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1、(10)授权公告号 CN 102845312 B (45)授权公告日 2013.11.13 CN 102845312 B *CN102845312B* (21)申请号 201210388222.6 (22)申请日 2012.10.12 A01H 4/00(2006.01) A01G 31/00(2006.01) (73)专利权人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50 号 (72)发明人 李畅 苏家乐 刘晓青 陈尚平 何丽斯 (54) 发明名称 一种利用幼胚拯救获得一品红杂交后代的方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用幼胚拯救获得一品红 杂交后代的方法。 该。
2、方法取人工杂交授粉后15 22d 的胚珠采用离体培养进行幼胚拯救， 具体步 骤包括 ： (1)胚珠剥取， (2)诱导培养， (3)继代、 增 殖与生根培养， (4) 移栽。该发明有效避免了一品 红杂种胚早衰， 提高了一品红杂交后代的杂种成 活率， 缩短了一品红杂交后代的培育周期， 可在一 品红杂交育种中应用。 (51)Int.Cl. 审查员 姜岚 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 (10)授权公告号 CN 102845312 B CN 102845312 B *CN102845312B* 1/1 页 2 1.。
3、 一种利用幼胚拯救获得一品红杂交后代的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： (1)胚珠剥取 ： 选取一品红杂交授粉后1522d的子房， 流水下冲洗5min， 在无菌条件 下， 用体积比 75的乙醇浸泡 1min， 再用质量百分比为 0.1升汞溶液消毒 10min， 无菌水 冲洗 4 5 次后用镊子撕拨开子房壁， 轻轻剥出胚珠 ； (2) 诱导培养 ： 在无菌条件下， 迅速将剥出的胚珠接种到 MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基， 培养基 pH5.6-5.8、 蔗糖 60g/L、 琼脂 6g/L， 在温度 20 25、 光周期 10 12h/d、 光照强度 1500 20。
4、00lux 下培养诱导胚芽萌发 ； (3) 继代、 增殖与生根培养 ： 30 45d 后转入 MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.1mg/L 培养基中 继代培养， 得到幼苗后切取茎段和顶芽转入 MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基中扩繁， 待增殖数量达到目标数量时转入 1/2MS+NAA0.1mg/L 培养基上生根， 上述培养基 pH5.6 5.8、 蔗糖 30g/L、 琼脂 6g/L， 培养条件同 (2) ； (4)移栽 ： 将根系发育良好的无菌苗在室内自然光下开瓶炼苗34d， 镊子夹取试管苗 洗净附着在表面的培养基， 移栽到泥炭珍珠岩蛭石 1 1 1 的穴盘中，。
5、 置于温室中 保持 90 95相对湿度、 20 25温度培养， 30d 左右带土上盆移栽， 正常管理。 2. 根据权利要求 1 所述的利用幼胚拯救获得一品红杂交后代的方法， 其特征在于 ： 所 述的杂交授粉在晴天上午11:0012:00进行， 采集当日父本柱头散粉的新鲜花粉， 用毛笔 轻轻授到母本呈倒 “八” 字状的柱头上 ； 次日重复授粉一次 ； 温室环境温度不低于 25， 正 常管理。 3. 根据权利要求 1 所述的利用幼胚拯救获得一品红杂交后代的方法， 其特征在于 ： 所 述的一品红为通过遮光或者补光调节控制花期、 花期保持一致的亲本。 权 利 要 求 书 CN 102845312 B 。
6、2 1/3 页 3 一种利用幼胚拯救获得一品红杂交后代的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术育种领域， 具体涉及一种利用幼胚拯救获得一品红杂交后代 的方法。 背景技术 0002 一品红 (Euphorbia pulcherrima willd)， 原产墨西哥和中美洲热带， 为大戟科 (Euphorbiaceae) 大戟属常绿、 半常绿多年生直立灌木， 其自然 “花” 期 11 月至翌年 3 月， 恰 逢冬季节日， 主要观赏部位顶端轮生的叶状苞片硕大色艳， 是欧美国家的传统盆花之一。 我 国一品红大规模商业化生产始于 1998 年， 由于新优品种和先进栽培技术的引进， 市场份额 逐年增加。
7、， 是近来来我国国庆、 元旦、 春节的重要消费花卉之一。 0003 目前国际上已有具有不同株型、 苞片颜色、 成熟期的数百个品种上市， 而我国使用 的一品红品种均由国外引进， 尚处于起步阶段的一品红育种工作与世界一品红育种存在巨 大差距， 亦与逐年扩大的一品红消费市场形成鲜明反差。 杂交是转移优良性状或基因， 获得 植物新类型和选育有价值的新品种的有效方法之一。 杂交亦是一品红选育新品种的有效手 段， 目前国内通过杂交育种方法选育一品红新品种仅现东莞市农业种子研究所报道 ： 黄子 峰等通过改变一品红自然花期， 用 威望 和 金奖 杂交选育出一品红新品种 红荷 和 闪 亮 。 本课题组近年来亦在。
8、从事一品红杂交育种工作的研究， 杂交育种过程中发现在温室温 度控制在 25以后， 一品红雌花比例仍然较少， 杂交后胚后期发育不正常成为制约一品红 杂种获得的主要因素。 0004 自 1904 年 Ehanning 用十字花科菔属植物作为试材进行胚离体培养首获成功后， 幼胚拯救技术作为克服受精后胚胎败育最有效的手段之一， 已在小麦、 油菜等大田作物以 及果树、 蔬菜、 花卉等园艺作物杂交育种领域广泛应用， 而在一品红杂交育种中尚未见相关 报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种利用受精后的幼胚离体拯救培养获得一品红杂交后 代的方法， 以提高一品红杂交育种成功率， 缩短一品红杂交育种周。
9、期。 0006 为实现本发明的目的， 本发明提供了如下技术方案 ： 0007 一种利用幼胚拯救获得一品红杂交后代的方法， 其内容包括 ： 0008 (1)胚珠剥取 ： 取一品红杂交授粉后1522d的子房， 流水下冲洗5min， 在无菌条 件下， 用体积比 75的乙醇浸泡 1min， 再用质量百分比为 0.1升汞溶液消毒 10min， 无菌 水冲洗 4 5 次后用镊子撕拨开子房壁， 轻轻剥出胚珠 ； 0009 (2) 诱 导 培 养 ： 在 无 菌 条 件 下， 迅 速 将 剥 出 的 胚 珠 接 种 到 MS+NAA0.5mg/ L+6-BA0.5mg/L 培养基， 培养基 pH5.6-5.8。
10、、 蔗糖 60g/L、 琼脂 6g/L， 在温度 20 25、 光周 期 10 12h/d、 光照强度 1500 2000lux 下培养诱导胚芽萌发 ； 0010 (3) 继代、 增殖与生根培养 ： 30 45d 后转入 MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.1mg/L 培 说 明 书 CN 102845312 B 3 2/3 页 4 养基中继代培养， 得到幼苗后切取茎段和顶芽转入 MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基 中扩繁， 待增殖数量达到目标数量时转入 1/2MS+NAA0.1mg/L 培养基上生根， 上述培养基 pH5.6 5.8、 蔗糖 30g/L、 琼脂 。
11、6g/L， 培养条件同 (2) ； 0011 (4)移栽 ： 将根系发育良好的无菌苗在室内自然光下开瓶炼苗34d， 镊子夹取试 管苗洗净附着在表面的培养基， 移栽到泥炭珍珠岩蛭石 1 1 1 的穴盘中， 置于温 室中保持 90 95相对湿度、 20 25温度培养， 30d 左右带土上盆移栽， 正常管理。 0012 对上述技术方案进行进一步阐述 ： 0013 1、 在本发明中 ： 所述的杂交授粉在晴天上午11:0012:00进行， 采集当日父本柱 头散粉的新鲜花粉， 用毛笔轻轻授到母本呈倒 “八” 字状的柱头上 ； 次日重复授粉一次 ； 温 室环境温度不低于 25， 正常管理。 0014 2、 。
12、在本发明中 ： 所述的一品红为通过遮光或者补光调节控制花期、 花期保持一致 的亲本。 0015 本发明经过以下多项对比试验， 优选总结出上述最佳的技术参数 ： 0016 1、 幼胚的选择试验 ： 分别选择杂交授粉后 4、 6、 8、 10、 12、 15、 18、 22d 等不同发育时 期的子房， 无菌条件下， 用体积比 75的乙醇浸泡 1min， 再用质量百分比为 0.1升汞溶液 中消毒 10min， 无菌水冲洗 4 5 次后用镊子撕拨开子房壁， 轻轻剥出不同发育时期的胚珠 后接种到诱导培养基 MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+ 蔗糖 60g/L+ 琼脂 6g/L(pH5.。
13、6-5.8) 上 培养， 观察统计胚珠诱导萌发情况。结果表明授粉后 15、 18、 22d 的胚珠可被诱导萌发。 0017 2、 幼胚离体培养诱导培养基的选择 ： (1)NAA 和 6-BA2 激素浓度筛选 ： 以人工授粉 后 15d 的一品红杂交胚珠为材料， MS 为基本培养基， NAA 和 6-BA 分别设置 0.1、 0.5、 1.0mg/ L 进行 2 因素 3 水平全面试验， 结果表明 0.5mg/L NAA 与 0.5mg/L6-BA 组合为适宜的诱导 培养基， 30d 后可诱导一品红杂种胚萌发并生长。(2) 蔗糖浓度的选择 ： 以 MS+NAA0.5mg/ L+6-BA0.5mg。
14、/L为培养基， 设置30、 60、 90g/L3个蔗糖浓度， 接种15d杂种胚珠筛选适宜蔗糖 浓度， 结果表明添加 60g/L 的蔗糖可促进胚珠萌发。 0018 3、 继代、 增殖与生根培养培养基成分选择试验 ： MS 为基本培养基， 统一添加蔗糖 30g/L， 设置 pH5.6 5.8， 分别进行试验 (1) 和 (2) ： (1) 继代培养基筛选试验 ： 以诱导萌发 的幼胚为材料， 分别接种到添加浓度为 0.05、 0.1、 0.5mg/L NAA 和 6-BA2 因素 3 水平全面试 验的培养基中进行筛选， 结果表明 NAA0.05mg/1L+6-BA0.1mg/L 为较合适的壮苗、 继。
15、代培养 基 ； (2)增殖培养基筛选试验 ： 分别设置NAA0、 0.1、 0.5mg/L， 6-BA0.1、 0.5、 1.0mg/L3个浓度 进行2因素3水平全面试验， 得出NAA0.1mg/L、 6-BA0.5mg/L激素组合适宜增殖培养 ； (3)生 根培养基筛选试验 ： 基本培养基设 MS、 1/2MS 两个水平， NAA 设置 0、 0.1、 0.53 个浓度进行全 面试验， 结果表明 1/2MS+NAA0.1mg/L 为适宜的生根培养基。 0019 由上述本发明提供的技术方案可看出， 本发明克服了一品红杂交后胚发育后期败 育导致杂种获得难的现象， 可有效提高一品红杂交育种成功率，。
16、 并缩短一品红杂交后代生 长周期。 具体实施方式 0020 为进一步了解本发明的发明内容及功效， 兹例举以下实施例， 实施例中所使用的 实验方法若无特殊说明均为常规方法 ： 说 明 书 CN 102845312 B 4 3/3 页 5 0021 实施例一一品红人工杂交授粉 15d 后的胚珠幼胚拯救方法 0022 1、 人工杂交授粉 ： 选取确定一品红杂交父母本， 通过遮光或者补光调节控制花期、 花期保持一致。授粉于晴天上午 11:00 12:00 进行， 采集父本柱头当日散粉的新鲜花粉， 用毛笔轻轻授到母本呈倒 “八” 字状的柱头上 ； 次日重复授粉一次。温室环境温度不低于 25， 正常管理。。
17、 0023 2、 杂种胚珠的剥取及诱导培养 ： 取一品红杂交授粉后发育 15d 的子房， 流水下冲 洗 5min， 在无菌条件下， 用体积比 75的乙醇浸泡 1min， 再用质量百分比为 0.1升汞溶 液中消毒 10min， 无菌水冲洗 4 5 次后用镊子撕拨开子房壁， 轻轻剥出胚珠后迅速接种到 MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基上培养， 培养基 pH5.6-5.8、 蔗糖 60g/L、 琼脂 6g/L， 在 温度 20 25、 光周期 10 12h/d、 光照强度 1500 2000lux。培养诱导胚珠先生成愈伤 组织后经愈伤组织萌发胚芽。 0024 3、 继代、 增。
18、殖与生根培养 ： 45d 后转入 MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.1mg/L 培养基中继 代培养， 得到幼苗后切取茎段和顶芽转入 MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基中扩繁， 待 增殖数量达到目标数量时转入1/2MS+NAA0.1mg/L培养基上生根， 上述培养基pH5.65.8、 蔗糖 30g/L、 琼脂 6g/L， 培养条件为温度 20 25、 光周期 10 12h/d、 光照强度 1500 2000lux。 0025 4、 移栽 ： 将根系发育良好的无菌苗在室内自然光下开瓶炼苗 3 4d， 镊子夹取试 管苗洗净附着在表面的培养基， 移栽到泥炭珍珠岩蛭石 1。
19、 1 1 的穴盘中， 置于温 室中保持 90 95相对湿度、 20 25温度培养， 30d 左右带土上盆移栽， 正常管理。 0026 实施例二一品红人工杂交授粉 22d 后的胚珠幼胚拯救方法 0027 1 项同实施例一。 0028 2、 杂种胚珠的剥取及诱导培养 ： 取一品红杂交授粉后发育 22d 的子房， 流水下冲 洗 5min， 在无菌条件下， 用体积比 75的乙醇浸泡 1min， 再用质量百分比为 0.1升汞溶 液中消毒 10min， 无菌水冲洗 4 5 次后用镊子撕拨开子房壁， 轻轻剥出胚珠后迅速接种到 MS+NAA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基上培养， 培养基 pH5。
20、.6-5.8、 蔗糖 60g/L、 琼脂 6g/L， 在 温度 20 25、 光周期 10 12h/d、 光照强度 1500 2000lux。培养直接诱导幼胚萌发出 胚芽。 0029 3、 继代、 增殖与生根培养 ： 30d 后转入 MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.1mg/L 培养基中继 代培养， 得到幼苗后切取茎段和顶芽转入 MS+NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L 培养基中扩繁， 待 增殖数量达到目标数量时转入1/2MS+NAA0.1mg/L培养基上生根， 上述培养基pH5.65.8、 蔗糖 30g/L、 琼脂 6g/L， 培养条件为温度 20 25、 光周期 10 12h/d、 光照强度 1500 2000lux。 0030 4 项同实施例一。 0031 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 不是对本发明的具体限制， 但本发明 的保护范围并不局限于此， 任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可 轻易想到的变化或替换， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 102845312 B 5 。