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1、(10)授权公告号 CN 102000062 B (45)授权公告日 2012.08.22 CN 102000062 B *CN102000062B* (21)申请号 201010521807.1 (22)申请日 2010.10.27 A61K 31/357(2006.01) A61P 3/10(2006.01) (73)专利权人 大理学院 地址 671003 云南省大理市古城区学府路 (72)发明人 杨自忠 周琪 王琳 杨明慧 巫秀美 赵昱 谭仁祥 CN 101829094 A,2010.09.15, (54) 发明名称 E 环溴取代水飞蓟宾用于制备糖苷酶抑制剂 的药物用途 (57) 摘要 。
2、本发明涉及 E 环溴取代水飞蓟宾用于制备糖 苷酶抑制剂的药物用途， 具体而言， 本发明公开了 一个 E 环溴取代的水飞蓟宾酯型黄酮木脂素或其 可药用盐用于制备抑制 - 葡萄糖苷酶、 防治 II 型糖尿病的药物之用途。该黄酮木脂素具有极其 显著的抑制 - 葡萄糖苷酶的活性， 其在 40 微克 / 毫升浓度时对 - 葡萄糖苷酶的抑制活性强度 已达到 77.1， 通过测定其半数抑制浓度显示 ： 该黄酮木脂素抑制 - 葡萄糖苷酶的强度是阳性 对照药物阿卡波糖的32倍。 药效学结果表明该黄 酮木脂素或其可药用盐可预期作为糖苷酶抑制剂 药物尤其是防治 II 型糖尿病的药物之用途。 (51)Int.Cl. 。
3、(56)对比文件 审查员 温涛 权利要求书 1 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 1/1 页 2 1. 具有式 (1) 所示结构之 E 环溴取代的水飞蓟宾酯或其可药用盐在制备防治 II 型糖 尿病的药物中的用途 ； 式(1)化合物的名称为 ： ()-2-2， 3-二氢-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-2-羟 甲基 -1， 4- 苯并二氧六环 -6-2， 3- 二氢 -3， 5， 7- 三羟基 -4H-1- 苯并吡喃 -4- 酮。 2.具有式(1)所示结构之E环溴取代的水飞蓟宾酯或其可药用盐在制备抑制-葡萄 。
4、糖苷酶的降糖药物中的应用 ； 式(1)化合物的名称为 ： ()-2-2， 3-二氢-3-(3-溴-4-羟基-5-甲氧基苯基)-2-羟 甲基 -1， 4- 苯并二氧六环 -6-2， 3- 二氢 -3， 5， 7- 三羟基 -4H-1- 苯并吡喃 -4- 酮。 权 利 要 求 书 CN 102000062 B 2 1/7 页 3 E 环溴取代水飞蓟宾用于制备糖苷酶抑制剂的药物用途 技术领域 0001 本发明涉及医药技术领域， 具体而言， 本发明涉及一种 E 环溴取代的水飞蓟宾酯 型黄酮木脂素或其可药用盐用于制备抑制-葡萄糖苷酶、 防治II型糖尿病也即非胰岛素 依赖型糖尿病药物中的用途， 该黄酮木脂。
5、素具有极其显著的抑制 - 葡萄糖苷酶的活性， 其在 40 微克 / 毫升浓度时对 - 葡萄糖苷酶的抑制活性强度已达到 77.1， 通过测定其 半数抑制浓度显示 ： 该黄酮木脂素抑制 - 葡萄糖苷酶的强度是阳性对照药物阿卡波糖的 32 倍， 因此该化合物或其可药用的盐， 以及与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成的药物 组合物可预期作为糖苷酶抑制剂药物尤其是防治 II 型糖尿病也即非胰岛素依赖型糖尿病 药物之用途。 背景技术 0002 随着科技进步和生活水平的提高， 在全球范围内， 糖尿病的发病率正在提高。 据统 计， 糖尿病发生在约 3的人身上， 全世界患者总人数已超过一亿两千万， 造成国民经济的。
6、 重大损失。 0003 糖尿病是临床常见的内分泌代谢性疾病。西医认为糖尿病病人可分为两种 ： 即 I 型糖尿病 ( 或称胰岛素依赖型， IDDM) 和 II 型糖尿病 ( 或称非胰岛素依赖型， NIDDM)， 其中 II 型糖尿病更广， 危害更大。我国糖尿病患者有 2000 万以上， 其中近 90为 II 型糖尿病。 随着生活方式、 饮食习惯的改变， 以及科技和医疗水平的发展， 检测早期糖尿病水平不断提 高等因素， 世界各国预期寿命和糖尿病发病率都在不断提高。该病在我国更是出现了多发 性、 年轻化的特点， 给国民经济和生产力发展造成了非常大的损失。 0004 目前治疗 II 型糖尿病的口服药物。
7、有磺酰脲类、 双胍类、 - 糖苷酶抑制剂类和胰 岛素增敏剂类四大种类， 但各具优缺点。- 糖苷酶抑制剂是上世纪 70 年代开始兴起的 新的治疗 NIDDM 之研发理念。此为治疗磺胺类药物继发无效之 II 型糖尿病的补充治疗手 段。文献报道， 使用竞争性 - 糖苷酶抑制剂， 可以推迟淀粉、 蔗糖等糖类化合物在消化道 内的转化和吸收， 减轻肾脏负担 ； 抑制饭后血糖急剧上升， 使血糖浓度在一天内变化波动幅 度减小。此乃有效抑制糖尿病患者前期的葡萄糖调节受损尤其是葡萄糖耐量受损 (IGT) 阶 段， 许多尚未发病的糖尿病潜在患者仍处于此阶段当中。德国拜耳公司研制的 - 葡糖苷 酶抑制剂阿卡波糖 (a。
8、carbose) 于 1990 年在德国上市， 现已成为多个国家， 包括我国， 治疗 II 型糖尿病的一线用药， 其商品名为拜糖平。亚太地区 II 型糖尿病政策研究组 2005 年给 出治疗指南， 将 - 葡糖苷酶 (-glucosidase) 抑制剂作为降低餐后血糖的首选用药。各 国针对新的 - 葡糖苷酶抑制剂暨降糖药物展开激烈竞争。日本开发的 - 糖苷酶抑制 剂 voglibose( 伏格列波糖 ) 也已于 1994 年上市。然而其居高的价格必将受到新型低廉 创新性同类药物的竞争。正在临床试验的 - 糖苷酶抑制剂还有 miglitol( 米格列醇 )、 emigliate等。 值得注意的是。
9、 ： 越来越多的已上市-糖苷酶抑制剂之不良反应也对更新换 代的新型抑制剂提出要求。 胃肠道副作用、 红斑、 皮疹和荨麻疹等皮肤过敏反应， 黄疸、 GOT、 GPT 上升等的严重肝功能障碍， 心脏系统风险等都是该类已上市药物的治疗盲区 参见 ： 李 说 明 书 CN 102000062 B 3 2/7 页 4 中芬，药物不良反应杂志 2001 年第 4 期 ； 杨晓辉等，中国药物警戒 2009 年 1 期 ； 等文 献报道 。因而， 积极发展更为强效、 安全的新型非生物碱类 - 葡糖苷酶抑制剂有着紧迫 性和必要性。 0005 基于此目的， 发明人曾完成多项开发新型 - 糖苷酶抑制剂类天然产物及其。
10、结 构改造衍生物的研究， 并发现多种抑制 - 葡萄糖苷酶活性的化合物， 从而说明从天然产 物及其合成衍生物中筛选出强效抑制 - 糖苷酶抑制剂的创新性降糖药物是可行的 参 见 ：“阿江榄仁酸在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用” ， 张荣平、 窦辉、 赵昱、 巫秀美等， CN 101416970 ；“桦木酸在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用” ， 郑汉其、 窦辉、 张荣平、 赵昱、 巫秀 美等， CN 101416971 ；“A 环多氧化取代的五环三萜类衍生物及其制备方法和用途” ， 赵昱、 冯菊红、 巫秀美、 白骅、 约阿施史托克希特， CN 101117349 ；“A 环和 C 环多氧化取代的五 环三。
11、萜及其制备方法和用途” ， 赵昱、 陈海永、 郑汉其、 巫秀美、 白骅、 约阿施史托克希特， CN 101117348。毋庸置疑， 继续从天然产物及其结构改造衍生物中寻找能够抑制 - 葡糖苷 酶的先导化合物是非常必要和紧迫的。 0006 此外， 在发明人长期积累的保肝类新药开发课题中， 涉及到了临床上大量使用的 一种天然药物 ： 即存在于菊科植物水飞蓟的种子中的水飞蓟素。水飞蓟已在临床上广泛 应用， 在市场上其商品名为 LegalonTM利肝隆或 FlavobionTM， 其代表性化合物当属黄酮木 脂素水飞蓟宾。黄酮木质素化合物属于杂木质素类， 是由一分子苯丙素和一分子黄酮结合 而成的一类天然。
12、产物。水飞蓟中水飞蓟宾含量最多， 活性也最高。该药作用主要有以下几 点 ： ( 一 ) 抗自由基活性 ： 水飞蓟素对于由四氯化碳、 半乳糖胺、 醇类和其他肝毒素造成的 肝损害具有保护作用。1990 年 Lotteron 等人报道了在小鼠肝微粒体内， 水飞蓟素能减少 由四氯化碳代谢引起的体外脂质过氧化及由还原型辅酶单独引起的过氧化作用， 这些都 表明水飞蓟素为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。( 二 ) 保护肝细胞膜 ： 通过抗脂质过 氧化反应维持细胞膜的流动性， 保护肝细胞膜。还能阻断真菌毒素鬼笔毒环肽和 - 鹅 膏蕈碱等与肝细胞上特异受体的结合， 抑制其对肝细胞的攻击及跨膜转运， 中断其肝肠循。
13、 环， 从而增强肝细胞膜对于多种损害因素的抵抗力。( 三 ) 促进肝细胞的修复和再生 ： 水 飞蓟宾进入细胞后可以与雌二醇受体结合， 并使之激活， 活化的受体可以增强肝细胞核内 RNA 聚合酶 1 的活性， 使 RNA 转录增强， 促进酶及蛋白质的合成， 并间接促进 DNA 的合成， 有利于肝细胞的修复和再生。( 四 ) 抗肿瘤作用 ： 各种活性氧能氧化鸟嘌呤形成 8- 羟基 鸟嘌呤， 造成 DNA 损伤， 进而引起肿瘤， 水飞蓟宾作为一个有效的抗自由基物质也显示了 预防和治疗肿瘤的作用。三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性 ( 参阅 Flora K. 等， Am.J.Gastro。
14、enterol， 1998， 93， 139-143 ； SallerR. 等， Drugs， 2001， 61(14)， 2035-2063 ；R.等， Curr.Med.Chem.， 2007， 14， 315-338 ；Z.等， Phytother. Res.， 2003， 17， 524-530 ；R. 等， Bioorg.Med.Chem.， 2004， 12， 5677-5687 ； Varga Z. 等， Phytothe.Res.， 2001， 15， 608-612 ； Singh R.P. 等， Curr.CancerDrug Tar.， 2004， 4， 1-11)。因此。
15、， 以水飞蓟宾为代表的黄酮木质素类化合物引起了越来越多的关注， 如发明人 于2006-2009年间制备并报道的多个系列水飞蓟宾类衍生物也具有显著的抗氧化活性(杨 雷香、 赵昱等，“Design， synthesis and examination of neuron protectiveproperties of alkenylated and amidated dehydro-silybin derivatives” ， Journal of Medicinal Chemistry， 2009， 52(23)， 7732-7752 ； 汪峰、 赵昱等，“Preparation of C-23。
16、 esterified 说 明 书 CN 102000062 B 4 3/7 页 5 silybin derivatives and evaluation oftheir lipid peroxidation inhibitory and DNA protective properties” ， Bioorganic and Medicinal Chemistry， 2009， 17(17)， 6380-6389 ； 杨雷香、 赵昱等，“Synthesis and antioxidant properties evaluation of novelsilybin analogues” ， Jo。
17、urnal of Enzyme Inhibition and MedicinalChemistry， 2006， 21(4)， 399-404 ； 等等 )。在发明人报道的上述文章中， 经发明人设计并合成出的多个 系列之 A 环、 B 环、 E 环、 和 23 位取代的黄酮木脂素类化合物都显示出强效捕获 DPPH 自由基 和超氧阴离子自由基的活性、 抗氧化活性、 以及保护PC12细胞的活性。 但是显而易见 ： 上述 研究仅集中于研究水飞蓟宾类黄酮木脂素的抗氧化作用和细胞保护作用。 0007 以水飞蓟宾及脱氢水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素化合物虽然具有以上所述之抗 氧化疗效， 然而未见其用于抑制糖苷。
18、酶、 治疗糖尿病方面的报道。黄酮木脂素类化合物治 疗 II 型糖尿病， 尤其是其用于抑制 - 葡萄糖苷酶的新用途尚未得到有效开发， 故此从黄 酮木脂素中寻找抑制 - 葡萄糖苷酶的活性化合物， 也即将黄酮木脂素结构改造使其具有 治疗 II 型糖尿病功效是一个崭新的领域。从其中发现高效抑制 - 葡萄糖苷酶的先导化 合物更是前人所未尝试过的挑战。为了探索这个领域， 我们设计并制备了与水飞蓟宾结构 有所差异的一种新的黄酮木脂素衍生物， 也即将原水飞蓟宾之 E 环模块改造为 3- 溴 -4- 羟 基 -5- 甲氧基取代模式， 改变整个分子共轭范围和共轭强度， 同时引入卤素溴原子和新的 氢键受体或给体。 。
19、如此设计可以生成新型空间结构不同于水飞蓟宾的一类新型木质素二氢 黄酮醇类化合物(也是一类新型黄酮木脂素化合物)， 以期发现能抑制-葡萄糖苷酶的黄 酮木脂素先导化合物， 从而将其进一步开发成具有能抑制 - 葡萄糖苷酶治疗 NIDDM 的创 新性药物。据此完成本发明。 发明内容 0008 本发明的目的是提供式(1)所示结构的E环溴取代的水飞蓟宾酯或其可药用盐用 于制备抑制 - 葡萄糖苷酶、 治疗 NIDDM 疾病药物之用途 ； 0009 0010 式 (1) 化合物的名称为 ： ()-2-2， 3- 二氢 -3-(3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基 苯基 )-2- 羟甲基 -1， 4- 苯并二。
20、氧六环 -6-2， 3- 二氢 -3， 5， 7- 三羟基 -4H-1- 苯并吡 喃 -4- 酮。 0011 本发明的另一目的是提供了一种制备式(1)所示的E环溴取代的水飞蓟宾酯类黄 酮醇木质素类化合物的方法， 该方法的合成工艺路线特征是 ： 0012 说 明 书 CN 102000062 B 5 4/7 页 6 0013 其中， OEt 指乙氧基 ； R1是溴原子 ； R2是甲氧基。 0014 具体通过以下步骤实现 ： 3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基取代的苯甲醛 (I-a) 在氯仿溶 液中和磷叶立德缩合得到 3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基取代的肉桂酸乙酯 (I-b)， 在无水。
21、四氢 呋喃中， 用氢化锂铝 - 三氧化铝于室温还原得到 3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基取代的对羟基肉 桂醇(I-c)。 二氢槲皮素(II)和I-c在无水苯和无水丙酮混合溶剂中， 以碳酸银为氧化剂， 经过氧化偶合得到式 (1) 所示的 E 环溴取代的水飞蓟宾类似物。 0015 本发明的另一个目的是提供了一种用于抑制 - 葡萄糖苷酶、 治疗 NIDDM 疾病的 药物组合物， 其特征为由含有治疗有效量的作为活性成分的式 (1) 化合物或者它的可药用 盐和可药用辅料组成的混合物。其药物剂型可以是片剂、 胶囊剂、 注射剂、 气雾剂、 栓剂、 膜 剂、 滴丸剂、 贴片剂、 皮下植埋剂、 外用搽剂、。
22、 口服液或软膏剂， 还可以采用现代制药界所公 知的控释或缓释剂型或纳米制剂。 0016 发明人设计的E环溴取代的水飞蓟宾酯型黄酮木脂素(1)与天然黄酮木脂素类化 合物水飞蓟宾相比较， 具有诸多结构和物化性质上差异化的特征， 包括其疏水性、 芳香性、 吉布斯自由能、 氢键受体、 电性、 分子间范德华力、 以及 3D 构象、 伸展方向、 分子重心、 电性 分布中心等特质均与水飞蓟宾有着明显不同 ； 且化合物(1)分子量比水飞蓟宾增大了78个 质量单位。上述特征都决定了式 (1) 所示化合物之三维构象与 - 葡萄糖苷酶之 3D 空间 结构相结合之配体 - 受体结合复合物形态和结合方式都可能产生较大的。
23、差别， 其结合位点 和结合模式、 其结合自由能等均会产生较大的改变， 因而可能在抑制 - 葡萄糖苷酶方面 有着意想不到的效果。 0017 我们测试了该化合物对 - 葡萄糖苷酶的生长抑制作用， 试验结果发现 ： 该黄酮 木脂素具有极其显著的抑制 - 葡萄糖苷酶的活性， 其在 40 微克 / 毫升浓度时对 - 葡萄 糖苷酶的抑制活性强度已达到 77.1。通过测定其半数抑制浓度显示 ： 该黄酮木脂素抑制 -葡萄糖苷酶的强度是阳性对照药物阿卡波糖的32倍。 以上药效学结果说明式(1)化合 物有着意想不到的抑制 - 葡萄糖苷酶效果， 从而可以预期该黄酮木脂素或其可药用盐可 预期作为糖苷酶抑制剂药物尤其是。
24、防治 II 型糖尿病也即非胰岛素依赖型糖尿病药物之用 途。 0018 综上所述， 我们制备的该黄酮木脂素既有结构上的独特性， 又有抑制糖苷酶作用 方面研究的新颖性， 并在降糖活性测试中发现了不寻常的抑制 - 葡萄糖苷酶的活性， 有 说 明 书 CN 102000062 B 6 5/7 页 7 望成为抑制 - 葡萄糖苷酶及治疗 NIDDM 之先导化合物。到目前为止， 尚无有关该化合物 治疗 NIDDM 疾病和制备抑制 - 葡萄糖苷酶药物的相关报道。黄酮木脂素式 (1) 化合物对 于 - 葡萄糖苷酶强效抑制属于意想不到的发现， 有着确切的原创性。 0019 本发明有益之处在于 ： 首次发现式 (1。
25、) 所示之 E 环溴取代的水飞蓟宾酯型黄酮木 脂素具有极其强效抑制-葡萄糖苷酶的功效、 并在防治NIDDM疾病方面具有成药潜力， 为 开发成为治疗 NIDDM 疾病创新药物、 开发抑制 - 葡萄糖苷酶之创新型降糖药物提供了新 的物质基础。具有潜在巨大的社会效益和经济效益。本发明再一特点为 ： 本发明之合成起 始物来源方便， 其制备方法简单易行， 成本低， 污染小， 利于节能减排条件下的大规模生产。 产业化前景十分明确。 具体实施方式 0020 本发明人通过多步简单合成， 并通过层析手段得到该能有效抑制 - 葡萄糖苷酶 活性的一个黄酮木脂素类活性化合物， 又经质谱和核磁共振波谱等综合解析推导出其。
26、化学 结构。本发明人发现， 式 (1) 化合物对 - 葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用。因此， 根据本 发明人的研究， 发明人所设计并合成的式 (1) 所示之 E 环溴取代水飞蓟宾类黄酮木脂素化 合物可以用于制备抑制 - 葡萄糖苷酶、 防治 NIDDM 疾病的药物和用于治疗 II 型糖尿病。 0021 为了更好地理解本发明的实质， 下面分别用式 (1) 化合物的制备及其对 - 葡萄 糖苷酶之抑制作用试验的结果， 说明其在制药领域中的新用途。实施例给出了式 (1) 化合 物的部分合成、 结构鉴定、 和活性数据。必须说明， 本发明的实施例是用于说明本发明而不 是对本发明的限制。 根据本发明的实质对本发。
27、明进行的简单改进都属于本发明要求保护的 范围。 0022 实施例 1 ： 式 (1)()-2-2， 3- 二氢 -3-(3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基苯基 )-2- 羟 甲基 -1， 4- 苯并二氧六环 -6-2， 3- 二氢 -3， 5， 7- 三羟基 -4H-1- 苯并吡喃 -4- 酮的制备 0023 1.1 仪器与试剂 ： 0024 紫外光谱用 Shimadzu UV-240 紫外分光光度计测定 ； 核磁共振氢谱 1H-NMR 由 INOVA 型超导核磁共振波谱仪 (VARIAN INOVA-400MHz) 测定 ( 四甲基硅醚 TMS 为内标 ) ； 电 喷雾质谱 ESI-MS。
28、 由 BrukerEsquire 3000+ 质谱仪测定， 柱层析用硅胶 (100-200， 200-300 和 300-400 目 ) 以及薄层层析用硅胶 GF254(10-40 目 ) 均由青岛海洋化工厂生产 ； 所用试 剂均为分析纯 ； 薄层制备层析 (PTLC) 用 Merck 公司的铝箔硅胶板 ； 柱色谱用葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 采用瑞典 Amersham Pharmacia Biotech AB 公司产品 ； 反相硅胶 RP-18 采 用日本 Fuji Silysia Chemical 公司的 Chromatorex 产品 ； MCI 为日本三菱化工公司产品， 薄。
29、板 (TLC) 检测用 254 和 365nm 的紫外灯 ； 显色剂用碘蒸气、 10硫酸 - 乙醇以及磷钼酸溶 液。 0025 1.2 关键中间体 I-c(3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基取代的对羟基肉桂醇 ) 的制备 ： 0026 说 明 书 CN 102000062 B 7 6/7 页 8 0027 在干燥， 氮气保护的反应瓶中加入 0.11 克氢化锂铝 (3 毫摩尔 )， 0.13 克三氯化铝 (1毫摩尔)， 缓慢加入10毫升无水四氢呋喃， 搅拌至无气体放出 ； 将溶有0.3克3-溴-4-羟 基-5-甲氧基肉桂酸乙酯(1毫摩尔， 自制)的5毫升无水四氢呋喃溶液缓慢加入反应物中， 于。
30、室温搅拌 1 小时后用 20盐酸酸化至 pH 2， 过滤， 硫酸镁干燥， 过滤， 浓缩得黄色油状 物， 经柱层析得浅黄色固体 0.19 克， 收率 73。Rf( 石油醚乙酸乙酯 3 1) ： 0.12 ； 核 磁共振氢谱 1HNMR(400MHz， 氘代氯仿) ： 3.85(单峰， 3H， OCH 3)， 4.49(双峰， J5.4Hz， 2H， H-9)， 6.25(dt 峰， J 5.4， 16.0Hz， 1H， H-8)， 6.44( 双峰， J 16.0Hz， 1H， H-7)， 6.97( 单 峰， 1H， H-2)， 7.08(s， 1H， H-6) ； 电喷雾质谱 ESI-MS 。
31、： m/z 257M-H+。 0028 1.3 化合物 (1) 的制备 0029 0030 在干燥氮气保护的反应瓶中投入 80 毫克二氢槲皮素 ( 本室自制， 纯度大于 98 (HPLC)， 103 毫克 3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基肉桂醇和 88 毫克碳酸银， 注入 5 毫升无水丙酮 和 20 毫升无水苯， 于 55-60之间保温 3.5 小时， 过滤， 母液浓缩， 柱层析 ( 氯仿乙酸乙 酯甲酸 25 1 0.25) 分离得浅黄色粉末 52 毫克， 收率 35。 0031 ()-2-2， 3- 二氢 -3-(3- 溴 -4- 羟基 -5- 甲氧基苯基 )-2- 羟甲基 -1， 4。
32、- 苯并二 氧六环-6-2， 3-二氢-3， 5， 7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 ： Rf(氯仿乙醇201) ： 0.16 ； 核磁共振氢谱 1H NMR(400MHz， 氘代丙酮 ) ： 3.42( 多重峰， 1H， H-23a)， 3.69( 多重 峰， 1H， H-23b)， 3.78( 单峰， 3H， OCH3)， 4.04( 多重峰， 1H， H-10)， 4.54( 双双峰， J 6.0， 12.0Hz， H-3)， 4.91(双峰， J8.0Hz， 1H， H-11)， 4.99(双峰， J12.0Hz， 1H， H-2)， 5.86(单 峰， 1H， H-6)， 5.。
33、88( 单峰， 1H， H-8)， 6.83-7.15( 多重峰， 5H， Ar-H)， 11.56( 单峰， 1H， 5-OH) ； 电喷雾质谱 ESI-MS ： m/z 559M-H+。 0032 实 施 例 2 ： 化 合 物 (1)()-2-2， 3- 二 氢 -3-(3- 溴 -4- 羟 基 -5- 甲 氧 基 苯 基)-2-羟甲基-1， 4-苯并二氧六环-6-2， 3-二氢-3， 5， 7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮 对 - 葡萄糖苷酶的抑制活性检测 0033 2.1 仪器与试剂 0034 2.1.1 实验仪器 0035 酶标仪 ： ELISA plate reader(B。
34、io-Tek Instruments， USA) 0036 2.1.2 试剂 0037 - 葡萄糖苷酶即 -D-glucosidase(Sigma， 500U/ 毫升 ) ； 4- 硝基酚 -D- 吡 喃葡萄糖苷 (PNPG， Merck)， 还原性谷胱甘肽 ( 上海生工 )， 阿卡波糖即拜糖平 ( 拜耳医药保 健有限公司， 北京 )。 0038 2.2 测试方法 0039 化合物对 - 葡萄糖苷酶的抑制作用测定采用比色法。样品孔中加入磷酸缓 冲液 (67 毫摩尔 / 升， pH 6.8， 170 微升 )， 还原型谷光甘肽 (1 毫克 / 毫升， 5 微升 )， 说 明 书 CN 10200。
35、0062 B 8 7/7 页 9 -D-glucosidase( 用磷酸缓冲液稀释成 0.2U/ 毫升， 25 微升 )， 化合物 (1) 用二甲亚砜溶 解， 用磷酸缓冲液稀释， 每孔 25 微升， 使其终浓度为 0.04 毫克 / 毫升， 0.004 毫克 / 毫升， 0.0004毫克/毫升， 最后加入底物4-硝基酚-D-吡喃葡萄糖苷(23.2毫摩尔/升， 25微 升 )， 37， 水浴反应 15 分钟后， 加入碳酸钠 (1 摩尔 / 升， 50 微升 ) 终止反应， 在 405nm 波 长处比色测定。空白孔中用相同体积的 Tris-HCl 缓冲液代替底物。溶剂对照孔中加入与 化合物等浓度的。
36、二甲亚砜。化合物抑制率由样品 OD 值对于空白和对照 OD 值计算。样品对 - 葡萄糖苷酶的半数抑制浓度 (IC50) 由剂量效应曲线得到。 0040 2.3 试验结果如下表所示 ： 0041 表 1 0042 0043 2.4 实验结论 0044 - 葡萄糖苷酶是 - 糖苷酶抑制剂药物筛选中的的指标性测试酶， 许多药物是 基于对 - 葡萄糖苷酶竞争性抑制作用而成为降糖药物的。本实验表明式 (1) 所示结构之 E 环溴取代的水飞蓟宾酯具有强效抑制 - 葡萄糖苷酶的作用， 其在 40 微克 / 毫升浓度时 对 - 葡萄糖苷酶的抑制活性强度已达到 77.1。通过测定其半数抑制浓度显示 ： 该黄酮 木脂素抑制-葡萄糖苷酶的强度是阳性对照药物阿卡波糖的32倍， 因而具有非常强效的 开发潜力， 有可能进一步发展成为新的治疗 II 型糖尿病用药。 0045 在上述说明书阐述本发明时， 同时提供了实施例的目的是举例说明本发明的实际 操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和其等同物范围内时， 本发明的实际应 用包括所有一般变化、 配合， 或改进。 说 明 书 CN 102000062 B 9 。