布鲁氏菌GROEL蛋白的应用以及重组表达布鲁氏菌GROEL蛋白的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102198269 A (43)申请公布日 2011.09.28 CN 102198269 A *CN102198269A* (21)申请号 201110092479.2 (22)申请日 2011.04.13 A61K 39/10(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C07K 14/23(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军疾病预防控制所 地址 100071 北京市丰台区东大街 20 号 (72)发明人 王玉飞 陈泽良 黄留玉 付思美 徐杰 袁静 杜昕颖 。

2、汪舟佳 宋宏彬 (74)专利代理机构 北京尚诚知识产权代理有限 公司 11322 代理人 鲁兵 (54) 发明名称 布鲁氏菌 GroEL 蛋白的应用以及重组表达布 鲁氏菌 GroEL 蛋白的方法 (57) 摘要 本发明布鲁氏菌 GroEL 蛋白的应用以及重组 表达布鲁氏菌 GroEL 蛋白的方法， 公开了布鲁氏 菌 GroEL 蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚 单位疫苗中的应用以及一种重组表达布鲁氏菌保 护性抗原GroEL的过程。 实验证明布鲁氏菌GroEL 蛋白和佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体， 激发细胞免疫， 并对布鲁氏菌具有较好的免疫保 护效果， 可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。 本。

3、发明 将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用， 应用前景 广阔。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 3 页 CN 102198273 A1/2 页 2 1. 布鲁氏菌 GroEL 蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。 2. 一种布鲁氏菌亚单位疫苗， 以布鲁氏菌 GroEL 蛋白作为保护性抗原制备得到。 3. 根据权利要求 2 所述布鲁氏菌亚单位疫苗， 其特征在于， 还包括免疫佐剂， 包括但不 限于弗式佐剂、 微生物佐剂及其产物 ( 如分枝杆菌、 短小棒状杆菌、 百日咳杆菌以及处。

4、左兰 氏阴性杆菌的提取物脂多糖， 自分枝杆菌的提取物质胞壁酰二肽等 )、 多聚核苷酸佐剂 ( 如 多聚肌苷酸胞苷酸 (poly1 C)， 多聚腺苷酸 (poly1 A ) 等 )、 无机物佐剂 ( 如明 矾及氢化铝等 )、 以及分子免疫佐剂 ( 如颗粒白细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、 干 扰素 -(IFN-)、 白介素 2(IL-2)、 TGF-4 等一种或多种细胞因子 )。 4. 一种重组表达布鲁氏菌保护性抗原 GroEL 的方法， 是利用 Gateway 技术使 GroEL 基 因在宿主细胞获得表达， 具体包括以下步骤 ： 1) 构建入门克隆 ( 即 BP 反应 ) ：。

5、 将 GroEL 基因和入门载体在 Gateway BP Clonase 酶的作用下进行反应， 使 GroEL 基因克隆进入门载体中， 得到入门克隆 ； 所述入门载体为 pDONR201 ； 以 pDONR201 为入门载体构建的包含 GroEL 基因的入门克隆为 pENTR-GroEL ； 2) 构建表达克隆载体 ( 即 LR 反应 ) ： 将步骤 1) 构建的包含 GroEL 基因的入门克隆和 目的载体在 Gateway LR Clonase 酶的作用下进行反应， 使 GroEL 基因转移进目的载体， 得 到表达克隆载体 ； 所述步骤目的载体为pHXGWA ； 以pHXGWA为目的载体构建。

6、的包含GroEL基 因的表达克隆载体为 pHXG-GroEL。 3) 将步骤 2) 构建的表达克隆载体导入宿主细胞， 经表达、 纯化， 得到高活性的布鲁氏 菌 GroEL 蛋白即布鲁氏菌保护性抗原 GroEL。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1) 中的 GroEL 基因采用 PCR 的 方法获得， 具体方法包括以下步骤 ： (1) 先以牛布鲁氏菌的基因组 DNA 为模板， 用 5 端含搭桥序列的引物 GroEL-E-F( 序列 表中序列 1) 和 GroEL-E-R( 序列表中序列 2) 扩增 GroEL 基因 ； (2) 再以步骤 1) 的 PCR 扩增产物。

7、为模板， 在通用引物 attB1( 序列表中序列 3) 和 attB2( 序列表中序列 4) 的引导下进行 PCR 扩增， 得到 GroEL 基因。 6. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 1) 中的 1l 反应体系为 ： 目的 基因扩增纯化产物 (100ng/l)0.5l、 Gateway BP Clonase 酶 0.2l、 入门载体 (50ng/ l)0.3l ； 反应条件为 ： 先在室温下反应 4-6h， 然后用 0.2l 蛋白酶 K 在 37下灭活 Gateway BP Clonase 酶。 7. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 2)。

8、 中的 1l 反应体系为 ： 包 含 GroEL 基因的入门克隆 (150ng/l)0.5l、 目的载体 (100ng/l)0.3l、 Gateway LR Clonase 酶 0.2l ； 反应条件为 ： 先在室温下反应 4-6h， 然后用 0.2l 蛋白酶 K 在 37下 灭活 Gateway BP Clonase 酶。 8. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3) 中的宿主为大肠杆菌、 酵母 菌、 哺乳动物细胞、 昆虫细胞或枯草杆菌， 优选为大肠杆菌 ； 所述大肠杆菌具体可为 E.coli ER2566(DE3)、 E.coli BL2l(DE3)、 E.coli。

9、 BL2l(DE3， plysS)， E.coliJM109， E.coli HB101 或E.coli Topl0， 优选为E.coli ER2566(DE3) ； 所述步骤3)中在大肠杆菌宿主细胞进行表 达时需加入 IPTG 诱导剂， 所加入 IPTG 的浓度为 0.2-1.0mmol/L， 优选为 0.5mmol/L， 诱导温 度为 35-39， 优选为 37， 诱导时间为 2-4 小时， 优选为 3 小时。 权 利 要 求 书 CN 102198269 A CN 102198273 A2/2 页 3 9. 根据权利要求 4-8 任一项所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 3) 中在大。

10、肠杆菌 宿主细胞进行表达后还需对表达蛋白进行纯化， 其中， 用镍 - 次氮基三乙酸蛋白纯化树 脂 (Ni-NTA) 进行纯化的具体方法为 ： 用 4-6 倍柱体积的细胞裂解液 (50mmol/LNaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 20mmol/L imidazole， pH8.0) 平衡 Ni-NTA 凝胶柱过夜， 然后取样品上清 加入平衡好的 Ni-NTA 柱中， 置于摇床上， 4结合 1-3h， 静置， 去上清， 再用 4-6 倍柱体积的 洗涤缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 50mmol/Limidazole， pH 8.0) 进。

11、行洗涤， 最后用 60 微升洗脱缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 250mmol/L imidazole， pH 8.0) 洗脱目的蛋白， 收集洗脱后的样品， 得到纯化的布鲁氏菌保护性抗原 GroEL。 10. 用权利要求 4-9 任一项所述方法表达得到的布鲁氏菌保护性抗原 GroEL。 权 利 要 求 书 CN 102198269 A CN 102198273 A1/8 页 4 布鲁氏菌 GroEL 蛋白的应用以及重组表达布鲁氏菌 GroEL 蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种布鲁氏菌 GroEL 蛋白的重组表达方法及其作为保护性抗原在。

12、制 备布鲁氏菌亚单位疫苗中的应用。 背景技术 0002 布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病 ( 简称布病 ) 是典型的人兽共患传染病， 给我国畜牧 业生产造成了巨大的经济损失， 也严重威胁人民的健康生活， 是一个重要的公共卫生问题。 布病是一种慢性传染性疾病， 预防该病的发生是控制该病的重要措施。 目前， 布病的预防主 要是通过接种疫苗来实现。灭活和减毒布鲁氏菌病原体制备的疫苗， 免疫动物后虽收到了 有效免疫应答及免疫保护效果， 但存在着接种后强烈过敏反应、 免疫与感染难以鉴别诊断 以及个别情况下出现菌毒恢复等难题， 至今难以给人接种。因此， 寻找安全、 有效的布病新 一代疫苗成为近几年的研究热点。 0。

13、003 和减毒活疫苗相比， 亚单位疫苗具有靶向性、 安全性的特点， 且其批量制作容易、 费用低， 并可解决传统疫苗安全性的问题， 另外， 亚单位疫苗可在诊断学上区分免疫接种和 自然感染。为了发展亚单位疫苗， 对保护性抗原的筛选和评价成了最主要的任务。人们陆 续对部分布鲁氏菌的表面抗原及胞内蛋白的免疫保护性进行了评价。但到目前为止， 仅仅 只发现了少数几个具有免疫保护性的蛋白， 如 ： L7/L12 核糖体蛋白、 Cu-Zu 超氧化物歧化酶 蛋白、 胞质蛋白 p39、 31kDa 外膜蛋白等。因此， 鉴定和筛选新的保护性抗原， 将为布鲁氏菌 亚单位疫苗的研究奠定基础。 0004 前人对于布鲁氏菌。

14、 GroEL 蛋白的研究， 以 GroEL 蛋白与布鲁氏菌胞内生存的关系 为主(参考文献1 ： Teixeira-Gomes A.P.， Cloeckaert A.， Zygmunt M.S.Characterization of heat， oxidative， and acid stress responses in Brucella melitensis.Infect Immun， 2000， 68 ： 2954-2961. 参 考 文 献 2 ： Lin J.， Ficht T.A.Protein synthesis in Brucella abortus induced during。

15、 macrophage infection.Infect Immun， 1995， 63 ： 1409-1414.)。Leclerq S 及同事将布鲁氏菌 GroEL 基因克隆至哺乳系统表达载体构建 DNA 疫苗， 但是结果显示， 该 DNA 疫苗仅能诱导 Th1 型免疫应答， 却无免疫保护性 (Baloglu S.， Toth T.， Schurig G.， Sriranganathan N.， Boyle S.Humoral immune response of BALB/ c mice to a vaccinia virus recombinant expressing Brucella。

16、 abortus GroEL does not correlate with protection against a B.abortus challenge.Vet Microbiol， 2000， 76 ： 193-199.)。对于 GroEL 重组蛋白的免疫保护性， 目前尚无相关研究报道。 0005 布 鲁 氏 菌 GroEL 蛋 白 可 参 考 文 献 3(Lin J.， Adams L.G.， Ficht T.A.Characterization of the heat shock response in Brucella abortus and isolation of the g。

17、enes encoding the GroEL heat shock proteins.Infect Immun， 1992， 60 ： 2425-2431.) 的方法获得。 说 明 书 CN 102198269 A CN 102198273 A2/8 页 5 发明内容 0006 本发明的主要目的在于提供布鲁氏菌 GroEL 蛋白作为保护性抗原在制备布鲁氏 菌亚单位疫苗中的新应用。 0007 本发明另一目的在于提供了一种高效表达布鲁氏菌 GroEL 蛋白的方法。 0008 该方法是利用 Gateway 技术使 GroEL 基因在宿主细胞获得表达， 具体包括以下步 骤 ： 0009 1)构建入门。

18、克隆(即BP反应) ： 将GroEL基因和入门载体在Gateway BP Clonase 酶的作用下进行反应， 使 GroEL 基因克隆进入门载体中， 得到入门克隆 ； 0010 2) 构建表达克隆载体 ( 即 LR 反应 ) ： 将步骤 1) 构建的包含 GroEL 基因的入门克 隆和目的载体在 Gateway LR Clonase 酶的作用下进行反应， 使 GroEL 基因转移进目的载 体， 得到表达克隆载体 ； 0011 3) 将步骤 2) 构建的表达克隆载体导入宿主细胞， 经表达、 纯化， 得到高活性的布 鲁氏菌保护性抗原 GroEL。 0012 在上述布鲁氏菌保护性抗原 GroEL 。

19、的重组表达方法中， 所述步骤 1) 中的 GroEL 基 因可采用 PCR 的方法获得， 具体包括以下步骤 ： 0013 1) 先 以 牛 布 鲁 氏 菌 的 基 因 组 DNA 为 模 板， 用 5端 含 搭 桥 序 列 的 引 物 GroEL-E-F( 序列表中序列 1) 和 GroEL-E-R( 序列表中序列 2) 扩增 GroEL 基因， 目的是使 PCR 扩增产物带上搭桥序列 ； 0014 2) 再以步骤 1) 的 PCR 扩增产物为模板， 在通用引物 attB1( 序列表中序列 3) 和 attB2(序列表中序列4)的引导下进行PCR扩增， 目的是使GroEL的PCR扩增产物带上a。

20、ttB 序列， 得到 GroEL 基因。 0015 所述步骤 1) 中的入门载体优选为 pDONR201 ； 其中， 以 pDONR201 为入门载体构建 的包含 GroEL 基因的入门克隆为 pENTR-GroEL。 0016 所述步骤 1) 中的 1l 反应体系为 ： 目的基因扩增纯化产物 (100ng/l)0.5l、 Gateway BP Clonase酶0.2l、 入门载体(50ng/l)0.3l ； 反应条件为 ： 先在 室温下反 应 4-6h， 然后用 0.2l 蛋白酶 K 在 37下灭活 Gateway BP Clonase 酶。 0017 所述步骤 2) 中的目的载体优选为 p。

21、HXGWA ； 其中， 以 pHXGWA 为目的载体构建的包 含 GroEL 基因的表达克隆载体为 pHXG-GroEL。 0018 所述步骤 2) 中的 1l 反应体系为 ： 包含 GroEL 基因的入门克隆 (150ng/ l)0.5l、 目的载体 (100ng/l)0.3l、 Gateway LR Clonase 酶 0.2l ； 反应条件为 ： 先在室温下反应 4-6h， 然后用 0.2l 蛋白酶 K 在 37下灭活 Gateway BP Clonase 酶。 0019 所述步骤 3) 中的宿主可为大肠杆菌、 酵母菌、 哺乳动物细胞、 昆虫细胞或枯草杆 菌等， 优选为大肠杆菌 ； 所述。

22、大肠杆菌具体可为 E.coli ER2566(DE3)、 E.coliBL2l(DE3)、 E.coli BL2l(DE3， plysS)， E.coli JM109， E.coli HB101或E.coli Topl0等， 优选为E.coli ER2566(DE3)。 0020 所述步骤 3) 中在大肠杆菌宿主细胞进行表达时需加入 IPTG 诱导剂， 所加入 IPTG 的浓度为 0.2-1.0mmol/L， 优选为 0.5mmol/L， 诱导温度为 35-39， 优选为 37， 诱导时间 为 2-4 小时， 优选为 3 小时。 0021 所述步骤 3) 中在大肠杆菌宿主细胞进行表达后还需对表。

23、达蛋白进行纯化， 其中， 说 明 书 CN 102198269 A CN 102198273 A3/8 页 6 用镍-次氮基三乙酸蛋白纯化树脂(Ni-NTA)进行纯化的具体方法为 ： 用4-6倍柱体积的细 胞裂解液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 20mmol/L imidazole， pH8.0) 平衡 Ni-NTA 凝胶柱过夜， 然后取样品上清加入平衡好的 Ni-NTA 柱中， 置于摇床上， 4结合 1-3h， 静置， 去上清， 再用 4-6 倍柱体积的洗涤缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 50mmol/L 。

24、imidazole， pH 8.0) 进行洗涤， 最后用 60 微升洗脱缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 250mmol/L imidazole， pH 8.0) 洗脱目的蛋白， 收集洗脱后的样品， 得到纯化的布鲁 氏菌 GroEL 蛋白 ( 布鲁氏菌保护性抗原 GroEL)。 0022 用本发明方法表达的布鲁氏菌GroEL蛋白即布鲁氏菌保护性抗原GroEL也属于本 发明的保护范围。 0023 实验证明， 布鲁氏菌 GroEL 蛋白具有免疫保护性， 可作为保护性抗原用于制备布 鲁氏菌亚单位疫苗。 0024 需要的时候， 以布鲁氏菌 GroEL 蛋白为。

25、保护性抗原制备的布鲁氏菌亚单位疫苗中 还可以融入免疫佐剂， 包括弗式佐剂、 微生物佐剂及其产物 ( 常用的微生物有分枝杆菌、 短小棒状杆菌、 百日咳杆菌以及处左兰氏阴性杆菌的提取物脂多糖， 自分枝杆菌的提取物 质胞壁酰二肽等 )、 多聚核苷酸佐剂 ( 如多聚肌苷酸胞苷酸 (poly1 C)， 多聚腺苷酸 (poly1 A ) 等 )、 无机物佐剂 ( 如明矾及氢化铝等 )、 以及颗粒 白细胞 - 巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF)、 干扰素-(IFN-)、 白介素2(IL-2)、 TGF-4等一种或多种细胞因 子作为分子免疫佐剂。 0025 本发明的疫苗可以制成注射液、 微球体、 干粉针剂。

26、或气雾剂等多种形式。 上述各种 剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 0026 上述亚单位疫苗的用量可采用药学领域中亚单位疫苗的常规剂量， 并可根据实际 情况调整。 0027 本发明试验中对布鲁氏菌 GroEL 蛋白的免疫原性和免疫保护性进行了分析。实 验结果表明布鲁氏菌 GroEL 蛋白可在体外明显刺激 S19 免疫小鼠的脾细胞分泌 IFN-， 说明 GroEL 蛋白可刺激 T 细胞免疫反应。将 GroEL 重组蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠， 观测 其体液免疫和细胞免疫能力， 结果显示免疫小鼠可以刺激机体产生布鲁氏菌特异的 IgG 抗 体， 并以 IgG2a 亚型为主， 这说明 GroE。

27、L 和佐剂混合免疫可以刺激机体产生体液免疫反应。 由于布鲁氏菌是一种胞内寄生菌， 细胞免疫反应在机体抵御布鲁氏菌的侵染中起着主要作 用， 尤其是 Th1 型细胞免疫因子 IFN- 在体内外的抗菌作用中发挥了重要作用 ； 为了评价 GroEL重组蛋白的细胞免疫能力， 在体外用纯化的GroEL蛋白刺激GroEL重组蛋白联合佐剂 免疫小鼠的脾细胞， 并测定了脾细胞的 IFN- 分泌量 ； 结果显示 GroEL 蛋白免疫小鼠脾细 胞分泌的 IFN- 量远远高于 PBS 组 ； 这表明 GroEL 和佐剂混合免疫可以刺激机体产生 Th1 细胞免疫反应 ； 而 IgG2a 的抗体含量明显高于 IgG1 也。

28、再次证实了这一点。为了评价 GroEL 重组蛋白的免疫保护性， 对GroEL和佐剂联合免疫小鼠进行了攻毒实验 ； 结果显示GroEL和 佐剂联合免疫小鼠的免疫保护性明显高于用PBS对照组， 与已知保护性较好的L7/L12阳性 对照组具有相同的免疫保护力 (1.35 个单位 )， 且两组都明显高于 S19 免疫组 (0.92 个单 位 )。综上所述， 布鲁氏菌 GroEL 蛋白和弗氏佐剂联合免疫可诱导产生特异性的抗体， 激发 细胞免疫， 并对布鲁氏菌具有较好的免疫保护效果， 可用于制备布鲁氏菌亚单位疫苗。 本发 明将在布鲁氏菌的防疫中发挥重要作用， 应用前景广阔。 说 明 书 CN 102198。

29、269 A CN 102198273 A4/8 页 7 0028 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 附图说明 0029 图 1 为利用 Gateway 技术进行 GroEL 蛋白表达、 纯化的 SDS-PAGE 检测结果 0030 图 2A 为 IFN- 试剂盒测定的标准曲线 0031 图 2B 为 GroEL 蛋白刺激 S19 免疫小鼠及 PBS 免疫小鼠产生的 IFN- 的含量 0032 图 3A 为 GroEL 蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平 0033 图 3B 为 GroEL 蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体的抗体分型 0034 图 4 为 GroEL 蛋白诱导 GroEL 。

30、蛋白免疫小鼠脾细胞分泌的 IFN- 量 具体实施方式 0035 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的 操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 0036 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 0037 实施例 1、 重组表达布鲁氏菌 GroEL 蛋白 0038 本实施例中利用Gateway技术使布鲁氏菌保护性抗原GroEL基因在大肠杆菌中获 得表达获得布鲁氏菌GroEL蛋白。 应该理解， 该实施例仅用于清楚说明获得布鲁氏菌GroEL 蛋白的一种方式， 布鲁氏菌 GroEL 蛋白的获得并不排除以其他文献 ( 例如背景技术中提到 的文献 3)。

31、 介绍的方式制备得到， 也可以从可能的商业渠道获得。 0039 一、 PCR 扩增布鲁氏菌保护性抗原 GroEL 基因 0040 1、 引物设计 0041 采用 Primer 5.0 软件设计扩增 GroEL 基因 (BMEII1048) 和作为阳性对照的 L7/ L12 基因 (BMEI0748) 的引物， 并在每对引物的 5端分别引入相应的搭桥序列， 上游为 5 -AAAAAGCAGGCTTA-3 ， 下游为 5 -TGTACAAGAAAGCTGGGTC-3 ， 同时设计一对通用引物 attB1 和 attB2， 引物序列见表 1， 由北京奥科生物公司合成。 0042 表 1 引物序列 0。

32、043 0044 2、 PCR 扩增 0045 分两步扩增 GroEL 基因和作为阳性对照的 L7/L12 基因 ： 0046 第一步 ： 以牛布鲁氏菌强毒株 B.abortus 544( 国家 CDC 提供 ) 的基因组 DNA 为 说 明 书 CN 102198269 A CN 102198273 A5/8 页 8 模板， 用含搭桥序列的引物 GroEL-E-F 和 GroEL-E-R 扩增 GroEL 基因， 用含搭桥序列的 引物 L7/L12-E-F 和 L7/L12-E-R 扩增 L7/L12 基因。PCR 扩增体系为 ： 基因组 DNA(20ng/ l)0.5l， Taq poly。

33、merase(5U/l)1U， 10PCR Buffer 5l， dNTP(2.5mM)4l， GroEL-E-F(20M)0.5l， GroEL-E-R(20M)0.5l， 补充无 菌水至 50l。PCR 扩增条件 为 ： 先 94 5min ； 然后 94 30s， 58 30s， 72 2min， 共 10 个循环 ； 最后 72 7min。 0047 第二步 ： 以第一步的 PCR 扩增产物 10L 为模板， 用通用引物 attB1 和 attB2 进行 第二步扩增。PCR 扩增体系为 ： 第一步的 PCR 扩增产物 10l， Taq polymerase(5U/l)1U， 10PCR。

34、 Buffer 4l， dNTP(2.5mM)4l， attB1(20M)2l， attB2(20M)2l， 补充无 菌水至 50l。PCR 扩增条件 ： 先 94 5min ； 然后 94 30s， 60 30s， 72 2min， 共 30 个循 环 ； 最后 72 7min。 0048 反应结束后， 对 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果获得了 1641bp 的 GroEL 基因条带和 363bp 的 L7/L12 基因条带， 与预期结果相符， 用 DNA 回收试剂 盒 ( 购自天根公司 ) 对目的基因进行回收及纯化。 0049 二、 Gateway 技术构建表达。

35、载体 0050 1、 构建入门克隆 ( 即 BP 反应 ) ： 用购自 Invitrogen 公司的 Gateway BP 反应试剂 盒将 GroEL 基因 ( 或阳性对照 L7/L12 基因 ) 和入门载体在 Gateway BP Clonase 酶的作 用下进行反应， 使 GroEL 基因 ( 或阳性对照 L7/L12 基因 ) 克隆进入门载体中， 得到入门克 隆， 1l 反应体系为 ： 目的基因扩增纯化产物 (100ng/l)0.5l、 GatewayBP Clonase 酶 0.2l、 入门载体 pDONR201( 购自 Invitrogen 公司， 50ng/l)0.3l。反应条件为。

36、 ： 室温 作用 4-6h， 然后用 0.2l 蛋白酶 K 在 37下作用 10min 灭活 Gateway BP Clonase 酶。反 应结束后， 将反应产物转化 40l 大肠杆菌 DH5 化学感受态细胞， 加 150l LB 液体培 养基复苏 45min， 涂含 50g/mL Kan 的抗性平板。每个平板随机挑取 3-6 个菌落用相应引 物进行 PCR 鉴定， 鉴定结果表明获得了序列正确的入门克隆， 分别命名为 pENTR-GroEL 和 pENTR-L7/L12。 0051 2、 构建表达克隆载体(即LR反应) ： 用购自Invitrogen公司的Gateway LR反应试 剂盒将步骤。

37、1构建的包含GroEL基因(或阳性对照L7/L12基因)的入门克隆和目的载体在 Gateway LR Clonase酶的作用下进行反应， 使GroEL基因(或阳性对照L7/L12基因)转移 进目的载体， 得到表达克隆载体， 1l 反应体系为 ： 含目的基因的入门克隆 (pENTR-GroEL 或 pENTR-L7/L12， 150ng/l)0.5l、 目 的 载 体 pHXGWA( 购 自 Invitrogen 公 司， 100ng/ l)0.3l、 Gateway LR Clonase 酶 0.2l。反应总体积为 ： 先室温作用 4-6h， 然后用 0.2l 蛋白酶 K 在 37下作用 10。

38、min 灭活 Gateway LR Clonase 酶。反应结束后， 将反应 产物转化到 40l 大肠杆菌 ER2566(DE3)( 购自 New England Biolabs 公司 ) 化学感受态 细胞中， 加 150l LB 液体培养基复苏 30min， 涂含 100g/mL Amp 的抗性平板。每个平板 随机挑取 3-6 个菌落用相应引物进行 PCR 鉴定， 鉴定结果表明获得了序列正确的表达克隆 载体， 分别命名 为 pHXG-GroEL 和 pHXG-L7/L 12。 0052 三、 目的蛋白的诱导表达、 纯化 0053 1、 目的蛋白的诱导表达 0054 挑取步骤二获得的携带 pH。

39、XG-GroEL( 或阳性对照 pHXG-L7/L12LR) 的 LR 阳性单克 隆菌接入含 100g/mL Amp 抗性的 LB 培养基中， 用 0.5mmol/L 的 IPTG 在 37下诱导表达 说 明 书 CN 102198269 A CN 102198273 A6/8 页 9 3 小时， 同时设阴性对照 ( 未诱导表达 )。表达结束后， 超声处理表达菌株， 分别收集上清和 沉淀进行 12 SDS-PAGE 检测。携带 pHXG-GroEL 的 LR 阳性单克隆菌的表达结果如图 1 所 示 (1. 蛋白 Maker ； 2. 未诱导的蛋白 ； 3. 诱导后的蛋白 ； 4. 超声液上清 。

40、； 5. 超声液沉淀 )， 与未诱导的蛋白相比， 诱导后的目的蛋白 GroEL 在 72.02KDa 处有一条明显的条带， 此外， GroEL 蛋白同时以可溶性和包涵体形式表达。取上清进行蛋白纯化。检测结果表明阳性对 照 L7/L12 也获得了表达。 0055 2、 目的蛋白的纯化 0056 用镍 - 次氮基三乙酸蛋白纯化树脂 (Ni-NTA， 购自 Novagen 公司 ) 对目的蛋白 进行纯化， 具体方法为 ： 用 5 倍柱体积的细胞裂解液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/LNaCl， 20mmol/L imidazole， pH8.0) 平衡 Ni-NTA 凝胶柱过。

41、夜， 然后取样品上清加入平衡好 的 Ni-NTA 柱中， 置于摇床上， 4结合 2h， 静置， 去上清， 再用 5 倍柱体积的洗涤缓冲液 (50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 50mmol/L imidazole， pH8.0) 进行洗涤， 最后用 60 微 升洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4， 300mmol/L NaCl， 250mmol/L imidazole， pH 8.0)洗脱目 的蛋白， 收集洗脱后的样品。纯化后将蛋白溶解在 PBS 中， 用 12 SDS-PAGE 蛋白电泳进行 纯化后的验证， 结果如图1所示(6.纯化后的蛋白)， 结果。

42、获得经纯化的目的蛋白GroEL(布 鲁氏菌 GroEL 蛋白 )， 用核酸蛋白微量定量仪 (Nanodrop) 测定蛋白浓度， 浓度为 0.5mg/ml。 用同样方法对阳性对照 L7/L12 也进行了纯化。 0057 实施例 2、 布鲁氏菌 GroEL 蛋白免疫原性和免疫保护性验证 0058 下述实验使用实施例 1 得到的布鲁氏菌 GroEL 蛋白进行， 但本领域技术人员都了 解， 该实验结论同样适用于其他途径 ( 如文献介绍或商业购买 ) 得到的布鲁氏菌 GroEL 蛋 白 ( 任何具有活性的布鲁氏菌 GroEL 蛋白 )。 0059 试验一、 小鼠免疫、 脾细胞刺激和 IFN- 测定 00。

43、60 由于布鲁氏菌是一种胞内寄生菌， 细胞介导的免疫反应在机体抵御布鲁氏菌的侵 入中起着重要作用。为鉴定 GroEL 是否为布鲁氏菌的候选保护性蛋白， 首先对 GroEL 的 T 细胞反应性进行了验证。试验方法 ： 将 6-8 周龄雌性 BALB/C 小鼠 ( 购自军事医 学科学院 实验动物中心 ) 随机分为两组， 每组 5 只， 一组用布鲁氏菌疫苗株 S19( 国家 CDC 提供 ) 进 行腹膜内免疫(1105CFU/只)， 另一组免疫PBS作为阴性对照。 35天后， 处死小鼠， 无菌取 脾， 以 200 目铜网研磨， 分离单个脾细胞。将分离的脾细胞 1000rpm 离心 10min， 并用。

44、 10mL 的红细胞裂解液(150mM NH4Cl， 1mM KHCO3， 0.1mMNa2EDTApH7.3)避光裂解15min， PBS洗涤 2 次后以 1640 完全培养基将脾细胞数量调整至 5105细胞 / 孔。用目的蛋白 GroEL(1g/ 孔 )、 0.5g ConA( 阳性对照 ) 和 1640 培养基 ( 阴性对照 ) 分别刺激脾细胞， 37培养箱 孵育 72h 后， 取细胞上清， 用 R&D System 公司的 Mouse IFN- 免疫分析试剂盒测定细胞因 子 IFN- 的含量。实验重复 3 次。 0061 结果如图2A和图2B所示(图2A ： IFN-试剂盒测定的标准曲。

45、线 ； 图2B ： GroEL蛋 白刺激 S19 免疫小鼠和 PBS 免疫小鼠产生的 IFN- 的含量 )， 和阴性对照 PBS 组相比， S19 免疫的小鼠脾细胞可以产生更高的IFN-(P0.001)， 这表明GroEL蛋白可以诱导S19免 疫小鼠脾细胞产生 T 细胞反应。 0062 试验二、 小鼠免疫、 攻毒实验及细胞因子反应 0063 1、 GroEL 蛋白免疫小鼠产生的特异性抗体水平及抗体分型 说 明 书 CN 102198269 A CN 102198273 A7/8 页 10 0064 利用 ELISA 方法测定 GroEL 免疫小鼠在不同时间点的血清 IgG 抗体水平， 同时以 。

46、已经报道保护性抗原 L7/L12(BMEI0748) 蛋白作为阳性对照。免疫方案 ： 将 6-8 周龄雌性 BALB/C 小鼠随机分组， 每组 10 只。第 1 天以 30g 纯化蛋白 + 弗氏完全佐剂乳化后腹膜内 注射免疫， 第 15 天以同样量的蛋白 + 弗氏不完全佐剂乳化加强免疫一次。S19(1105cfu/ 只 )+ 弗氏不完全佐剂作为阳性对照， 初免后 15 天腹膜内注射免疫。PBS 组为阴性对照， 免 疫方式同蛋白。然后， 分别于免疫后的第 0、 15、 30、 45、 60 和 75 天小鼠尾静脉取血， 通过间 接 ELISA 反应来测定小鼠血清中的 IgG 效价， 具体方法为 。

47、： 将纯化蛋白用包被液 (pH 9.6) 稀释成 5g/ml， 然后将稀释好的蛋白 (100l/ 孔 )4包被过夜， 洗板， 封闭 ； 将稀释好的 小鼠血清加入到酶联板中， 孵育后洗板， 加入兔抗鼠的辣根过氧化物酶标二抗 (50l/ 孔 ) 孵育 30 分钟后， 洗板 ； 每孔加入 100l 显色液 (200mol 邻苯二胺和 0.04 H2O2) 显色 20 分钟 ； 终止液 (2M 硫酸溶液 ) 终止反应后， 酶标仪测定 450nm 处的吸光度值。所有的分析测 定重复 3 次。测定 S19 疫苗株免疫小鼠的抗体效价时用热灭活的 S19 菌株包被。 0065 结果如图 3A 所示 ( 图 3。

48、A ： GroEL 免疫小鼠在不同时间点的血清 IgG 抗体水平 )， GroEL蛋白可以诱导小鼠产生特异性抗体， 在一免后30天， IgG的平均滴度为2000， 在45天 时抗体水平达到最高 (IgG 平均滴度为 8540)。 0066 同时还用间接 ELISA 反应对小鼠血清抗体水平最高时的抗体进行了抗体分型鉴 定， 检测了与 Th1 相关的 IgG2a 亚型和与 Th2 相关的 IgG1 亚型的比例。结果如图 3B 所示 (图3B ： GroEL免疫小鼠产生的血清IgG抗体分型)， IgG1的抗体滴度低于IgG2a抗体滴度， 说明 GroEL 主要刺激机体产生 Th1 型免疫反应。 0067 2、 攻毒实验 0068 初次免疫后的 45 天， 对免疫小鼠进行攻毒实验， 通过计算小鼠脾脏内布鲁氏菌 的 CFU 来评价 GroEL 的保护性效果。试验方法 ： 腹膜内注射 2104CFU 布鲁氏菌强毒株 B.abortus 544。攻毒后 30 天， 处死小鼠， 无菌取脾， 用含有 0.1 Triton X-100 的 PBS 研 磨脾脏， 研磨液系列稀释后取 100l 涂 TSA 平板， 37培养 5 天后进行菌落计数。 0069 结果如表2所示， 与PBS组相比， GroEL免疫组具有明显的保护性(P0.01)， 其免 疫保护力与已知保护性较好的 L7/L12 阳。