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1、(10)授权公告号 CN 102771379 B (45)授权公告日 2014.05.14 CN 102771379 B (21)申请号 201210203605.1 (22)申请日 2012.06.20 A01H 1/02(2006.01) G06F 19/14(2011.01) (73)专利权人 河北省农林科学院谷子研究所 地址 050035 河北省石家庄市国家高新技术 产业开发区恒山街 162 号 (72)发明人 刘正理 夏雪岩 程汝宏 师志刚 张婷 (74)专利代理机构 石家庄汇科专利商标事务所 13115 代理人 王琪 张梅申 CN 1198882 A,1998.11.18, 权利要。
2、求 1、 4. 师志刚等 . 谷子抗咪唑乙烟酸新种质的初步 研究 .河北农业科学 .2010, 第 14 卷 ( 第 11 期 ), 第 133-134、 136 页 . 李会霞等 . 谷子雄性不育系杂种优势利用研 究 .甘肃农业科技 .2002,( 第 12 期 ), 第 7-9 页 . 刘正理等 . 谷子杂种优势群的构建方法及研 究进展 .河北农业科学 .2010, 第 14 卷 ( 第 11 期 ), 第 102-104 页 . (54) 发明名称 一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子 雄性不育系的培育方法 (57) 摘要 本发明公开了一种不同胞质类型抗咪唑乙 烟酸除草剂谷子雄性不育系。
3、的培育方法， 其包括 以下步骤 ： (1) 谷子育种材料细胞质类型的划分 ； (2) 桥梁父本的创制 ； (3) 不同胞质类型抗咪唑乙 烟酸除草剂三交1代的创制 ； (4)不同胞质类型的 抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系的创制。通过该方 法培育出不同胞质类型不育系， 不但丰富了现有 不育材料的胞质类型， 为培育不同胞质类型的杂 交种奠定基础， 可解决以前由于胞质类型单一， 容 易遭受专化性病害侵染的难题， 避免由于细胞质 专化性病害的侵染给农业生产带来的巨大损害。 而且本发明培育的谷子不育系还具有抗咪唑乙烟 酸特性， 解决了不育系繁种过程中除草困难的难 题。 (51)Int.Cl. (56)对比文件。
4、 审查员 冀敏 权利要求书 2 页 说明书 13 页 序列表 10 页 附图 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书13页 序列表10页 附图10页 (10)授权公告号 CN 102771379 B CN 102771379 B 1/2 页 2 1. 一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征在于包 括以下步骤 ： I. 谷子育种材料细胞质类型的划分 ； II. 桥梁父本的创制 ； III. 不同胞质类 型抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制 ； IV. 不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育 系的创制 ； 步骤 I 。
5、谷子育种材料细胞质类型的划分包括如下步骤 ： (1) 细胞质来源进化树的构建 ； (2) 母本衍生进化图的构建 ； (3) 特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类 ； (4) 谷子育种材料细胞质类型的确定 ； 步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(1)所述的细胞质来源进化树的构建 包括如下步骤 ： 叶片组织的培养与获取 ： 将谷子育种材料的种子种于育苗盘中获得谷子幼苗， 于 4 叶期分别剪取育种材料的叶片组织 ； 全基因组 DNA 的提取 ： 采用 CTAB 法提取步骤中叶片组织的全基因组 DNA ； PCR扩增 ： 采用20l反应体系， 利用线粒体特异引物对步骤提取的基因组DNA。
6、进 行 37 个反应循环 PCR 扩增 ； 多态性检测 ： 利用凝胶电泳法对步骤中线粒体的 PCR 扩增产物进行多态性检测 ； 细胞质来源进化树的生成 ： 对步骤中电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为 “1” ， 同一位置没有出现的带记为 “0” ， 生成由 “1” 和 “0” 组成的原始矩阵， 用NTSYS-pc2.1软 件进行数据分析， 用 SAHN 程序中的 UPGMA 方法进行聚类分析， 生成细胞质来源的进化树 ； 步骤 I 谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤 (2) 所述的母本衍生进化图的构建 为 ： 利用系谱追踪法将谷子育种材料按上文中步骤I-步骤(1)中所构建进化树的排列顺序 。
7、进行纵向排列， 通过逐代向上追踪育种材料的母本， 直到追踪到农家品种为止， 依据系谱将 同一母本衍生的育种材料按照衍生关系逐步连接起来， 形成母本衍生进化图 ； 步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确定 及细胞质来源的分子聚类为 ： 将上文步骤I-步骤(2)中构建的谷子育种材料的母本衍生进 化图与上文步骤I-步骤(1)中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树相结合， 并进行比较 分析， 确定基本能将同一母本衍生系统聚为一个分枝的特定遗传相似系数， 在该遗传相似 系数下对上文步骤I-步骤(1)中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树进行纵切， 将谷子 育种材料进行胞质。
8、来源的分子聚类， 分子聚类中每个分枝代表一个胞质类群 ； 步骤 I 谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤 (3) 所述的特定遗传相似系数的确 定及细胞质来源的分子聚类中特定遗传相似系数为 0.74， 在该遗传相似系数下对上文步骤 I- 步骤 (1) 中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切， 将其纵切为 7 个分枝， 每个分枝代表 1 个胞质来源的分子类群， 这样将胞质来源进化树纵切为 7 个类群， 纵切结果与母本衍生进化图一致性达 98.2 ； 步骤 I 谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤 (4) 所述的谷子育种材料细胞质类 型的确定是将上文步骤 I- 步骤 (3) 中的分子。
9、聚类图与上文步骤 I- 步骤 (2) 中构建的母本 衍生进化图结合， 将胞质来源分子聚类图中的每个分枝与对应的母本衍生系统逐一进行对 比， 确定每个类群材料的细胞质类型， 完成对谷子育种材料细胞质类型进行划分 ； 步骤 II 所述的桥梁父本的创制为 ： 以谷子高度雄性核不育系材料做母本， 以谷子抗咪 唑乙烟酸材料做父本配置杂交组合， 成熟后收获杂种1代种子 ； 种植杂种1代种子于3-5叶 权 利 要 求 书 CN 102771379 B 2 2/2 页 3 期， 喷施咪唑乙烟酸除草剂杀死假杂种， 正常成活的植株为含有不育基因和抗咪唑乙烟酸 基因的真杂种， 即桥梁父本 ； 步骤 III 所述的不。
10、同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制为 ： 以上述步骤 I-步骤(4)中划分的不同胞质类型的谷子育种材料为母本， 以上述步骤II中创制的桥梁父 本为父本配制不同胞质三交组合， 获得不同胞质类型抗咪唑乙烟酸三交 1 代种子 ； 步骤 IV 所述的不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系的创制包括如下步骤 ： 三交 1 代假杂种和不抗除草剂单株的去除 ： 种植上述步骤 III 中获得的三交 1 代种 子， 于 3-5 叶期喷施咪唑乙烟酸除草剂， 杀除假杂种和其中不抗咪唑乙烟酸的杂交后代， 存 活下来的为抗咪唑乙烟酸除草剂的杂合可育株和纯合可育株， 抽穗期全部套袋自交， 蜡熟 期从中选择优。
11、良单株作为三交 2 代种子 ； 后代的选择 ： 种植步骤中获得的三交 2 代种子， 于 3-5 叶期喷施咪唑乙烟酸除草 剂， 杀除其中分离的不抗咪唑乙烟酸除草剂的不育株和可育株， 存活下来的为抗咪唑乙烟 酸除草剂的不育株和抗咪唑乙烟酸除草剂的可育株两种类型， 抽穗期选择其中的不育株， 全部套袋， 蜡熟期按穗行从中选择优良不育单株， 作为三交 3 代种子供下代继续选择 ； 如此 连续经过 4-6 代的套袋自交和选择， 可获得稳定的不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性 不育系。 2. 根据权利要求 1 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法， 其特征在于 ： 步骤III所。
12、述的不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交1代的创制 为 ： 用来源于 “硬穗谷” 的 Y 型胞质谷子育种材料晋谷 35 为母本， 与权利要求 1 中创制的桥 梁父本进行杂交， 创制 Y 型胞质的三交 1 代。 权 利 要 求 书 CN 102771379 B 3 1/13 页 4 一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的 培育方法 技术领域 0001 本发明涉及一种谷子雄性不育系的培育方法， 具体涉及一种不同胞质类型谷子雄 性不育系的培育方法， 更具体涉及一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系 的培育方法， 属于雄性不育利用研究领域。 背景技术 0002 刘正理等通过系谱追踪。
13、发现， 目前谷子杂优利用研究中应用的雄性不育系细胞质 类型， 春谷雄性不育系几乎全部由 “长 10A” 衍生而来， 细胞质来源于 “沁园母鸡嘴” (Crop science， 2011， 51(4) ： 1655-1663) ； 夏谷雄性不育系几乎全部由 “黄米 1A” 衍生而来， 细胞 质来源于 “大黄谷” (刘正理等， 华北农学报， 2006， 21(增刊) ： 103-109)， 谷子不育系细胞质 类型过于单一， 而细胞质呈母系遗传， 因此不育系胞质类型的单一必然导致杂交种细胞质 类型的单一。 由于细胞质存在有专化性侵染病害， 一旦遇专化性病害侵染， 将会给谷子生产 上带来毁灭性损失。 。
14、0003 传统的谷子雄性不育系的培育方法是依据性状互补的原则， 以不育系做母本， 选 用能弥补不育系缺点的常规品种做父本进行杂交， 利用杂交后代分离的不育材料， 进行套 袋自交， 经过连续多代的选择， 从中选育不育系。 这种传统的不育系选育方法具有选育速度 快、 后代易稳定的优点， 但由于母本均为原有的不育系， 而细胞质呈母系遗传， 因此， 选育的 不育系的细胞质类型仍为原有类型， 通过这种方法选育的不育系并没有创制出新型细胞质 类型的不育系。因此， 传统的不育系选育方法不但不能解决不育系细胞质类型过于单一的 问题， 反而由于人们对骨干不育系的集中利用， 使胞质来源单一的问题日益严重 ； 同时。
15、， 由 于选用的常规材料多为育成品种的杂交后代， 仅具有一些能克服不育系缺点的普通性状， 缺少特殊的有益性状， 导致选育的不育系不但胞质类型单一， 而且缺乏谷子生产急需的抗 除草剂等特殊有益性状， 遗传基础也非常狭窄， 与常规品种亲缘关系越来越近， 不易配制强 优势杂交种。到目前为止， 在谷子上， 未见开展不同胞质类型不育系培育的报道， 更未见培 育不同胞质类型抗咪唑乙烟酸不育系的报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服上述谷子雄性不育系细胞质类型单一、 不抗除草剂的技术 缺陷， 而提供一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法。 0005 本发明的原理是将谷子育种材料。
16、细胞质来源进化树与谷子育种材料的母本衍生 进化图结合， 在确定对进化树进行纵切的特定遗传相似系数的基础上， 对现有谷子育种材 料的细胞质类型进行划分 ； 将现有不育系的不育基因导入到含有抗咪唑乙烟酸基因的谷子 正常可育株中， 创制桥梁亲本， 通过桥梁亲本将不育基因和抗咪唑乙烟酸基因遗传给后代 ； 以桥梁亲本为父本， 以不同胞质类型、 具有目标性状的系列常规材料做母本， 通过母本代换 创制出了将新型胞质与不育基因、 抗咪基因聚合到一起三交 1 代， 然后在喷施除草剂杀除 说 明 书 CN 102771379 B 4 2/13 页 5 不抗除草剂后代的基础上， 对抗除草剂的不育后代连续套袋自交 4。
17、-6 代， 辅之以连续的人 工定向选择， 即可培育出不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系。 0006 本发明主要的发明点在于对不同细胞质来源的谷子育种材料类型进行划分、 利用 桥梁父本将不育基因和抗咪唑乙烟酸除草剂基因遗传给后代、 利用母本代换创制系列不同 胞质类型的三交 1 代， 进而培育不同胞质类型抗除草剂的谷子雄性不育系。 0007 本发明提供了一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方 法， 其特征在于包括以下步骤 ： I. 谷子育种材料细胞质类型的划分 ； II. 桥梁父本的创制 ； III. 不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制 ； IV. 不同。
18、胞质类型的抗咪唑乙烟 酸谷子雄性不育系的创制。 0008 所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤 I 谷子育种材料细胞质类型的划分包括如下步骤 ： (1) 细胞质来源进化树的构建 ； (2) 母本衍生进化图的构建 ； (3) 特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类 ； (4) 谷子育种材料细胞质类型的确定。 0009 所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(1)所述的细胞质来源进化树的构建 包括如下步骤 ： 0010 叶片组织的培养与获取 ： 将谷子育种材料的种子。
19、种于育苗盘中获得谷子幼苗， 于 4 叶期分别剪取育种材料的叶片组织 ； 0011 全基因组 DNA 的提取 ： 采用 CTAB 法提取步骤中叶片组织的全基因组 DNA ； 0012 PCR 扩增 ： 采用 20l 反应体系， 利用线粒体特异引物对步骤提取的基因组 DNA 进行 37 个反应循环 PCR 扩增 ； 0013 多态性检测 ： 利用凝胶电泳法对步骤中线粒体的 PCR 扩增产物进行多态性检 测 ； 0014 细胞质来源进化树的生成 ： 对步骤中电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记 为 “1” ， 同一位置没有出现的带记为 “0” ， 生成由 “1” 和 “0” 组成的原始矩阵， 用 NT。
20、SYS-pc2.1 软件进行数据分析， 用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析， 生成细胞质来源的进化树。 0015 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建 为 ： 利用系谱追踪法将谷子育种材料按步骤 (1) 中进化树的排列顺序进行纵向排列， 通过 逐代向上追踪育种材料的母本， 直到追踪到农家品种为止， 依据系谱将同一母本衍生的育 种材料按照衍生关系逐步连接起来， 形成母本衍生进化图。 0016 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在。
21、于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确 定及细胞质来源的分子聚类为 ： 将步骤 (2) 构建的谷子育种材料的母本衍生进化图与步骤 (1) 中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树相结合， 并进行比较分析， 确定基本能将同一 母本衍生系统聚为一个分枝的特定遗传相似系数， 在该遗传相似系数下对步骤 (1) 中构建 的谷子育种材料的胞质来源进化树进行纵切， 将谷子育种材料进行胞质来源的分子聚类， 分子聚类图中每个分枝代表一个胞质类群。 0017 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 说 明 书 CN 102771379 B 5 3。
22、/13 页 6 征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类 型的确定是将步骤 (3) 中的分子聚类图与步骤 (2) 中构建的母本衍生进化图结合， 将胞质 来源分子聚类图中的每个分枝与对应的母本衍生系统逐一进行对比， 确定每个类群材料的 细胞质类型， 完成对谷子育种材料细胞质类型的划分。 0018 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(1)所述的细胞质来源进化树的构 建中步骤中所述的谷子育种材料为 ： 延谷 12、 长高 117A、 大同 29 紫、 冀谷 26、 冀谷 3。
23、0、 坝 谷 214、 安 9217、 保 182、 冀谷 12、 石 06-766、 延谷 13、 冀谷 20、 冀谷 22、 谷 65、 冀谷 21、 大同 27、 赤谷10、 承谷12、 大同30、 豫谷6、 大同14、 郑9188、 大同28、 铁8240、 锦谷12、 锦谷14、 朝 438、 公谷 68、 铁 487、 铁谷 6、 复 532、 晋汾 1、 沧 156、 济谷 13、 长高 229A、 S80、 冀谷 29、 公谷 70、 石206065、 大同29绿、 安2491、 兴谷88、 晋15、 晋汾3、 沧344、 Y61、 石02399、 C138、 C208、 朝谷。
24、 12、 K523、 L70、 铁大粒黄、 K359、 朝谷 13、 谷 83、 衡 968、 济 9403、 冀谷 27、 济 9409、 鲁谷 10、 济谷12、 济谷11、 谷6、 石02521、 石98700、 石207382、 石207393、 石02530、 石207286、 安 4852、 谷 3、 冀谷 25、 石 207191、 长高 146A、 石 207226、 石 206058、 公谷 65、 C164、 203184 早、 安 2367、 石 202242、 谷 57、 冀谷 24、 谷丰 2 号、 石 06-439、 谷 38、 小香米、 冀谷 19、 K1130、。
25、 坝 谷 214-2、 谷 11、 K1011、 长农 36、 冀谷 28、 长农 35、 晋谷 35、 太选 5 号、 太选 2 号、 晋谷 21、 谷 95、 晋谷 29、 朝谷 14、 K660、 美国大头、 谷 10、 K546、 朝绿 -1、 晋谷 16、 石 98622 和石 97672 共 111 份。 0019 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(2)所述的母本衍生进化图的构建 中111份谷子育种材料中12份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、 13份材料来源于同一母本 材料黄软谷、 63 份材料。
26、来源于同一母本材料日本 60 日、 6 份材料来源于同一母本材料硬穗 谷、 5 份材料来源于同一母本材料黑枝谷， 12 份材料未追踪到其母本， 便于研究命名为系谱 丢失 I 型和系谱丢失 II 型。 0020 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(3)所述的特定遗传相似系数的确 定及细胞质来源的分子聚类中特定遗传相似系数为 0.74， 在该遗传相似系数下对步骤 (1) 中所述的细胞质来源进化树的构建中所构建的进化树进行纵切， 将其纵切为 7 个分枝， 每 个分枝代表1个胞质来源的分子类群， 这样将胞质来源进化。
27、树纵切为7个类群， 纵切结果与 母本衍生进化图一致性达 98.2。 0021 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤I谷子育种材料细胞质类型的划分中的步骤(4)所述的谷子育种材料细胞质类 型的确定中将步骤 (3) 中所述的特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类中构 建的分子聚类图与步骤 (2) 中所述的母本衍生进化图的构建中所构建的母本衍生进化图 相结合， 进行逐一对比， 确定各类群材料的胞质类型， 分别为来源于 “沁园母鸡嘴” 的 Q 型， 来源于 “日本 60 日” 的 R 型， 来源于 “黄软谷” 的 H 型， 来源于 “硬穗谷” 的 。
28、Y 型， 来源于 “黑 枝谷” 的 S 型， 还有两种由于系谱丢失， 追踪不到母本来源， 分别定名为 M I 型和 M II 型。 0022 所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤 II 所述的桥梁父本的创制为 ： 以谷子高度雄性核不育系做母本， 以谷子抗咪唑乙 说 明 书 CN 102771379 B 6 4/13 页 7 烟酸材料做父本配置杂交组合， 成熟后收获杂种 1 代种子 ； 种植杂种 1 代种子于 3-5 叶期， 喷施咪唑乙烟酸除草剂杀死假杂种， 正常成活的植株为含有不育基因和抗咪唑乙烟酸基因 的真杂种， 即桥梁父本。 0023 所述一种。
29、不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤II桥梁父本的创制中所述的谷子高度雄性核不育系材料为长高229A、 长高146A、 长高 117A 等其中的一个。 0024 所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤 II 桥梁父本的创制中所述的谷子抗咪唑乙烟酸材料为 M200、 M117、 M302、 M195、 M150 等其中的一个。 0025 所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤 III 所述的谷子不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制为 ： 以步骤 I 中划分的不。
30、同胞质类型的谷子育种材料为母本， 以步骤 II 创制的桥梁父本为父本配制不 同胞质三交组合， 获得不同胞质类型抗咪唑乙烟酸三交 1 代种子。 0026 所述一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特征 在于步骤 IV 所述的不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸雄性不育系的创制包括如下步骤 ： 0027 三交 1 代假杂种和不抗除草剂单株的去除 ： 种植步骤 III 中获得的三交 1 代种 子， 于 3-5 叶期喷施咪唑乙烟酸除草剂， 杀除假杂种和其中不抗咪唑乙烟酸的杂交后代， 存 活下来的为抗咪唑乙烟酸除草剂的杂合可育株和纯合可育株， 抽穗期全部套袋自交， 蜡熟 期从中选择优良单。
31、株作为三交 2 代种子 ； 0028 后代的选择 ： 种植步骤中获得的三交 2 代种子， 于 3-5 叶期喷施咪唑乙烟酸 除草剂， 杀除其中分离的不抗咪唑乙烟酸除草剂的不育株和可育株， 存活下来的为抗咪唑 乙烟酸除草剂的不育株和抗咪唑乙烟酸除草剂的可育株两种类型， 抽穗期选择其中的不育 株， 全部套袋， 蜡熟期按穗行从中选择优良不育单株， 作为三交 3 代种子供下代继续选择 ； 如此连续经过 4-6 代的套袋自交和选择， 可获得稳定的多种胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子 雄性不育系。 0029 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤 II 所述的桥梁父本。
32、的创制中以谷子不育系长高 229A 为母本， 以抗咪唑乙烟酸 谷子除草剂中间材料 M302 为父本配制杂交组合进行 Y 型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄 性不育系的创制。 0030 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤 III 所述的谷子多种胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制为 ： 用 Y 型 胞质谷子育种材料晋谷 35 为母本， 与上述创制的桥梁父本进行杂交， 创制 Y 型胞质的三交 1 代。 0031 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤 II 所述的桥梁父本的创制中以谷子不育系长高 1。
33、46A 为母本， 以抗咪唑乙烟酸 谷子除草剂中间材料 M195 为父本配制杂交组合进行 S 型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄 性不育系的创制。 0032 所述的一种不同胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂谷子雄性不育系的培育方法， 其特 征在于步骤 III 所述的谷子多种胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制为 ： 用 S 型 说 明 书 CN 102771379 B 7 5/13 页 8 胞质谷子育种材料复 532 为母本， 与上述创制的桥梁父本进行杂交， 创制 S 型胞质的三交 1 代。 0033 有益效果 0034 利用本发明可培育出不同胞质类型的抗咪唑乙烟酸谷子雄性不育系， 丰富了谷子 不育。
34、系的胞质类型， 为培育不同胞质类型的杂交种奠定基础， 可解决由于胞质类型单一， 容 易遭受专化性病害侵染的难题， 避免由于细胞质专化性病害的侵染给农业生产带来的巨大 损害。同时本发明由于将不育基因和抗咪唑乙烟酸基因聚合在谷子不育材料中， 通过喷施 咪唑乙烟酸除草剂， 杀除不育系繁种田的杂草， 可有效的解决不育系繁种田人工除草费工 费时的难题。 附图说明 0035 图 1-1 和图 1-2 是谷子育种材料线粒体的 PCR 扩增多态性检测图谱 ； 0036 图中， M为Marker ； V1-V111分别代表111份谷子育种材料延谷12、 长高117A、 大同 29 紫、 冀谷 26、 冀谷 30。
35、、 坝谷 214、 安 9217、 保 182、 冀谷 12、 石 06-766、 延谷 13、 冀谷 20、 冀 谷 22、 谷 65、 冀谷 21、 大同 27、 赤谷 10、 承谷 12、 大同 30、 豫谷 6、 大同 14、 郑 9188、 大同 28、 铁 8240、 锦谷 12、 锦谷 14、 朝 438、 公谷 68、 铁 487、 铁谷 6、 复 532、 晋汾 1、 沧 156、 济谷 13、 长高 229A、 S80、 冀谷 29、 公谷 70、 石 206065、 大同 29 绿、 安 2491、 兴谷 88、 晋 15、 晋汾 3、 沧 344、 Y61、 石 023。
36、99、 C138、 C208、 朝谷 12、 K523、 L70、 铁大粒黄、 K359、 朝谷 13、 谷 83、 衡 968、 济 9403、 冀谷 27、 济 9409、 鲁谷 10、 济谷 12、 济谷 11、 谷 6、 石 02521、 石 98700、 石 207382、 石 207393、 石 02530、 石 207286、 安 4852、 谷 3、 冀谷 25、 石 207191、 长高 146A、 石 207226、 石 206058、 公谷 65、 C164、 203184 早、 安 2367、 石 202242、 谷 57、 冀谷 24、 谷丰 2 号、 石 06-43。
37、9、 谷 38、 小香米、 冀谷 19、 K1130、 坝谷 214-2、 谷 11、 K1011、 长农 36、 冀谷 28、 长农 35、 晋谷 35、 太选 5 号、 太选 2 号、 晋谷 21、 谷 95、 晋谷 29、 朝谷 14、 K660、 美国大头、 谷 10、 K546、 朝绿 -1、 晋谷 16、 石 98622、 石 97672 的 DNA ； A 为标准条带，“带” 的颜色深于或同于 “A” 的条带记为 “1” ， 浅于 “A” 的条带记为 “0” 。 0037 图 2-1、 2-2 和 2-3 是 111 份谷子育种材料的细胞质来源进化树的三个组成部分， 三者按顺序拼。
38、接在一起即得进化树全图 ； 0038 图中， 0.55、 0.66、 0.78、 0.89、 1.00 为遗传相似系数 0039 图 3-1、 3-2 和 3-3 是 111 份谷子育种材料的母本衍生进化图的三个组成部分， 三 者按顺序拼接在一起即得母本衍生进化图全图 ； 0040 图中， 用实线连接的是母本来源明确的材料 ； 用虚线连接的是母本来源不明确， 但 分子聚类将它们与相应的实线部分聚为一个类群的材料 ； 沁源母鸡嘴、 黄软谷、 日本 60 日、 硬穗谷、 黑枝谷、 系谱丢失 I 型和系谱丢失 II 型代表育种材料不同母本的来源。 0041 图 4-1、 4-2 和 4-3 是 11。
39、1 份谷子育种材料的细胞质来源的分子聚类图的三个组成 部分， 三者按顺序拼接在一起即得分子聚类图全图 ； 0042 图中， 0.55、 0.66、 0.78、 0.89、 1.00 为遗传相似系数 ； L 代表对进化树进行纵切的 特定遗传相似系数 0.74 ； B1、 B2、 B3、 B4、 B5、 B6、 B7 表示在特定遗传相似系数 0.74 下对进 化树纵切后形成的 7 个分子类群。 0043 图 5 是谷子育种材料细胞质类型划分图 说 明 书 CN 102771379 B 8 6/13 页 9 0044 图中， B1 分子类群和沁源母鸡嘴母本衍生系统对应， 定位 Q 型 ； B2 分子。
40、类群和黄 软谷母本衍生系统对应， 定位 H 型 ； B3 分子类群和日本 60 日母本衍生系统对应， 定位 R 型 ； B4 分子类群和硬穗谷母本衍生系统对应， 定位 Y 型 ； B5 分子类群对应的母本衍生系统系谱 丢失， 定位 M I 型 ； B6 分子类群和黑枝谷母本衍生系统对应， 定位 S 型 ； B7 分子类群对应的 母本衍生系统系谱丢失， 定位 M II 型 ； a 对应图 4-1， b 对应图 4-2， c 对应图 4-3 ； d 对应图 3-1， e 对应图 3-2， f 对应图 3-3。 0045 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不以任何方式限制本发明的范 围。 。
41、具体实施方式 0046 实施例中所用试剂如无特别说明均购自生工生物工程上海有限公司， 所用线粒体 特异引物由生工生物工程上海有限公司合成， 所用 NTSYS-pc2.1 软件由 State University of New York， Stony Brook 研制， 所用咪唑乙烟酸除草剂购自山东先达化工有限公司生产 的苜草净(原药含有5咪唑乙烟酸有效成分)。 所用111份谷子育种材料来自我国华北夏 谷生态区、 西北春谷生态区、 东北春谷生态区的河北、 河南、 山东、 辽宁、 吉林、 山西、 内蒙、 陕 西 8 个省区 ( 详见表 1)。所用谷子高度雄性核不育系材料长高 229A、 长高 14。
42、6A、 长高 117A 来源于山西省农业科学院谷子研究所， 谷子抗咪唑乙烟酸材料 M200、 M117、 M302、 M195、 M150 为本所资源材料。 0047 表 1 111 份供试材料的一览表 说 明 书 CN 102771379 B 9 7/13 页 10 0048 0049 实施例 1 ： 谷子 H 型胞质类型抗咪唑乙烟酸除草剂雄性不育系的培育 0050 1、 谷子育种材料胞质类型的划分 0051 (1) 细胞质来源进化树的构建 0052 叶片组织的培养与获取 ： 将延谷 12、 长高 117A 等 111 份谷子育种材料 ( 见表 1) 的种子分别种于育苗盘中获得了谷子幼苗， 。
43、于 4 叶期分别剪取育种材料的叶片组织 ； 0053 全基因组 DNA 的提取 ： 采用 CTAB 法提取步骤中叶片组织中全基因组 DNA ； 0054 PCR扩增 ： 采用20l反应体系， 利用生工生物工程上海有限公司合成的表2中 的 23 对线粒体特异引物通过 37 个反应循环， 对步骤提取的基因组 DNA 进行 PCR 扩增。 说 明 书 CN 102771379 B 10 8/13 页 11 20l 反应体系包括 Taq 酶 (5U/L)0.2L、 10buffer 2.0L、 dNTP(2.0mM)2.0L、 FPrime 1.0L、 RPrimer 1.0ML、 DNA 2.0L、。
44、 ddH2O11.8L。PCR 扩增共进行 37 个循环。 第一个循环在 94下预变性 4 分钟 ； 接着， 94变性 45 秒， Tm退火 45 秒， 72延伸 1-4 分钟， 退火温度 Tm与延伸时间见表 2， 循环 35 次 ； 最后， 72延伸 8 分钟 ； 0055 表 2 线粒体特异引物序列及其扩增条件 0056 0057 多态性检测 ： 利用凝胶电泳法将步骤中的 PCR 扩增产物分别与溴化乙锭按 101混合染色后， 用移液枪取10L， 用1.5琼脂糖凝胶在TBE缓冲溶液中进行电泳， 检 测多态性 ； 加 5LDL2000 Marker 在 120V 电压、 400mA 电流条件下。
45、电泳 1 小时后， 用 EB 染 色 5 分钟， 用凝胶成像仪观察结果并自动成像记录 ( 见图 1) ； 0058 细胞质来源进化树的生成 ： 对步骤中电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记 为 “1” ， 同一位置没有出现的带记为 “0” ， 生成由 “1” 和 “0” 组成的原始矩阵 ( 见表 3)， 用 NTSYS-pc2.1软件进行数据分析， 用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类分析， 生成胞质来源 进化树 ( 见图 2)。 0059 表 3 线粒体多态性数据原始矩阵 0060 说 明 书 CN 102771379 B 11 9/13 页 12 0061 说 明 书 CN 102771。
46、379 B 12 10/13 页 13 0062 说 明 书 CN 102771379 B 13 11/13 页 14 0063 (2) 母本衍生进化图的构建 ： 利用系谱追踪法将 111 份谷子育种材料按步骤 (1) 中进化树中的排列顺序进行纵向排列， 通过逐代向上追踪育种材料的母本， 直到追踪到农 家品种为止。经过追踪， 111 份材料中 12 份来源于同一母本材料沁源母鸡嘴、 13 份材料来 说 明 书 CN 102771379 B 14 12/13 页 15 源于同一母本材料黄软谷、 63 份材料来源于同一母本材料日本 60 日、 6 份材料来源于同一 母本材料硬穗谷、 5 份材料来源。
47、于同一母本材料黑枝谷， 12 份材料未追踪到其母本， 便于研 究命名为系谱丢失I型和系谱丢失II型， 依据系谱将同一母本衍生的育种材料按照衍生关 系逐步连接起来， 形成了母本衍生进化图 ( 见图 3)。 0064 (3) 特定遗传相似系数的确定及细胞质来源的分子聚类 ： 将步骤 (2) 中构建的谷 子育种材料的母本衍生进化图与步骤 (1) 中构建的谷子育种材料的胞质来源进化树进行 结合分析， 当遗传相似系数为0.74时能将109份育种材料中来源于同一母本衍生系统聚为 一个分枝， 0.74 即为对供试材料的细胞质来源进化树进行纵切的特定遗传相似系数， 在该 遗传相似系数下对谷子育种材料的胞质来源。
48、进化树进行纵切， 将其纵切为 7 个分枝， 每个 分枝代表 1 个胞质来源的分子类群， 这样将胞质来源进化树纵切为 7 个类群 ( 见图 4)。该 纵切结果与母本衍生进化图一致性达 98.2。 0065 (4) 细胞质类型的确定 ： 将步骤 (3) 中的分子聚类图与步骤 (2) 中构建的母本衍 生进化图结合， 将胞质来源的 7 个分子类群分别与对应的母本衍生系进行逐一对比， 确定 各类群材料的胞质类型， 分别为来源于 “沁园母鸡嘴” 的 Q 型， 来源于 “日本 60 日” 的 R 型， 来源于 “黄软谷” 的 H 型， 来源于 “硬穗谷” 的 Y 型， 来源于 “黑枝谷” 的 S 型， 还有。
49、两种由于 系谱丢失， 追踪不到母本来源， 分别定名为 MI 型和 M II 型 ( 见图 5)。 0066 2、 桥梁父本的创制 ： 以谷子不育系长高 146A 为母本， 以抗咪唑乙烟酸谷子除草剂 中间材料 M200 为父本配制杂交组合， 即杂种 1 代， 在该杂种 1 代 4 叶期， 按照每亩喷施 40 公斤咪唑乙烟酸除草剂原药水1200的咪唑乙烟酸除草剂， 杀除假杂种， 正常成活的 植株为真杂种， 真杂种是含有不育基因和抗咪唑乙烟酸除草剂基因的正常可育株， 即为本 发明的抗咪唑乙烟酸除草剂的杂种 1 代 - 桥梁父本。 0067 3、 谷子 H 型细胞质抗咪唑乙烟酸除草剂三交 1 代的创制 ： 根据细胞质呈母系遗 传的特点， 用步骤 1 中的 H 型胞质谷子育种材料大同 29 为母本， 与步骤 2 中创制的 “长高 146AM200” 的杂种 1 代为父本进行杂交， 创制 H。