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1、(10)申请公布号 CN 102198189 A (43)申请公布日 2011.09.28 CN 102198189 A *CN102198189A* (21)申请号 201110083065.3 (22)申请日 2011.04.02 A61K 36/82(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) (71)申请人 广东粤微食用菌技术有限公司 地址 510070 广东省广州市越秀区先烈中路 100 号大院 62 栋 (72)发明人 李向敏 潘鸿辉 焦春伟 谢意珍 蔡勉华 陈冠州 余雄涛 李森柱 张智 李崇 (74)专利代理机构 广州弘邦专利。
2、商标事务所有 限公司 44236 代理人 张钇斌 熊雁 (54) 发明名称 低咖啡碱茶叶提取物的制备方法 (57) 摘要 本发明所述的一种低咖啡碱茶叶提取物的制 备方法涉及一种山茶科植物提取物的制备方法。 该方法由以下步骤组成 ： (1) 将茶叶粉碎为茶粉 并对其进行加湿预处理 ； (2) 将处理过的茶粉进 行 CO2超临界萃取 ； (3) 将经过超临界萃取的茶粉 进行水浴提取 ； (4) 将提取液抽滤后浓缩冷冻干 燥。 本发明有效地提取了茶叶中的活性物质， 降低 活性物质中的咖啡碱含量， 将活性物质中的咖啡 碱含量控制在 3 ( 质量百分含量 ) 以内， 并使其 具有较高的抑制肿瘤细胞生长功。
3、效。通过实验验 证发现此活性物质的副作用低， 对肿瘤细胞生长 具有良好的抑制效果， 且无耐药性的产生。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 102198193 A1/1 页 2 1. 低咖啡碱茶叶提取物的制备方法， 其特征在于由以下步骤组成 ： (1) 将茶叶粉碎为茶粉并对其进行加湿预处理 ； (2) 将处理过的茶粉进行 CO2 超临界萃取 ； (3) 将经过超临界萃取的茶粉进行水浴提取 ； (4) 将提取液抽滤后浓缩冷冻干燥。 2. 如权利要求 1 所述的低咖啡碱茶叶提取物的制备方法， 其。
4、特征在于步骤 (1) 所述的 加湿预处理是使其含水量为 20 -80。 3. 如权利要求 1 所述的低咖啡碱茶叶提取物的制备方法， 其特征在于步骤 (2) 中所述 的萃取的条件为温度 25 -70 ； 处理时间 3-10 小时 ； 夹带剂为水， 其含量为 15 -65。 4. 如权利要求 1 所述的低咖啡碱茶叶提取物的制备方法， 其特征在于步骤 (3) 中所述 的水浴提取的提取温度为 40 -90； 料液比为 1 5 至 1 30 ； 提取 1-4 次 ； 每次 30-60 分钟。 权 利 要 求 书 CN 102198189 A CN 102198193 A1/3 页 3 低咖啡碱茶叶提取物。
5、的制备方法 【技术领域】 0001 本发明涉及一种山茶科植物提取物的制备方法。 【背景技术】 0002 茶属于山茶科， 为常绿灌木或小乔木植物。 现代科学研究证实， 茶叶含有许多与人 体健康密切相关的活性成份如茶多酚、 咖啡碱、 脂多糖、 茶氨酸等。 具有抗衰老、 抑制心血管 疾病、 抗癌、 防辐射、 抵抗病毒菌、 美容护肤、 醒脑提神、 利尿解乏、 降脂助消化、 护齿明目等 作用。咖啡碱是一种中枢神经的兴奋剂， 在绿茶叶含量一般为干茶重的 4左右， 并且咖啡 碱能使胃酸增多， 引起胃肠紊乱， 导致消化道不适。 0003 目前对茶叶的提取主要是使用有机溶剂萃取， 但是这样容易造成有机溶剂残留，。
6、 降低提取物的纯度， 影响提取物中活性成分的功效， 并对人体安全造成隐患。 【发明内容】 0004 本发明旨在提供一种制备茶叶提取物的方法， 该方法获得的茶叶提取物能清除体 内自由基， 预防细胞癌变， 并且其中所含的咖啡碱的量能明显降低。 0005 本发明所述的一种低咖啡碱茶叶提取物的制备方法， 由以下步骤组成 ： 0006 将茶叶粉碎为茶粉并对其进行加湿预处理 ； 0007 将处理过的茶粉进行 CO2 超临界萃取 ； 0008 将经过超临界萃取的茶粉进行水浴提取 ； 0009 将提取液抽滤后浓缩冷冻干燥。 0010 其中， 优选地 ： 0011 步骤 (1) 所述的粉碎是使用本领域普通技术人。
7、员熟悉的方法和要求进行的， 如可 以粉碎至 20 目。而所述的加湿预处理是使其含水量为 20 -80 ( w/w)。 0012 步骤 (2) 中所述的萃取条件为温度 25 -70； 处理时间 3-10 小时 ； 夹带剂为水， 其含量为 15 -65 ( w/w)。 0013 步骤(3)中所述的水浴提取的提取温度为40-100； 料液比为15至130 ； 提取 1-4 次 ； 每次 30-60 分钟。 0014 本发明有效地提取了茶叶中的活性物质， 降低活性物质中的咖啡碱含量， 将活性 物质中的咖啡碱含量控制在5(质量百分含量)以内， 并使其具有较高的抑制肿瘤细胞生 长功效。 通过实验验证发现此。
8、活性物质的副作用低， 对肿瘤细胞生长具有良好的抑制效果， 且无耐药性的产生。 0015 下面通过相关实验来验证本发明从茶叶中提取获得的活性物质 ( 下面简称为本 发明 ) 的功效。 0016 咖啡因及茶多酚得率检测实验 0017 使用本发明进行咖啡因含量及茶多酚得率检测实验。 0018 实验结果显示使用本发明中的条件对茶粉进行处理和提取比普通提取方法的咖 说 明 书 CN 102198189 A CN 102198193 A2/3 页 4 啡因含量降低约 80， 茶多酚含量提高到大约 40。 0019 实验条件 咖啡因含量 ( w/w) 茶多酚得率 ( w/w) 普通条件 12 30 本发明 。
9、5 42 0020 二、 抑制肿瘤细胞生长实验 0021 使用本发明进行抑制肿瘤细胞生长实验。 0022 实验步骤 ： 0023 1.称取一定量的本发明， 用DMEM培养基稀释成10mg/ml后， 用0.22um的无菌滤器 除去细菌等污染物。然后用 DMEM 培养基稀释终浓度为 1mg/ml。 0024 2. 细胞计数 0025 用含青霉素、 链霉素和10胎牛血清(FBS)的DMEM培养液进行细胞培养。 将含有 10 FBS 的 DMEM 细胞悬液接种于 96 孔组织培养板上， 细胞密度为 1105cells/ 孔。培养 物置于 37、 5 CO2 的组织培养箱中培养 2 天， 收集细胞， 用。
10、细胞计数器测定细胞数。 0026 3.MTT 法检测抑制效果 0027 (1) 收集对数期细胞， 调整细胞悬液浓度， 每孔加入 100ul， 铺板使待测细胞调密 度至 1105cells/ 孔 ( 边缘孔用无菌 PBS 填充 )。 0028 (2)5 CO2， 37孵育， 至细胞单层铺满孔底 (96 孔平底板 )， 加入浓度梯度的药 物， 孵育 4 个小时后加药 . 每孔 100ul， 设 5 个复孔。 0029 (3)5 CO2， 37孵育 48 小时， 倒置显微镜下观察。 0030 (4) 每孔加入 20ul MTT 溶液 (5mg/ml， 即 0.5 MTT)， 继续培养 4h。 003。
11、1 (5) 终止培养， 小心吸去孔内培养液， 每孔加入 150ul 二甲基亚砜， 置脱色摇床上 低速振荡 10min， 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。 0032 (6) 同时设置调零孔 ( 培养基、 MTT、 二甲基亚砜 )， 对照孔 ( 细胞、 相同浓度的药物 溶解介质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜 )。 0033 4. 计算抑制率 0034 相对抑制率 1-( 给药孔平均 OD 值 / 对照孔平均 OD 值 )100 0035 5. 实验结果 0036 实验结果如图 1 显示， 随着样品浓度的增加， 样品抑制肿瘤细胞生长的效果也增 加， 即抑制。
12、效果呈浓度依赖性。 【附图说明】 0037 图 1 所示的是样品抑制肿瘤细胞生长效果图。 【具体实施方式】 0038 实施例一 0039 1. 将茶叶进行加湿预处理， 使其含水量达到 25 ( w/w)。 说 明 书 CN 102198189 A CN 102198193 A3/3 页 5 0040 2. 将处理过的茶叶进行 CO2 超临界萃取脱除咖啡碱。萃取条件 ： 温度 30 ； 处理 时间 10 小时 ； 夹带剂为水， 其含量为 25 ( w/w)。 0041 3. 将经过超临界萃取的茶叶进行水浴提取。提取温度为 60 ； 料液比为 1 8 ； 提取 2 次 ； 每次 40 分钟。 00。
13、42 4. 将提取液抽滤后浓缩冷冻干燥。 0043 5. 提取物咖啡因含量为 2.7 w/w， 茶多酚得率为 ： 38 w/w。 0044 实施例二 0045 1. 将茶叶进行加湿预处理， 使其含水量达到 30 ( w/w)。 0046 2. 将处理过的茶叶进行 CO2 超临界萃取脱除咖啡碱。萃取条件 ： 温度 45 ； 处理 时间 8 小时 ； 夹带剂为水， 其含量为 35 ( w/w)。 0047 3. 将经过超临界萃取的茶叶进行水浴提取。提取温度为 55 ； 料液比为 1 9 ； 提取 2 次 ； 每次 50 分钟。 0048 4. 将提取液抽滤后浓缩冷冻干燥。 0049 5. 提取物咖。
14、啡因含量为 2.5 w/w， 茶多酚得率为 ： 40 w/w。 0050 实施例三 0051 1. 将茶叶进行加湿预处理， 使其含水量达到 60 ( w/w)。 0052 2. 将处理过的茶叶进行 CO2 超临界萃取脱除咖啡碱。萃取条件 ： 温度 70 ； 处理 时间 5 小时 ； 夹带剂为水， 其含量为 55 ( w/w)。 0053 3. 将经过超临界萃取的茶叶进行水浴提取。提取温度为 90； 料液比为 1 27 ； 提取 4 次 ； 每次 50 分钟。 0054 4. 将提取液抽滤后浓缩冷冻干燥。 0055 5. 提取物咖啡因含量为 2.9 w/w， 茶多酚得率为 ： 36 w/w。 说 明 书 CN 102198189 A CN 102198193 A1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102198189 A 。