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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510330452.0 (22)申请日 2015.06.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105055458 A (43)申请公布日 2015.11.18 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:M 2015123 2015.03.18 CCTCCNO M2014028 2014.01.16 (73)专利权人 山东凤凰生物有限公司 地址 271000 山东省泰安市泰山区创业大 街28号 (72)发明人 单宝龙 约克杰克毕 王静 任宝涛 张颜廷 刘虹 张化。
2、朋 王丽春 张云静 (74)专利代理机构 北京方圆嘉禾知识产权代理 有限公司 11385 代理人 董芙蓉 (51)Int.Cl. A61K 36/064(2006.01) A61K 35/742(2015.01) A61P 19/10(2006.01) A61K 33/10(2006.01) A61K 31/59(2006.01) (56)对比文件 CN 104357355 A,2015.02.18, CN 104323222 A,2015.02.04, CN 101230318 A,2008.07.30, 审查员 耿立冬 (54)发明名称 防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法 (57)摘要 。
3、本发明属于生物工程技术领域， 尤其涉及防 治骨质疏松的益生菌制剂由纳豆芽孢杆菌发酵 培养后得到纳豆芽孢杆菌菌粉， 酿酒酵母养基、 紫外照射得到酿酒酵母菌菌粉； 纳豆芽孢杆菌菌 粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成。 本发明提 供的防治骨质疏松的益生菌制剂， 以含天然维生 素K2(MK-7)的有益菌为原料、 同时含有维生素D 和钙的安全绿色的防治骨质疏松的产品， 能有效 提高钙质的吸收， 可以防治骨质疏松。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 105055458 B 2018.10.23 CN 105055458 B 1.防治骨质疏松的益生菌制剂， 其特征在于： 由以下方法制备所得： (1。
4、)纳豆芽孢杆菌菌粉的制备： 冻存的纳豆芽孢杆菌种经活化后转接到种子液体培养 基中， 在3545条件下， 静置培养1224h， 制得种子液； 以15的接种量， 将种子液接 于液体发酵培养基中， 3545， 100180rpm培养1224h， 然后转至4050条件下， 静 置培养57d； 发酵结束后， 立即将发酵液离心并用清水清洗， 离心条件为500010000rpm， 515min， 清洗23遍后冷冻干燥， 粉碎， 即为纳豆芽孢杆菌菌粉； (2)酿酒酵母的发酵生产： 酿酒酵母在斜面培养基中经斜面活化后转接到种子液体培 养基中， 2535条件下， 120200rpm振荡培养1830h， 制得种子液。
5、； 以15的接种量， 将种子液接于液体发酵培养基中， 2535， 120200rpm振荡培养1830h； (3)酿酒酵母紫外照射： 离心收集菌体， 用发酵液体积30去离子水重悬菌体， 紫外照 射24h； 紫外照射的波长为254365nm； (4)离心收集菌体， 离心条件为500010000rpm， 515min， 冷冻干燥后粉碎， 即为酿酒 酵母菌菌粉； 酿酒酵母菌菌粉中维生素D的含量不低于732.97ug/g； (5)产品复配： 将纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂产 品， 纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例配 制， MK-7：。
6、 VD： Ca2+30300： 110： 160。 2.根据权利要求1所述的防治骨质疏松的益生菌制剂， 其特征在于： 步骤(1)所述的种 子液体培养基各成分质量含量为： 葡萄糖0.2， 蛋白胨1.0， 氯化钠0.5， 酵母膏0.5， 其余为蒸馏水， pH值7.0； 步骤(1)所述的液体发酵培养基各成分质量含量为： 蛋白胨10， 丙三醇3、 NaCl0.5， K2HPO40.02， 其余为蒸馏水， pH7.0-7.2。 3.根据权利要求1所述的防治骨质疏松的益生菌制剂， 其特征在于： 步骤(2)所述的斜 面培养基配各成分质量含量为： 葡萄糖2， 酵母膏0.5， 蛋白胨1， 磷酸二氢钾0.2， 琼。
7、 脂粉1.52.0， 其余为蒸馏水； 步骤(2)所述的种子液体培养基及液体发酵培养基各成分质量含量为： 葡萄糖2， 酵 母膏0.5， 蛋白胨1， 磷酸二氢钾0.2， 其余为蒸馏水。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105055458 B 2 防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域， 尤其涉及防治骨质疏松的益生菌制剂及其制备方 法。 背景技术 0002 骨质疏松(osteoporosis， OP)是以骨量减少和骨组织微结构退化(松质骨骨小梁 变细、 断裂数量减少， 皮质骨多孔、 变薄)为特征的， 以致骨的脆性增高以及骨折危险增加的 一种全身。
8、骨骼疾病。 发病原因一般认为与钙及维生素缺乏、 内分泌失调、 营养失调以及运动 和光照不足有关。 该病女性多于男性， 常见于绝经后妇女和老年人。 随着我国老年人口的增 加， 骨质疏松症发病率处于上升趋势， 在我国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。 0003 维生素D是激素前体， 对维持血液中的正常的钙离子浓度和磷酸化水平至关重要。 当人类的皮肤被阳光中的紫外线照射后， 会产生足够多的维生素D。 由于人生活方式的改 变， 很多成年人因为不能照射到足够的阳光， 而无法产生出足够的VD。 因此通过日常饮食来 补充维生素D变得越来越重要了。 0004 近年研究发现， 防治骨质疏松不仅需要钙、 维生素。
9、D， 而且还需要维生素K， 尤其是 VK2。 研究确认， 维生素K2可作用于成骨细胞， 促进骨， 组织钙化， 同时还能抑制破骨细胞， 引 起骨吸收， 从而增加骨密度， 不仅可防还可治骨质疏松。 骨钙素是由成骨细胞、 成牙本质细 胞和肥大的软骨细胞合成并分泌的蛋白质， 它主要存在于这三种细胞外的骨基质中， 小部 分被释放进入血液循环， 所以血清骨钙素为骨形成的重要指标。 依赖于维生素K的骨组织羧 化系统使骨钙素羧化变成具有生物学活性的羧化骨钙素， 与钙结合， 由无规则线团变成螺 旋结构， 羟基磷灰石结合， 从而促进骨形成。 研究表明， 维生素K1、 K2、 K3中， K1有促进钙化作 用， K2。
10、作用更强， 而K3则没有这一作用。 0005 目前市场上预防骨质疏松应用较为广泛的保健品是以碳酸钙为主的超微化处理 的含有钙和维生素D的第3代复合制剂， 如液体钙+D3软胶囊(液体钙+维生素D)； 另外还有一 些钙与中药复配的保健品如苗岭牌骨立胶囊、 灵芝乳酸钙片等。 这些产品都以钙为主要成 分， 希望通过补钙达到防治骨质疏松的结果。 但是， 摄入的钙并不能保证被有效的吸收， 即 便有的产品加入维生素D， 在机体缺少维生素K2的情况下， 也不能保证吸收的钙能被有效的 利用。 发明内容 0006 本发明的目的是开发一款以含天然维生素K2(MK-7)的有益菌为原料、 同时含有维 生素D和钙的安全绿。
11、色的防治骨质疏松的产品。 0007 具体技术方案为： 0008 防治骨质疏松的益生菌制剂， 由以下方法制备所得： 0009 (1)纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)BLCC1-0053菌粉的制备： 冻存的纳豆芽孢杆菌 BLCC1-0053种经活化后转接到种子液体培养基中， 在3545条件下， 静置培养1224h， 说 明 书 1/5 页 3 CN 105055458 B 3 制得种子液； 以15的接种量， 将种子液接于液体发酵培养基中， 3545， 100180rpm 培养1224h， 然后转至4050条件下， 静置培养57d； 发酵结束后， 立即将发酵液离心 并用清水清洗， 离心条件。
12、为500010000rpm， 515min， 清洗23遍后冷冻干燥， 粉碎， 即为 纳豆芽孢杆菌菌粉。 0010 纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)BLCC1-0053， 已于2014年1月16日保藏于中国典型 培养物保藏中心， 其保藏编号为CCTCCM2014028； 保藏地址为中国武汉的武汉大学， 邮编为 430072； 所述的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053产维生素K2， 经高效液相色谱(HPLC)检测， MK-7的 含量不低于3.68733mg/g。 0011 其中， 种子液体培养基各成分质量含量为： 葡萄糖0.2， 蛋白胨1.0， 氯化钠 0.5， 酵母膏0.5， 其余为蒸馏。
13、水， pH值7.0。 0012 液体发酵培养基各成分质量含量为： 蛋白胨10， 丙三醇3、 NaCl0 .5， K2HPO40.02， 其余为蒸馏水， pH7.0-7.2。 0013 (2)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC4-0032已于2015年3月18日保藏于 中国典型培养物保藏中心， 其保藏编号为CCTCC NO： M2015123， 保藏地址为中国武汉的武汉 大学， 邮编为430072； 酿酒酵母的发酵生产： 酿酒酵母在斜面培养基中经斜面活化后转接到 种子液体培养基中， 2535条件下， 120200rpm振荡培养1830h， 制得种子液； 以1 5的。
14、接种量， 将种子液接于液体发酵培养基中， 2535， 120200rpm振荡培养1830h。 0014 其中， 斜面培养基配各成分质量含量为： 葡萄糖2， 酵母膏0.5， 蛋白胨1， 磷 酸二氢钾0.2， 琼脂粉1.52.0， 其余为蒸馏水。 0015 种子液体培养基及液体发酵培养基为不含琼脂的固体培养基， 即葡萄糖2， 酵母 膏0.5， 蛋白胨1， 磷酸二氢钾0.2， 其余为蒸馏水。 0016 (3)酿酒酵母紫外照射： 离心收集菌体， 用发酵液体积30去离子水重悬菌体， 紫 外照射24h； 0017 紫外照射的波长为254365nm。 紫外照射后的酵母菌粉中维生素D(VD)的含量不 低于73。
15、2.97ug/g， 即2931880IU/100g。 0018 (4)离心收集菌体， 离心条件为500010000rpm， 515min， 冷冻干燥后粉碎， 即为 酿酒酵母菌菌粉； 酿酒酵母菌菌粉中维生素D的含量不低于732.97ug/g； 0019 (5)产品复配： 将纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂 产品， 纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例 配制， MK-7 VD Ca2+30300 110 160。 0020 本发明提供的防治骨质疏松的益生菌制剂， 以含天然维生素K2(MK-7)的有益菌为 原料、 同时含有维生素D和钙的。
16、安全绿色的防治骨质疏松的产品， 能有效提高钙质的吸收， 可以防治骨质疏松。 附图说明 0021 图1是本发明实施例试验过程中大鼠体重变化； 0022 图2是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨矿含量； 0023 图3是本发明实施例饲喂产品前后骨矿含量增长情况； 0024 图4是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨密度； 说 明 书 2/5 页 4 CN 105055458 B 4 0025 图5是本发明实施例饲喂产品后各组大鼠骨密度增长情况； 0026 图6是本发明实施例中各组大鼠血清中P的含量； 0027 图7是本发明实施例中各组大鼠血清中Ca的含量。 具体实施方式 0028 为了使本发明的目的、 。
17、技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合实施例， 对本发明 进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并不用于 限定本发明。 0029 实施例1 0030 (1)纳豆芽孢杆菌BLCC1-0053菌粉的制备 0031 培养基配方： 0032 种子液体培养基各成分质量含量为： 葡萄糖0.2， 蛋白胨1.0， 氯化钠0.5， 酵 母膏0.5， 其余为蒸馏水， pH值7.0。 0033 液体发酵培养基各成分质量含量为： 蛋白胨10， 丙三醇3、 NaCl0 .5， K2HPO40.02， 其余为蒸馏水， pH7.0-7.2。 0034 冻存的纳豆芽孢杆菌BLCC1-0。
18、053种经活化后转接到种子液体培养基中， 在37条 件下， 静置培养16h， 制得种子液； 以5的接种量， 将种子液接于液体发酵培养基中， 37， 120rpm培养24h， 然后转至42条件下， 静置培养57d； 发酵结束后， 立即将发酵液离心并 用清水清洗， 离心条件为500010000rpm， 515min， 清洗23遍后冷冻干燥， 粉碎， 即为纳 豆芽孢杆菌菌粉。 0035 菌粉样品经过处理后， 高效液相色谱(HPLC)结果显示MK-7产量高达3.68733mg/g。 0036 (2)酿酒酵母BLCC4-0032菌粉的制备 0037 斜面培养基配各成分质量含量为： 葡萄糖2， 酵母膏0.。
19、5， 蛋白胨1， 磷酸二氢 钾0.2， 琼脂粉2.0， 其余为蒸馏水。 0038 种子液体培养基及液体发酵培养基为不含琼脂的固体培养基， 葡萄糖2， 酵母膏 0.5， 蛋白胨1， 磷酸二氢钾0.2， 其余为蒸馏水。 0039 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BLCC4-0032在斜面培养基中经斜面活化后 转接到种子液体培养基中， 30条件下， 180rpm振荡培养24h， 制得种子液； 以3的接种量， 将种子液接于液体发酵培养基中， 30， 180rpm振荡培养24h， 离心收集菌体； 0040 用发酵液体积30去离子水重悬菌体， 312nm紫外照射4h； 0041 。
20、离心收集菌体， 冷冻干燥后粉碎， 即为菌粉成品。 0042 样品处理后， 经HPLC检测， 样品中VD含量高达732.97ug/g， 即2931880IU/100g。 0043 (3)产品复配： 将纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙配成益生菌制剂 产品， 纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按照有效成分质量比例 配制， MK-7 VD Ca2+100 5 160。 0044 实施例2 0045 产品复配步骤中， 纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按 照有效成分质量比例配制， MK-7 VD Ca2+30 1 160。 0046 其他步骤与实施例1。
21、相同。 说 明 书 3/5 页 5 CN 105055458 B 5 0047 实施例3 0048 产品复配步骤中， 纳豆芽孢杆菌菌粉、 酿酒酵母菌菌粉以及碳酸钙混合的比例按 照有效成分质量比例配制， MK-7 VD Ca2+300 10 160。 0049 其他步骤与实施例1相同。 0050 产品功效验证 0051 试验动物： Wistar大鼠， 鼠龄6-8周， 雌鼠 0052 试验分组： 将购买的大鼠分为7组， 第1组， 饲喂正常饲料， 不做任何处理； 第2组， 维 甲酸70mg/kg+生理盐水， 灌胃； 第3组， 维甲酸+低剂量产品， 灌胃； 第4组， 维甲酸+高剂量产 品， 灌胃； 第。
22、5组， 生理盐水， 灌胃； 第6组， 生理盐水+低剂量产品， 灌胃； 第7组， 生理盐水+高 剂量产品， 灌胃。 0053 试验设计： 根据VK2的人体每日摄入推荐量(RDA)， 选择实施例1的产品， 50ug/kg/ d、 500ug/kg/d两个用药剂量， 分别为低低剂量、 高剂量。 大鼠购买进实验室首先适应饲喂1 周， 之后饲喂低钙饲料3周后， DEXA(双能X-线吸收仪)测量骨密度及骨矿物质含量。 注射激 素造模， 同时灌胃产品3周， DEXA测量骨密度及骨矿物质含量， 麻醉(戊巴比妥钠)， 开膛心脏 取血或者腹主动脉取血进行相关血液指标测定。 0054 实验结果 0055 (1)大鼠。
23、体重变化 0056 因维甲酸副作用导致大鼠死亡， 因此2、 3、 4组灌胃维甲酸一周后停止维甲酸造模， 只进行低钙饲喂造模。 每天灌胃前称量大鼠体重， 一周为一个单位， 计算大鼠平均体重， 研 究6周内大鼠体重变化， 结果如图1所示。 0057 由图可以看出， 前3周各组的大鼠体重保持增长， 第4周开始， 维甲酸造模组体重下 降， 在停止使用维甲酸后饲喂产品组体重开始增加， 而且增长速度要比未饲喂产品组快。 而 其他低钙饲喂组大鼠的体重与空白对照组一样保持持续增长， 说明灌胃产品不会对大鼠的 正常生长产生影响。 0058 (2)骨矿含量(BMC)变化 0059 饲喂产品前后分别使用DEXA(双。
24、能X-线吸收仪)测量各组大鼠骨矿物质含量。 试验 结束后各组大鼠骨矿含量如图2所示； 饲喂产品前后大鼠骨矿含量增长情况如图3所示。 0060 由图可以看出， 低钙饲喂组的BMC显著低于空白对照组， 说明低钙饲导致大鼠骨质 疏松， 而产品灌胃组第6组大鼠骨矿含量与空白组无差异， 保持正常水平。 在对6组、 7组大鼠 进行产品灌胃后， 其BMC的增长量要显著高于未灌胃产品组即第5组， 说明灌胃产品能显著 增加大鼠的骨矿含量。 0061 骨密度(BMD)变化 0062 饲喂产品前后分别使用DEXA(双能X-线吸收仪)测量各组大鼠骨密度。 试验结束后 各组大鼠密度如图4所示； 饲喂产品前后大鼠骨密度增。
25、长情况如图5所示。 0063 由图可以看出， 低钙饲喂导致大鼠的BMD显著降低， 而在对6、 7组大鼠进行K2产品 灌胃后， 相对于骨密度持续降低的第5组， 6组、 7组的骨密度显著增加。 0064 (3)血清中磷(P)和钙(Ca)的含量 0065 试验结束后， 用戊巴比妥钠麻醉各组存活大鼠， 开膛心脏取血或者腹主动脉取血 进行相关血液指标测定。 血清中P和Ca含量分别如图6、 图7所示。 说 明 书 4/5 页 6 CN 105055458 B 6 0066 由图可以看出， 各实验组大鼠血清P含量差异不显著， 而钙的的水平有差异， 第4组 和7组的大鼠的血清钙水平与正常组无差异， 而显著高于。
26、低钙饲喂且无灌胃产品的对照组， 说明产品能够促进机体对钙的吸收， 补充机体钙的缺乏症状。 0067 实验结论 0068 通过骨质疏松的关键指标： 骨矿含量(BMC)、 骨密度(BMD)可以看出通过向大鼠灌 胃含VK2菌粉和VD等成分的复合产品， 可以显著提高其骨矿含量(BMC)、 骨密度(BMD)， 改善 大鼠的骨质疏松状况， 对于促进钙吸收以及骨骼的正常代谢具有一定的作用。 0069 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 5/5 页 7 CN 105055458 B 7 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 105055458 B 8 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 105055458 B 9 图7 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 105055458 B 10 。