技术领域
本实施方案总体上涉及硫酸葡聚糖，具体地涉及具有改善的生物效应和低毒性的新型硫酸葡聚糖。
背景
葡聚糖是复杂的支链葡聚糖(glucan)，即由葡萄糖单元构成的多糖，其由通常为1千或数千道尔顿(Da)高至数十万Da的不同长度的链组成。
葡聚糖的直链由葡萄糖单元之间的α-1,6糖苷键组成，而分支通常始于α-1,3键。葡聚糖由某些乳酸菌，诸如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、变形链球菌(Streptococcus mutans)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)从蔗糖合成。
硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚阴离子衍生物，其中一些C2-C4以及端基C1和C6位置被硫酸化。硫酸葡聚糖已为人所知数十年，特别是在抗凝疗法中作为肝素的潜在替代品。
硫酸葡聚糖分子可以有不同的分子量、不同的支化水平和不同的硫酸根含量和硫酸化模式。硫酸葡聚糖分子之间的这些物理和化学差异会产生不同的生物效应和毒性效应。
需要具有改善的生物效应，同时在药物相关剂量下仍然没有毒性的硫酸葡聚糖。
概述
总体目标是提供具有改善的生物效应同时在药物相关剂量下仍然没有毒性的硫酸葡聚糖。
该目标和其它目标由本文公开的实施方案来实现。
实施方案的一个方面涉及具有如通过核磁共振(NMR)光谱测量的在1850Da至3500Da的区间内的数均分子量(Mn)的硫酸葡聚糖或其盐。硫酸葡聚糖或其盐还具有在2.5至3.0的区间内的每个葡萄糖单元的平均硫酸根数。此外，硫酸葡聚糖或其盐的葡萄糖单元中C2位置的平均硫酸化为至少90％。
相较于市售的类似硫酸葡聚糖糖分子，实施方案的硫酸葡聚糖具有改善的生物效应和/或降低的毒性。
附图简述
通过参考以下结合附图的描述，可以最好地理解实施方案及其进一步的目标和有利方面，其中：
图1是聚焦在具有葡聚糖信号的区域上的葡聚糖原料的1D 1H NMR谱的扩展。
图2是葡聚糖起始原料与实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)的1D 1H NMR谱的比较。
图3举例说明覆盖有硫酸葡聚糖起始原料的相应谱的实施方案的硫酸葡聚糖(批号1)在25℃下的2D 13C-1H HSQC谱。
图4举例说明实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)在25℃下的1D 1H NMR谱。
图5举例说明实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)在25℃下的2D 13C-1H HSQC谱。每个峰对应于不同化学环境的C-H键。峰面积与每个C-H键的群体大致成比例。
图6举例说明根据实施方案的硫酸葡萄糖分子(顶部-批号1，中间-批号2，底部-批号3)的1D 1H NMR谱的硫酸葡聚糖区域的比较。
图7举例说明实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)在25℃下的2D 13C-1H HSQC谱。
图8举例说明硫酸葡聚糖对外周血中的白细胞的作用。通过以50mg/kg的剂量单次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖来处理动物。缓冲盐水(NaCl)用作媒介物对照。用巴比妥五钠(PNB)替代异氟烷来镇静一些动物，以比较不同麻醉方法的作用。误差棒显示平均值的标准误差(SEM)。使用学生t检验来评估相较于对照组的统计学上的显著性差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
图9举例说明硫酸葡聚糖对动员造血祖细胞移动至外周血中的功效。通过单次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖或利用媒介物(NaCl)来处理动物。误差棒显示SEM。使用学生t检验来评估相较于对照组的统计学上的显著性差异(*p<0.05)。
图10举例说明硫酸葡聚糖对升高外周血中的HGF水平的功效。通过单次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖或用媒介物(NaCl)来处理动物。误差棒显示SEM。使用学生t检验来评估相较于对照组的统计学上的显著差异(***p<0.001)。
图11举例说明施用的硫酸葡聚糖5HS(30.0mg/kg)和实施方案的硫酸葡聚糖(批次3，30mg/kg)以及媒介物对累积疾病指数的作用。
图12是举例说明用于实施方案的硫酸葡聚糖的生产的生产方法的流程图。
图13举例说明根据现有技术的硫酸葡聚糖的1D 1H NMR谱。
图14举例说明根据现有技术的硫酸葡聚糖的2D 13C-1H HSQC光谱。
详述
本实施方案总体上涉及硫酸葡聚糖，具体地涉及具有改善的生物效应和低毒性的新型硫酸葡聚糖。
本实施方案基于令人惊奇的发现，即硫酸葡聚糖分子具有显着不同的生物效应，尽管所述硫酸葡聚糖分子具有相似的化学和物理性质。因此，已制得具有导致相较于市售的类似硫酸葡萄糖分子的改善的生物效应和低毒性的数均分子量和硫酸化含量以及模式的硫酸葡聚糖。
常规地，已使用大小排阻色谱(SEC)，诸如SEC高效液相色谱(HPLC)(或简称为SE-HPLC)在分子量参数方面表征了硫酸葡聚糖分子。SEC在本领域也被称为凝胶过滤色谱、凝胶渗透色谱(GPC)或分子筛色谱。用于测量硫酸葡聚糖和相关葡聚糖的分子量参数的其它常用技术是光散射，诸如静态光散射(SLS)或基于粘度的技术。
然而，这些测定硫酸葡聚糖的分子量参数的技术报告了分子体积和形状函数，而不是其分子量。这意味着如果硫酸葡聚糖分子在测量期间形成聚集体或复合物，则测定了较高的表观分子量。
此外，测量中使用的几个因素和设置影响硫酸葡聚糖分子的表观分子量，诸如色谱柱和洗脱剂的选择、流速设置、校准程序(包括校准程序中使用的葡聚糖标准)、硫酸葡聚糖分子的电荷等。
另外，间接方法反而报告了分子体积和形状，所述分子体积和形状可以不仅在批次间显著不同，而且可在相同批次中的样品间显著不同，这取决于例如硫酸葡聚糖是被如何储存的，其在测量前是如何制备的等。
已使用更精确的技术来测定硫酸葡聚糖的分子量参数，所述技术提供真实的分子量参数，而不是受大小影响的参数。进一步将该技术与上述常规使用的技术进行比较。
为了能够通过不同的方法直接比较分子量/大小测定，重要的是要理解如下所列的常用分子大小定义。参数Ni表示样品或批次中分子量为Mi的硫酸葡聚糖分子的数量。
数均分子量(Mn)：通常通过端基测定例如核磁共振(NMR)光谱或色谱法产生的。如果假定正态分布，则可在Mn的每一侧发现相同数量的硫酸葡聚糖分子，即样品中分子量低于Mn的硫酸葡聚糖分子的数量等于样品中分子量高于Mn的硫酸葡聚糖分子的数量。
重均分子量(Mw)：通常用于对分子大小而非数值敏感的方法，例如光散射和SEC方法。如果假定正态分布，则在Mw的每一侧上的重量相同，即样品中分子量低于Mw的硫酸葡聚糖分子的总重量等于样品中分子量高于Mw的硫酸葡聚糖糖分子的总重量。
平均分子量或粒径平均平均分子量(size average molecular weights)(Mz)：通常用于测量分子运动的方法如扩散技术或沉淀。通常地，对高分子量聚合物更敏感。值得注意的是，n＝0给出Mn，n＝1给出Mw。
多分散指数(PDI)(Mw/Mn)，分子量分布宽度的常用量度。值1表示单分散聚合物，1.02至1.10对于充分受控制的合成聚合物而言是常见的，1.5至2对于链式反应产物是常见的，而～2对于步骤聚合产物是常见的。
分子量分布模式(Mp)表示液相色谱(LC)色谱图中最高峰的分子量。常用于标准聚合物的狭窄分布，并通过GPC/SEC或光散射测定。
实施方案的一个方面涉及特征在于如通过NMR光谱测量的在1850Da至3500Da的区间内的数均分子量(Mn)的硫酸葡聚糖或其盐。所述硫酸葡聚糖或其盐还具有在2.5至3.0的区间内的每个葡萄糖单元的平均硫酸根数，并且所述硫酸葡聚糖或其盐的葡萄糖单元中的C2位置的平均硫酸化度为至少90％。
实施方案的硫酸葡聚糖或其盐具有非常窄的分子量参数值的范围，即数均分子量(Mn)。该数均分子量(Mn)通过如本文进一步描述的基于NMR谱的端基测定来测量。与常规使用的GPC、SEC和光散射技术相比，NMR谱测量提供了在分子量参数测定方面更一致的结果。此外，NMR谱测量提供了不受任何聚集或复合物形成影响(这在常规使用的技术中是常见的问题)的硫酸葡聚糖分子的真实或正确的数均分子量(Mn)。
在一个具体的实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐具有如通过NMR光谱测量的在1850Da至2500Da的区间内，优选在1850Da至2300Da的区间内的数均分子量(Mn)。在具体的实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐(不包括任何抗衡离子)具有如通过NMR光谱测量的在1850Da至2200Da的区间内，优选在1850Da至2100Da的区间内，更优选在1850Da至2000Da的区隔内的数均分子量(Mn)。
在实施方案中，硫酸葡聚糖的盐是钠盐或钾盐，优选钠盐。该盐优选为硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐。
在具体的实施方案中，包括Na+抗衡离子的硫酸葡聚糖的钠盐具有如通过NMR光谱测定的在1850Da至3500Da的区间内，优选在2000Da至2500Da的区间内，更优选在2000Da至2400Da的区间内，诸如在2100Da至2300Da的区间内的数均分子量(Mn)。
在实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐优选具有在4.0至6.0的区间内的葡萄糖单元的平均数。在优选实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐具有在4.5至5.5的区间内，更优选在5.0至5.2的区间内(诸如5.1)的葡萄糖单元的平均数。
在实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐具有在2.5至2.8的区间隔内，优选在2.6至2.7的区间内的每个葡萄糖的平均硫酸根数。
在4.0至6.0的区间内的葡萄糖单元的平均数目和在2.5至3.0的区间内的每个葡萄糖单元的平均硫酸根数导致在10.0至18.0的区间内的硫酸葡聚糖或其盐中的硫酸根原子的总数。在实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐优选具有在11.25至15.4的区间内，优选在13.0至14.0的区间内的硫酸根原子的总数。
通常，具有平均5.1个葡萄糖单元和2.6至2.7的每个葡萄糖单元的平均硫酸根数的实施方案的硫酸葡聚糖分子通常导致如通过NMR光谱测量的在1850Da至2000Da的区间隔内的数均分子量(Mn)。
下式示意性地表示具有3个葡萄糖单元和最大数目的硫原子的硫酸葡聚糖分子，即可被硫酸化的葡聚糖核心中的每个位点或位置在结构式中已被硫酸化。因此，非末端葡萄糖单元被示为在C2、C3和C4位置硫酸化，具有游离C1位置的末端葡萄糖单元在C1、C2、C3和C4位置被硫酸化，具有游离C6位的末端葡萄糖单元在C2、C3、C4和C6位置硫酸化。
硫酸葡聚糖或其盐的葡萄糖单元中的C2位置的平均硫酸化度为至少90％。在一个实施方案中，C2位置的平均硫酸化度至少为95％。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐的葡萄糖单元中的C2、C3和C4位置处的平均硫酸根数在2.0至2.6的区间内，优选在2.2至2.6的区间内，诸如在2.3至2.5的区间内。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐的葡萄糖单元中的C3位置的平均硫酸化度在80％至90％的区间内，优选在84％至87％的区间内。
实施方案的硫酸葡聚糖或盐由此在葡聚糖核心中的葡萄糖单元中的C2、C3和C4位置处具有高度的硫酸化。在一个具体实施方案中，这些位置的至少70％被硫酸化，更优选这些位置的至少75％被硫酸化。在一个具体实施方案中，葡聚糖核心中的C2、C3和C4位置总数的75％至85％被硫酸化。
在一个实施方案中，端基C6的平均硫酸化度为至少80％，优选至少85％。
端基C1可以采取α-构型或β-构型。通常地，在这两种端基构型之间存在平衡。
当假定β-构型与α-构型相比时，端基C1似乎更容易被硫酸化。因此，在一个具体实施方案中，与α-构型相比，β-构型中的端基C1的硫酸化度更高。在一个实施方案中，β-构型中的端基C1的平均硫酸化度为至少75％，优选至少80％或至少85％。相应地，在一个实施方案中，α-构型中的端基C1的平均硫酸化优选为至少15％，优选在15％至75％的区间内，更优选在15％至50％的区间内，诸如在15％至45％的区间内。
在一个实施方案中，端基C1位置被硫酸化或与-OH键合。因此，硫酸葡聚糖或其盐优选除硫酸化(-SO3)外没有任何末端修饰。
如背景中所述，葡聚糖的直链由葡萄糖单元之间的α-1,6糖苷键组成。葡聚糖分子可以是仅由非支链中的葡萄糖单元组成的直链。葡聚糖分子还可通常通过α-1,3键来支化。
在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其盐具有小于5.0％，诸如小于3.0％，优选小于1.5％，诸如小于1.0％的葡萄糖单元的平均支化。因此，实施方案的硫酸葡聚糖或其盐优选为具有少量分支(如果有的话)的高度直链的分子。
一个具体实施方案涉及具有如通过NMR光谱测量的在2100Da至2300Da的区间内的数均分子量(Mn)的硫酸葡聚糖的钠盐(包括Na+抗衡离子)。硫酸葡聚糖的盐平均具有5.0至5.2个葡萄糖单元，并且每个葡萄糖单元的平均硫酸根数在2.5至2.8的区间内。在一个具体实施方案中，C2位置的平均硫酸化度为至少95％。葡萄糖单元中的C2、C3和C4位置处的平均硫酸根数更优选在2.2至2.6的区间内。
相较于市售的类似硫酸葡聚糖糖分子，实施方案的硫酸葡聚糖具有改善的生物效应和/或较低的毒性，如下面的实验中所示的。鉴于硫酸葡聚糖分子具有非常相似的分子量和硫酸化参数，生物效应和毒性的这些差异是非常令人惊讶的。因此，似乎具有特定范围的分子参数值和硫酸化参数值，所述参数值为硫酸葡聚糖糖分子提供优于具有在实施方案的所述特定范围或区间之外的分子量参数值和/或硫酸化参数值的其它硫酸葡聚糖分子的这些有利效应。
硫酸葡聚糖通过在酯化反应中使葡聚糖起始物质硫酸化来产生。在用于生产硫酸葡聚糖的现有技术中公开了各种生产方法。公开此类生产方法的文献的实例包括Biochemical Journal,51:129-133(1952)；瑞典专利第165 090号；美国专利第2,715,091号、第3,141,014号、第3,498,972号和第4,855,416号。不同的生产方法使用不同的硫酸化剂，诸如浓硫酸(H2SO4)、三氧化硫(SO3)或氯磺酸(ClSO3H)；不同溶剂，诸如吡啶(C5H5N)、甲酰胺(NH2COH)或乙酰胺(CH3CONH2)；和不同的工艺参数。这些差异可影响硫酸葡聚糖终产物的化学和物理性质。
下面参考图12描述当前优选的生产方法。硫酸葡聚糖通过硫酸化葡聚糖原料而产生。通过乙醇分馏法来实现具有适当分子量的硫酸葡聚糖的分离，其中最大分子量分子首先沉淀。
在第一步骤中，将葡聚糖原料在搅拌下添加至溶剂甲酰胺中。将容器内容物搅拌并温和地加热，随后将混合物转移至洗涤器中冷却。
在酯化反应中，在用盐水冷却的情况下，在5-6小时中加入氯磺酸。使温度保持恒定≤34℃，如果需要，用1个大气压的水蒸气加热。将混合物通过洗涤器转移至另一个容器中，然后用纯净水漂洗。在第一次乙醇沉淀前进行搅拌。
在替代实施方案中，在用盐水冷却的情况下，在约3小时的过程中将氯磺酸添加至一部分甲酰胺中。然后将葡聚糖和剩余甲酰胺的混合物转移至含有氯磺酸与甲酰胺的混合物的容器中，同时保持温度≤34℃。
在沉淀步骤中，将乙醇-水混合物泵送到硫酸葡萄糖混合物中，搅拌所述混合物。将混合物在用盐水冷却的情况下放置过夜。第二天，去除顶层相，上清液(乙醇相)。将下层相用乙醇洗涤，搅拌，放置沉淀，除去上清液。将该方法进行5次。用盐水进行冷却，加入氢氧化钠至pH为9.5。在第二和第四沉淀步骤后，用水溶解沉淀物。在第三次沉淀步骤后，在水和任选地磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中溶解沉淀物。用无水乙醇进行第五沉淀步骤。在用盐水或冷却水(约10℃)冷却下，将硫酸葡聚糖混合物泵送通过过滤器至乙醇容器。用纯净水漂洗泵，搅拌，并留下沉淀。将乙醇上清液移至罐中，并在搅拌下将无水乙醇添加至产物中。混合物用冷却水冷却。
上述沉淀方法是根据实施方案的硫酸葡聚糖的生产中的优选方法。然而，沉淀方法的变型是可能的，诸如减少或增加沉淀步骤的数量。虽然乙醇是沉淀方法中使用的优选醇，但也可使用其它醇，诸如甲醇。
在离心步骤中，将混合物移至离心机。离心后，取出离心液。将它置于内衬双重塑料袋的塑料容器内。将离心分离物溶于乙醇中。然后再次离心，在离心机中用乙醇洗涤离心物。
将离心分离物置于LAF 5中的过滤器盖的烧杯中，然后将烧杯置于真空干燥箱中。干燥后，将硫酸葡聚糖粉末通过710μm筛子进入内衬PE袋的塑料容器中。
为了产生10-13kg的实施方案的约硫酸葡聚糖，通常使用以下材料和量。
产物
合成过程中的主要反应：
(C6H10O6)n+NH2COH→(C6H10O6)n....NH2COH
(H3N+COH+ClSO3-)+(C6H10O6)n....NH2COH→(C6H10O6)n-SO3-+H3N+COH+Cl-
(C6H10O6)n-SO3-+H3N+COH+Na+OH-→(C6H10O6)n-SO3-Na++NH2COH+Na+
→(H2O+C2H5OH)→(C6H10O6)n-SO3-Na+
(C6H10O6)n-SO3-Na++Na2HPO4+NaH2PO4→(C6H10O6)n-SO3-Na++PO42-
实施方案的另一方面涉及用作药剂的根据实施方案的硫酸葡聚糖。
实施方案的另外方面涉及根据实施方案的硫酸葡聚糖，所述硫酸葡聚糖用于不同医学应用，包括用于将祖细胞和/或干细胞动员至受试者的外周血中，包括动员造血干细胞(HSC)和/或间充质干细胞(MSC)；用于将目标白细胞，特别是淋巴细胞动员至受试者的血流中；用于减少受试者中静脉内注射的细胞的肺吸收；用于诱导受试者中的肝细胞生长因子(HGF)，以及用作抗凝血药。根据实施方案的硫酸葡聚糖还适用于治疗、抑制或预防各种脱髓鞘疾病，包括CNS脱髓鞘疾病，诸如髓鞘纤维性疾病(myelinoclastic disorders)，例如多发性硬化症(MS)和德维克氏病(Devic’s disease)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、白细胞营养障碍(leukodystrophic disorders)，例如CNS神经病、脑桥中央髓鞘溶解症、脊髓病、脑白质病和脑白营养不良，以及外周脱髓鞘疾病诸如格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病和周围神经病变。
实施方案的硫酸葡聚糖还可用于治疗，抑制和/或预防器官、组织以及特别是细胞植入物(诸如兰格尔翰斯岛(islets of Langerhans))的即时血液介导的炎症反应(IBMIR)和移植排斥反应。
优选通过注射向受试者施用实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，特别是通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射或(i.p.)腹膜内注射，优选i.v.或s.c.注射来施用。可以使用的其它肠胃外施用途径包括肌内和关节内注射。
优选用选择的溶剂或赋形剂将实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制为注射用水溶液。溶剂有利地是水性溶剂，特别是缓冲液。此类缓冲液的非限制性实例是柠檬酸缓冲液，诸如柠檬酸一水合物(CAM)缓冲液或磷酸盐缓冲液。例如，可将实施方案的硫酸葡聚糖溶解在盐水诸如0.9％NaCl盐水中，然后任选地用75mM CAM缓冲，并使用氢氧化钠将pH调节至约5.9。非缓冲液也是可能的，包括水性注射液，诸如盐水，即NaCl(水性的)。此外，如果需要缓冲液，则可使用除CAM或磷酸盐缓冲液外的其它缓冲系统。
实施方案不限于注射，可替代地使用其它施用途径，包括口服、经鼻、经颊、经直肠、经皮肤、经气管、经支气管或局部途径。然后用基于特定施用途径选择的合适的赋形剂或载体配制活性化合物硫酸葡聚糖。
实施方案的硫酸葡聚糖的合适剂量范围可根据受试者的大小和体重，受治疗者的状况以及其它考虑而变化。特别是对于人受试者，可能的剂量范围可以是1μg/kg体重至150mg/kg体重，优选10μg/kg体重至100mg/kg体重。
在优选实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物配制来以在0.05至50mg/kg受试者体重，优选0.1至40mg/kg受试者体重，更优选为0.1至30mg/kg或0.1至15mg/kg受试者体重的范围内的剂量施用。
硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的施用不一定限于治疗目前的医疗状况，而是可以替代地或另外用于预防。
实施方案的硫酸葡聚糖可以在单一施用场合诸如以单次推注的形式施用。这种推注剂量可被相当快速地注射至患者体内，但有利地随时间输注，以使得硫酸葡聚糖溶液在数分钟的时间内(诸如在5至10分钟内)输注至患者。
或者，可在治疗期间多次，即至少两次施用实施方案的硫酸葡聚糖。通常地，对于急性疾病，治疗期的持续时间可以是单次施用，但优选在例如一周、数周或一个月的治疗期间以多次给药的形式存在。长达三个月甚至一年的更长的治疗期可进一步改善治愈和康复。
受试者是动物受试者，优选哺乳动物受试者，更优选人受试者。
实验
葡聚糖和硫酸葡聚糖的表征
主要研究目的是表征新型硫酸葡聚糖，并比较所述硫酸葡聚糖与其它类似硫酸葡萄糖分子之间的物理和化学差异。
NMR光谱
在进行的NMR实验中使用配备有5mm 1H/13C/15N三重共振探针的500MHZ Varian Inova光谱仪。使用标准版本的具有对应于200毫秒混合时间的绝热自旋锁的1D 1H、2D 1H梯度-COSY(相关光谱)、1H-13C HSQC(异核单量子相干光谱)、1H-13C HMBC(异核多键相关光谱)和2D 1H-1H ROESY(旋转框架核欧沃豪斯效应光谱)来记录以下类型的光谱。将配备有5mm 1H/13C可切换梯度探头(13C内圈)的400MHz Varian Inova光谱仪用于记录1D 13C光谱。在室温(25℃)下记录光谱。使用60秒的扫描之间的总弛豫延迟、利用3秒的采集时间和14.5ppm的光谱宽度，获得了定量1D 1H NMR谱。将残余HDO信号在1H维度中以4.75ppm为参考，而在13C维度中使用间接化学位移参考(通过使用13C和1H的旋磁比)。
用MestreNova 9.0.0处理和分析所有NMR谱。使用1Hz洛伦兹线增宽和基线校正(自动Whitaker或3阶多项式函数)进行1D 1H谱的处理。使用以下区域作为各种结构元素的报告子，使用1D谱的MestreNova的“峰模式”进行积分：
将2D HSQC谱在两个维度中经历纯正弦方波函数，并对选择的矩形光谱区域(见图5)进行积分。
NMR化学品和材料
实验验证
为了评估基于NMR的端基测定的性能，使用用于完全定量分析的参数集(60秒的再循环延迟)对一组商购可得的葡聚糖分子量标准物进行1D 1H NMR实验。值得注意的是，葡聚糖标准物通常也被用作用于硫酸葡聚糖的分子大小测定的标准物，因为市场上无硫酸葡聚糖分子大小标准物可售。
从肠膜明串珠菌获得的葡聚糖标准物1000(产品编号31416，Fluka，批号BCBM6794V，CAS号9004-54-0)；用于GPC的分析标准物，Mw 1000Da。
从肠膜明串珠菌获得的葡聚糖标准物5000(产品编号31417，Fluka，批号BCBL9398V，CAS号9004-54-0)；用于GPC的分析标准物，Mw 5000Da。
从肠膜明串珠菌获得的葡聚糖标准物12000(产品编号31418，Fluka，批号BCBN0032V，CAS号9004-54-0)；用于GPC的分析标准物，Mw 12000Da。
下表1将从NMR光谱测量获得的Mn值(以Da计)与从供应商获得的Mn值进行比较。该表还列出了从供应商获得的Mw和Mp值(以Da计)。
表1–用于葡聚糖标准物的分子量参数
Mn值之间存在良好的一致性，如使用NMR光谱利用从供应商获得的数据测量的。对于所述三种葡萄糖标准物，如通过NMR光谱测量的Mn值分别对应于6.4个、17.4个和49.9个葡萄糖单元。
葡聚糖原料的NMR表征
对用于产生实施方案的硫酸葡聚糖的葡聚糖原料进行NMR光谱研究。葡聚糖(Pharmacosmos，葡聚糖1，批号345349)由来自肠膜明串珠菌B512F的酶葡聚糖蔗糖酶产生。
在D2O中制备葡聚糖的NMR样品，并通过2D 1H/13C NMR光谱进行详细分析。从在25℃下于D2O中获得的一组2D NMR谱获得几乎完整的1H/13C化学位移分配，参见表2。结果表明，葡聚糖基本上是无支链的，即几乎完全由通过α-(1→6)-糖苷键连接在一起的葡萄糖环组成。未能观察到α-(1→3)-糖苷分支，这意味着任何此类分支都低于0.5％。此外，所述数据显示，总分支<1％，包括α-(1→2)-、α-(1→3)-和α-(1→4)-支化。
表2-葡聚糖1(25℃，D2O)的1H和13C化学位移分配
值得注意的是，具有游离异头碳(C1末端环)的末端葡萄糖环以α-构型(42％)和β-构型(58％)存在(如基于观察到的1H/13C化学位移)。使用1D 1H谱中的各种H1基团的积分值，将每个葡聚糖分子中的平均葡萄糖单元数测定为5.1个葡萄糖单元，并且平均分子量被测定为852Da。支化度被测定为小于1％。图1举例说明聚焦在具有葡聚糖信号的区域上的1D 1H谱的扩展。
硫酸葡聚糖的NMR表征
在本研究中，已将实施方案的硫酸葡聚糖的3个批次(批号1、2和3)与以下从TdB Consultancy获得的3种硫酸葡聚糖产物进行了比较：硫酸葡聚糖5LS(产品编号DB005，批号20288，低硫酸化，分子量5kDa)、硫酸葡聚糖5HS(产品编号DB004，批号20281和20300，高硫酸化，分子量5kDa)和硫酸葡聚糖3(批号20341，高硫酸化，分子量3kDa)。
NMR样品
一般NMR评论
硫酸葡聚糖由具有各种硫酸化模式、支化和大小以及端基构型和化学差异的相似但不相同的分子的分布组成。这导致了挑战性的结构分析。硫酸葡聚糖的NMR谱是复杂的，见图2，该图举例说明了葡聚糖原料与硫酸葡聚糖的1D 1H NMR谱的比较。因此，尽管与定量1D 1H NMR技术相比，2D NMR的定量性能通常不太准确和精确，但也可能必需使用2D谱的定量数据。
几乎不存在关于该主题的NMR出版物(Neville等，J.Pharm.Sci.,80(3):239-244(1991)和Ludwig-Baxter等，J.Pharm.Sci.,80(7):655-660(1991))。在硫酸化的葡萄糖中，1H化学位移通常随着至每个引入的硫酸根基团的距离而逐渐向低场移动(较高的化学位移)。另一方面，13C化学位移表现不同，且效应取决于碳与硫酸根基团之间的共价键数。如果硫酸根与此碳相连，则碳的13C化学位移将增加4-10ppm，而如果硫酸根与相邻的碳结合，则化学位移效应较小但相反。对于连接至更远的碳的硫酸根基团，效应通常很小。预期支化后具有对13C化学位移的相似效应。总之，13C化学位移是更有用的报告子，因为它们主要取决于局部几何形状，诸如二面角以及附近共价结合的原子类型(通常相隔2-4个键)。
端基表征
与葡聚糖相比，硫酸葡聚糖的NMR谱更复杂，因为对于硫酸化/非硫酸化的C2、C3和C4以及C1和C6端基的所有组合，源自各种化学环境的NMR信号数量显著增加。
即使C1端基因例如β-构型中的硫酸化的C1与无硫酸化的C2的非端基C1的峰之间的重叠而被复杂化，但因光谱特征，C1端基(游离异头碳)比C6端基更容易分析。位于1H谱的C1区中的大的残留水信号也使分析复杂化。
图3举例说明覆盖有葡聚糖原料(葡聚糖1)的相应谱的批号1的硫酸葡聚糖在25℃下的2D 13C-1H HSQC谱。该图举例说明了每个H1/C1基团至特定硫酸化状态的暂时分配。该图指示属于C1-末端葡萄糖单元的峰和属于丰富的中间和C6-末端葡萄糖环的峰。忽略因C6-末端葡萄糖环中的C6的可能硫酸化而产生的效应。
图4举例说明来自批号3的硫酸葡聚糖在25℃下的1D 1H NMR谱。该图举例说明每个H1峰至特定硫酸化状态的暂时分配。该图指示属于C1-末端葡萄糖单元的峰和属于丰富的中间和C6-末端葡萄糖环的峰。特别地关于C3和C4的硫酸化的分配是暂时的，并且忽略了因C6-末端葡萄糖环中的C6的可能硫酸化而产生的那些效应。
图6举例说明来自批号1-3的硫酸葡聚糖在25℃下的1D 1H NMR谱中的硫酸葡聚糖区域的比较。
除低硫酸化的硫酸葡聚糖外的所有TdB样品都在C1-末端被修饰。C1的13C NMR化学位移约为74-80ppm。这表明修饰必须涉及羟基的取代，并且取代基团不经由氧结合。因此，该C1-修饰不是硫酸根或磷酸根，其也不能为从化学位移考虑的氯。
表3-C1端基特征
支化
数据不排除在硫酸葡聚糖样品中存在葡聚糖支化。然而，如果存在任何这此类支化，则其处于非常低的水平，<1-2％。
硫酸葡聚糖的硫酸化度和其它化学修饰的程度
已经主要使补充有1D 1H NMR数据的2D 1H-13C HSQC数据测定硫酸化。对于C2、C3和C4的总硫酸化程度，可从1H-13C HSQC谱中2D峰的积分获得估计值。使用C1峰作为这三个邻居的报告子，从组合的1D和2D数据估计平均各个C2和C3硫酸根水平。C4的硫酸化不能被测定，但通过使用总体C2-C4硫酸化的数据，C4硫酸化的平均程度必须低得多，绝对<70％。
表4-硫酸葡聚糖的硫酸化程度
*因经修饰的C1末端而未被测定。
由于光谱重叠，仅预防作为精确积分的估计值
γ以每个C2-C4单元的硫酸根的百分比和总数给出
除了C2-C4硫酸化的研究之外，端基的硫酸化程度的表征也概述于上表4中。值得注意的是，如果存在端基β-C1，则硫酸化度高得多，与平伏位置处的硫酸根的空间位阻较小一致。
请注意，α-和β-构型经由开放醛状态处于平衡状态，然而，这不容易被观察到，但始终处于非常低的水平。
分子量和大小
被研究的各批次硫酸葡聚糖的所有分析证书将Mw报告为分子大小量度。另外，已测定了关于硫酸葡聚糖批号1-3的光散射数据(见附录1)，报告了Mw和Mn。目前的NMR数据主要基于端基分析(即端基的峰面积对比中间基团的峰面积(NMR峰面积)之间的比率)提供Mn作为输出。测定葡聚糖原料上的葡萄糖单元的平均数，并所述平均数经证实与相应的硫酸葡萄糖批次的NMR数据完全一致。
表5-硫酸葡聚糖样品的以Da表示的分子大小特征
硫酸葡聚糖样品(硫酸葡聚糖3除外)的数据与每个硫酸葡聚糖分子～5个葡萄糖单元的平均分子大小完全一致。
表6-来自不同技术的以Da表示的分子量数据的比较
已使用SEC获得Mw(分析证书)
如通过NMR测定的分子量参数与表6中所列的另外的分子量参数之间的这种巨大差异可以通过硫酸葡聚糖的分子量通常使用更间接的方法(如凝胶排阻/渗透色谱法、光散射或粘度)进行测定来解释。所有这些方法反而报告了分子大小。这意味着如果硫酸葡聚糖分子形成各种聚集体或复合物，则更高的表观分子量被测定。
这些间接方法反而报告了分子体积和形状，所述分子体积和形状可能不仅在批次间而且还在同一批次内的样品间显著不同，这取决于例如硫酸葡聚糖材料是被如何储存的，其在测量之前是如何制备的等。
硫酸葡聚糖的深入结构表征
基于对硫酸葡聚糖批次3获得的一组1D和2D NMR数据的全面分析，进行严肃的尝试以进一步在原子分辨率下理解该硫酸葡聚糖样品的硫酸化模式。鉴于硫酸葡聚糖批次1和2的1D 1H和2D 13C-1H HSQC谱的密切相似性，假定该部分中呈现的结果对于实施方案的硫酸葡聚糖批次是有效的。
总硫酸化程度和样品组成
从概述的角度出发，13C-1H HSQC谱允许测定硫酸化程度的相对准确的估值，见图7。硫酸葡聚糖批号3在C2、C3和C4位置处具有每个葡萄糖单元平均2.4±0.1个硫酸根基团。图7的每个峰对应于具有不同化学环境的C-H键。峰面积大致对应于每个C-H键的群体。观察到三个不同的区域，这使得能够定量葡聚糖硫酸化的总体程度。在顶部，1D 1H谱的相应区域被对齐。
使用每个葡萄糖单元2.66个硫酸根和5.1个葡萄糖单元的平均值，假定样品由100％硫酸葡聚糖组成，硫的计算重量％为约19％。
C2、C3和C4处的硫酸化的研究
由于高度重叠的区域，几乎完全使用位于不同种类的葡萄糖单元的H1/C1基团的1H/13C化学位移和相应的峰面积研究硫酸化模式。基于葡聚糖的1H/13C化学位移分配、文献数据，特别是基于获得的2D NMR数据，将H1/C1信号暂时分配给具有各种化学环境和硫酸化程度的特定C1基团。该分配描绘于图3和图4中。
基于1D 1H峰和相关峰积分的分配和测量，C1-末端葡萄糖的异头C1-基团的构型群体似乎已移至更相等的0.49:0.51比率(对于α:β构型而言)，从而假定葡聚糖本身的平均长度在进行化学硫酸化程序后未曾改变。游离α-C1基团被硫酸化至～30％，而β-C1的硫酸化程度经估计明显高于83％和为约83％。
关于测定C2、C3和C4的硫酸化程度，对于绝对高度硫酸化(>95％)的C2来说，分析是最容易的，并且假定正确地估计了C1-末端葡萄糖的α:β构型的比率，硫酸化度计算为～99％。对于参与α(1→6)糖苷键的葡萄糖单元C1(即中间和C6-末端环以及具有游离C1的C1-末端葡萄糖单元)，C3被硫酸化至82％。对于具有硫酸化C1的C1-末端葡萄糖单元，C3的硫酸化似乎较高，～86％。每个C4的硫酸根数量的计算更为困难，但通过使用每个葡萄糖环2.4个硫酸根的总体比率和C2的99％的硫酸化、C3的82％的硫酸化，硫酸化程度估计为～60％。
来自Meito的葡聚糖和硫酸葡聚糖的NMR表征
使用先前建立的用于葡聚糖和硫酸葡聚糖样品的结构表征的1D 1H和2D 13C-1H HSQC NMR方法，研究了从Meito Sangyo Co.,Ltd.获得的葡聚糖和硫酸葡聚糖样品。
NMR样品
PN004-99-04通过将43.4mg来自Meito Sangyo Co.,Ltd.的葡聚糖(批号TL-2385)溶解在520μl D2O中来制备NMR样品。
PN004-99-05通过将58.7mg来自Meito Sangyo Co.,Ltd.的硫酸葡聚糖(批号N-3188)溶解在520μl D2O中来制备NMR样品。
NMR结果
葡聚糖中的葡萄糖单元的平均数被测定为11.7，Mn为1920Da。硫酸葡聚糖的硫18(Sulfur 18)的Mn经测定在4120Da至4200Da内(不包括任何钠抗衡离子)，以及在4710Da至4790Da内(具有钠抗衡离子)。α-构型中的C1端基的程度为59％，且支化程度估计为4.8％。
位置C2-C4的硫酸化程度经测定为76％(每个葡萄糖单元2.29个硫酸根基团)。C2位置的硫酸化程度估计为93％。α-构型中C1端基的程度为71％，且α-C1端基的硫酸化程度为83％。β-构型中的C1端基的硫酸化程度>90％。没有检测到除了硫酸化以外的C1端基的化学修饰。
不同硫酸葡聚糖分子的生物效应的比较
本研究比较了不同硫酸葡聚糖分子的各种生物效应，表明了本实施方案的硫酸葡聚糖具有优异的生物效应并且是无毒的。
关于具有不同平均分子量的分子量硫酸葡聚糖对造血细胞的动员的比较
动物
将雌性DBA/2OIa小鼠(Harlan，Holland)保存在乌普萨拉大学(Uppsala University)的动物设施中，在标准条件下饲养，并随意提供食物和水。使用重为17-22g的动物。
实验设计
将DBA/2-雌性分为4组：1)媒介物(NaCl水溶液)(n＝8)，2)50mg/kg硫酸葡聚糖3，DS3，(n＝5)，3)50mg/kg硫酸葡聚糖批号3(n＝5)和4)50mg/kg硫酸葡聚糖批号3，PNB，(n＝5)。组4)用戊巴比妥钠(PNB)替代异氟烷来进行镇静，以评价麻醉方案的变化是否影响动员。
物质的施用
将实施方案(批号3)的硫酸葡聚糖和硫酸葡聚糖3(TdB Consultancy，批号20341，DS3)溶解在0.9％NaCl(Fresenius Kabi)中至20mg/mL，并通过20μm过滤器过滤以获得无菌溶液。动物通过尾静脉静脉内接受2.5mL/kg(施加50μL)。
血液学分析
结果示于图8和表7中。硫酸葡聚糖3在整个WBC或淋巴细胞中没有显示任何显著的改变，然而报告了中性粒细胞的略微减少。
表7-硫酸葡聚糖物质施用后的外周血中的血液学变量
MVC＝平均红细胞体积；MCHC＝平均血细胞血红蛋白浓度
相校于媒介物(NaCl)的血液学变量：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
硫酸葡聚糖3没有诱导CFC数量的显著增加，如图9所示。硫酸葡聚糖批号3诱导HGF的显著增加，这与麻醉的使用无关，而较低分子量的物质3未显示HGF的显著增加，见图10。本文提供的数据表明，相较于实施方案的硫酸葡聚糖，硫酸葡聚糖3是较差的动员剂。硫酸葡聚糖3未使HGF增加至超过媒介物的任何程度。
分子量硫酸葡聚糖在MOG1-125诱导的慢性EAE中的预防性治疗的比较
本研究的目的是比较实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)与硫酸葡聚糖5HS(TdB Consultancy，批号20300)在MOG1-125诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中的预防性治疗效果。
动物
所有动物实验均按照美国国立卫生研究院(National Institute of Health,NIH)实验动物护理和使用指南进行，并经芬兰国家动物实验委员会(Finnish National Animal Experiment Board)批准。在实验中使用了总共90只雌性Dark Agouti大鼠(体重为120-170g，购自Harlan Laboratories,UK)。将动物在标准温度(22±1℃)下和轻度受控的环境(从上午7点至晚上8点照明)中圈养，随意获得食物(Harlan 2016)和水。动物分组如下：
组1：15只EAE大鼠,在MOG EAE接种后第0天开始用媒介物(盐水)s.c.处理(每日一次，每周3次)并按照给药方案持续进行直至终点。
组2：15只EAE大鼠，在接种后第0天开始用硫酸葡聚糖5HS(TdB Consultancy，批号20300)(30.0mg/kg)s.c.处理(每日一次，每周3次)并按照给药方案持续进行直至终点。
组3：15只EAE大鼠，在接种后第0天开始用根据实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)(30.0mg/kg)s.c.处理(每日一次，每周3次)并按照给药方案持续进行直至终点的EAE大鼠。
EAE的诱导和临床评分
通过在尾部的基部皮内施用100μL接种物诱导了EAE。接种物由20μg用含有200μg热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(菌株H 37RA；Difco,Detroit,MI)的不完全弗氏佐剂(IFA)(Sigma F5506)(1:1)乳化的PBS(0.01M)中的重组MOG1-125(NordicBioSite)组成。
每天进行临床评分，持续36个研究日(从第0天开始，并持续至终点第35天)。在研究期间以盲法并根据下面所列的临床评分原则进行临床评分。
累积疾病指数(CDI)表示为研究过程中的累积疾病负担，即临床评分值的总和。疾病发作(DO)表示首次观察到EAE的可见症状(临床评分值≥0.5)时的研究日。
研究中的所有老鼠按照以下给药方案在0和34天之间接受硫酸葡聚糖或相应的媒介物：
组1每周三次(周一-周三-周五)在上午7-11点之间接受皮下(s.c.)施用的媒介物(盐水，9mg/ml，Baxter)。媒介物的给药体积为5.0ml/kg。在诱导MOG EAE后第0天开始媒介物施用，并持续至研究第32天或研究第33天，这取决于接种的工作日和给药方案。
组2每周三次(周一-周三-周五)在上午7-11点之间接受皮下(s.c.)施用的剂量为30.0mg/kg的硫酸葡聚糖5HS(TdB Consultancy，批号20300)。给药体积为5.0ml/kg。在诱导MOG EAE后第0天开始施用，并持续至研究第32天或研究第33天，这取决于接种的工作日和给药方案。
组3每周三次(周一-周三-周五)在上午7-11点之间接受皮下(s.c.)施用的剂量为30.0mg/kg的根据实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)。给药体积为5.0ml/kg。在诱导MOG EAE后第0天开始施用，并持续至研究第32天或研究第33天，这取决于接种的工作日和给药方案。
终点组织和血浆收集
在终点时，在第35天，用戊巴比妥(60mg/ml,Orion Pharma)深度麻醉所有大鼠。之后，经由心脏穿刺收集血液样品。将总共800-1000μl血液收集至Li-肝素微量管中，并在+4℃下以2000x G离心10分钟。将两个200μl的血浆等分试样收集至两个单独的血浆收集基质聚丙烯管中，在干冰上冷冻并在-80℃储存直至用于进一步分析。
为了组织学样品，用冷的肝素化(2.5IU/ml)盐水经心脏灌注大鼠10分钟，然后用冷的4％的0.1M磷酸盐缓冲液中的多聚甲醛灌注至少10分钟。将小脑和脑的其余部分以及脊髓的C和T段(各1cm)切除，并通过在+4℃下浸入在4％的于0.1M磷酸缓冲液中的多聚甲醛中持续至少24小时来进行后固定。然后将样品更换至含有0.001％叠氮化钠(Sigma)作为防腐剂的0.01M PBS中，在+4℃下储存直至用于可能的组织学分析。
一般健康状况和人道终点
实验室人员每日进行两次动物监测(上午8点和下午4点)。如果动物的一般健康状况明显恶化，则通过过剂量的CO2和颈部脱位来对大鼠实施安乐死。将安乐死的大鼠和被发现死亡的大鼠在死亡后尽可能快地进行肉眼检查。当尸检不及时时，将尸体在约4℃下冷藏，直至在Charles River DRS,Finland进行尸检。可接受的终点的定义包括：在24小时观察期间无自发运动和无法饮水或饮食、大量出血、自发性炎症、缺失解剖学结构、肿胀或肿瘤。
判断大鼠安乐死的模型(EAE)特异性终点包括：临床评分达到4级(所有肢体部分无力或偏瘫)、翻正反射>30秒和体重从基线下降超过25％。
统计分析
所有值均以平均值±标准偏差(SD)或平均值(SEM)的标准误差表示，且差异在P<0.05水平上被认为是统计学上显著的。通过使用StatsDirect统计软件进行统计分析。通过使用单因素方差分析，然后进行Dunnet检验(与媒介物处理组比较)分析平均值之间的差异。用Kruskal-Wallis ANOVA(组间)分析非参数数据。
体重
每天从第0天开始监测大鼠的体重，并持续至终点第35天。在研究期间，组2和3中的所有大鼠获得与媒介物组1相似的体重(p>0.05)。
疾病发病率和生存率
对于研究中的所有大鼠，各组的死亡率如下：
组1：40％(6/15)；
组2：20％(4/15)；和
组3：7％(1/15)。
累积疾病指数
累积疾病指数(CDI)表示36天期间的临床评分值的总和；从接种第0天至终点第35天。高指数值代表晚期疾病，而低指数值表示轻度症状。
皮下施用的硫酸葡聚糖化合物和媒介物对累积疾病指数的影响示于图11中。媒介物组动物(组1)与组2之间的累积疾病指数无显著差异。然而，与媒介物相比，组3中的硫酸葡聚糖处理使平均CDI降低31％。
因此，根据实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)相较于具有EAE的受试者的硫酸葡聚糖5HS具有如通过CDI评估的改善的生物效应。
EAE是中枢神经系统(CNS)的炎性脱髓鞘疾病的动物模型。其作为人CNS脱髓鞘疾病(包括多发性硬化症(MS)和急性播散性脑脊髓炎(ADEM))的动物模型而被广泛研究。因此，实施方案的硫酸葡聚糖似乎在治疗或至少减少MS和ADEM的症状方面具有有益作用。
硫酸葡萄糖分子之间的毒性比较
在2周观察期期间评价通过i.v.注射施用的单剂量硫酸葡聚糖对Spraque-Dawley大鼠的毒性。这些实验中使用的媒介物是75mM的于0.9％NaCl中的CAM。
在本研究中，通过以剂量水平70和140mg/kg单次推注注射给雄性Sprague Dawley大鼠提供实施方案的硫酸葡聚糖(批号3)和由Meito Sangyo Co.,Ltd.产生的硫酸葡聚糖(DS-18)(批号N-3188和N-3190)，观察期为14天。该研究总共包括如下7个组：一个对照；DS-S18，批号N-3188；DS-S18，批号N-3190；以及硫酸葡聚糖批号3，见表8。除了硫酸葡聚糖批号3，70mg/kg(其中包括10只动物)外，每个剂量组包括五只动物。对来自研究中的所有动物的肺和对用硫酸葡聚糖批号3处理的组中的选定器官(肾上腺、具有骨髓的股骨、心脏、肾、肝、肠系膜淋巴结、脾、胸腺和注射部位)进行病理学研究。
表8-实验设计
研究中没有发生死亡。在给药当天(第1天)，在所有组中在给药后约10分钟，接受硫酸葡聚糖的动物显示呼吸困难，具有一定程度的剂量关系。在被给予140mg/kg的动物中观察到最高的发病率。除接受140mg/kg DS-S18(批次N-3188)的那些动物(其中在5只动物的4只中显示中度呼吸困难)外，在大多数动物中观察到的严重性是轻微的。在剩余观察期(第2-15天)期间，大多数被给予140mg/kg DS-S18的动物(两个批次)显示呼吸困难。一只被给予硫酸葡聚糖批号3的动物在第6-15天显示呼吸困难。
在组织学检查中，在肺中观察到用测试化合物给药的动物中的处理相关变化，并且该变化由肺泡组织细胞增多和肺泡间隔增厚/增加的细胞结构(cellularity)组成。在接受140mg/kg的两批测试化合物DS-S18的大多数动物中注意到这些变化的发生率和严重性增加。10只接受70mg/kg的硫酸葡聚糖批次3的动物中只有1只单个动物显示最小的变化，且接受140mg/kg的5只动物中有3只显示最小至中度的发现。除了肺部发现以外，还在所有剂量组中在脾中均注意到髓外血细胞生成的程度略有上升，然而这被认为具有问题的毒理学意义。
表9–经处理的动物的肺中的微观变化的发生率和严重性
在本研究中测试的化合物中，硫酸葡聚糖批号3显示不如DS-18显著的肺毒性。
来自Sigma-Aldrich的硫酸葡聚糖的NMR分析
已使用1D 1H和2D 13C-1H HSQC NMR光谱测定了来自Sigma-Aldrich(产品编号31404)的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)的结构特征。来自Sigma-Aldrich的关于硫酸葡聚糖(产品编号31404)的分析证书指示5000Da的分子量(Mr)，并且平均硫含量为17％，这相当于每个葡糖基残基约2.3个硫酸根基团。
通过将35.9mg来自Sigma-Aldrich(产品编号31404)的硫酸葡聚糖溶解在510μl D2O中来制备NMR样品。
结果
葡萄糖单元数：26-50个
Mn：8600-16900Da
α-构型中的C1的程度：未测定但>50％(α-构型>>β-构型)
硫酸化的C2-C4的程度：74％
硫酸化的α-C1端基的程度：49％
硫酸化的β-C1端基的程度：未测定
测定硫酸葡聚糖分子中的葡萄糖单元数的最精确方法是同时分析用作硫酸葡聚糖生产原料的相应葡聚糖。由于没有关于相应葡聚糖的NMR数据，2D 13C-1H HSQC光谱中的4.8-5.2ppm的区域中的光谱重叠(见图14)阻止β-端差异构体构型中的级分端基C1以及硫酸化的β-C1端基的程度的定量。图13举例说明来自Sigma Aldrich的硫酸葡聚糖(产品编号31404)的1D 1H NMR谱。
因此，将样品硫酸葡聚糖(产品编号31404)中计算的葡萄糖单元数量作为区间报告，其中α-构型中的末端C1的程度在50％至100％的范围内。2D 13C-1H HSQC谱数据在β-C1端基的预期区域中未显示任何信号，表明葡萄糖单元的数量位于所报告区间的上部。
讨论
NMR结果表明，来自Sigma-Aldrich(产品编号31404)的分子量为Mr 5000Da的硫酸葡萄聚糖的分子量实际上具有如通过NMR光谱测量的在8600Da至16900Da的区间内的数均分子量Mn。
来自不同制造商的硫酸葡聚糖的功能测试
本研究的目的是研究和比较来自不同制造商的硫酸葡聚糖在离体人测定中对活化部分凝血活酶时间(APTT)的功能影响。
APTT是表征血液凝固的医学测试。除了检测血液凝固中的异常之外，其也是接触激活途径和共同凝血途径的功效的性能指标。
方法和设备
根据制造商的说明，使用Diagnostica Stago的4在人血浆中测量APTT。将硫酸葡聚糖在初始pH为5.9的75mM柠檬酸盐缓冲液中溶解至1mg/ml，然后添加至人血浆中至10μg/ml的最终硫酸葡聚糖浓度。
分析来自Meito Sangyo Co.,Ltd.,Japan的4个不同硫酸葡聚糖批次(N-3178、N-3179、N-3180、N-3181)、来自Sigma–Aldrich,U.S.的一个硫酸葡聚糖批次(平均分子量5000Da，产品编号31404)和根据实施方案的两个硫酸葡聚糖批次(批号1和批号2)。从每个批次处理四个单独称重的样品，并且对于这些样品中的每一个样品以一式两份测量APTT。所有样品处理均在同一天并行进行。在第二天，对所有样品进行所有APTT测量以获得可比较的结果。
在APTT分析中使用血浆而非全血使分析更加稳健，并且结果变化较小。
结果
APTT分析的结果示于下表10中。APTT的基线是作为阴性对照测量的血浆。
表10-硫酸葡聚糖处理后血浆中的APTT
如对于根据实施方的硫酸葡聚糖和来自其它制造商的硫酸葡聚糖所测量的，APTT存在显著差异。具体地，相较于根据实施方案的硫酸葡聚糖，来自Sigma-Aldrich的硫酸葡聚糖(5000Da，产品编号31404)导致显著更高的APTT。
上述实施方案将被理解为本发明的几个说明性实例。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可对实施方案进行各种修改、组合和改变。特别地，在技术上可能的情况下，可将不同实施方案中的不同部分解决方案组合在其它构型中。然而，本发明的范围由所附权利要求限定。
附录1
在由Agilent 1260 Infinity系列HPLC系统和连接的MiniDAWN TREOS光散射检测器(Wyatt Technologies)组成的尺寸排阻色谱多角度激光散射(Size-Exclusion Chromatography MultiAngle Laser Light Scattering,SEC-MALLS)系统上进行光散射实验。在光散射实验中使用以下分析参数：
·流量＝1.00mL/分钟。
·柱/dRI检测器温度＝40℃
·收集间隔＝0.5秒。
·注射体积＝10μL
·Dn/dc＝0.1470mL/g
·MALLS波长＝656nm
·校准常数(MALLS)＝4.7303×10^-5 1/(V cm)
将硫酸葡聚糖样品溶解在2mL 0.1M硝酸钠(NaNO3)中，以400ppm叠氮化钠(NaN3)作为流动相(洗脱剂)。