巢未切除大鼠 (“vehicle” )， 与增加的骨质密度相关。 0056 抽取大鼠血液与室温下静置至少 30 分钟， 。
38、200x g 离心 10 分钟以分离血清。血 清用来对血清标记物包括骨钙素的测量。骨钙素通过 ELISA 测量。骨钙素仅产生于骨重 塑过程中的成骨细胞。它是骨细胞外基质最丰富的非胶原蛋白。见 Weinreb， M.， Shinar， D.&Rodan， G.A.J.Bone Miner.Res.5， 831-842(1990). 已证明骨钙素缺乏小鼠表现出更高 的骨含量和高质量的骨骼功能。Ducy et al.， Nature.382， 448-452(1996). 因此骨钙素是 骨生成的一种负调节器， 而且血清骨钙素的减少可导致骨量的增加。如图 4 所示， 三 (8- 羟 基喹啉 )- 镓 。
39、(III) 处理的卵巢切除大鼠 (“drug daily” ) 相比于仅给予安慰剂的卵巢 切除大鼠 (“vehicle” ) 与血清骨钙素的减少显著相关。因此， 进一步证实三 (8- 羟基喹 啉 )- 镓 (III) 对骨质疏松症的治疗有效。 0057 3. 三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III) 在骨模型的定量影响 0058 以 章 节 2 描 述 的 方 式 得 到 小 鼠 的 骨 髓 细 胞， 吸 附 在 16 孔 BD BioCoatTM OsteologicTMDiscs 上， 接 种 于 密 度 为 200,000cells/cm2且 加 入 sRANKL(30ng/ml) 和。
40、 M-CSF(30ng/ml) 的培养基中。用不同浓度的三 (8- 羟基喹啉 )- 镓 (III)(0.0002， 0.002， 0.02， 0.2， 2， 20M)处理细胞。 每两天更换相同的培养基直到第8天， 通过显微镜检用SPOT Advanced 软件对重吸收区域进行定量。 0059 说明书中提及的所有论文和专利申请书是领域内技术人员对本发明相关的认识 水平的体现。所有的论文和专利申请书在此通过相同程度的引用结合到文中， 好像每篇单 个的论文或专利申请书都是特定的和单独的提及而通过引用结合到文中。 论文和专利申请 书的仅仅提及不一定表示承认他们是相对于本申请的在先技术。 0060 尽管前述的发明为了清楚的理解通过图示和例子的方式而描述的相当详细， 但显 然一些改变和修正可能在附加的权利要求范围内实行。 说 明 书 CN 102665421 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102665421 A 11 2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102665421 A 12 。