技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种棉花再生植株的栽培方法。
背景技术
棉花是纺织工业、精细化工的重要原料，也是重要的战略物资。转基因棉花是 最早实现商业化种植的作物之一。2011年，转基因棉花在全球的种植面积达到2470万 公顷，占棉花总面积3000万公顷的80%以上。
利用生物技术将优良性状基因转入棉花中，可打破物种界限，扩大基因资源。
目前,通过生物技术培育转基因棉花新品种常用的遗传转化方法有农杆菌介导 法、微弹轰击法和花粉管通道法等。
农杆菌介导的转化方法是借助于天然农杆菌对植物伤口感染产生冠瘿瘤或发状 根的能力改进而成的一种生物学技术。棉花的遗传转化大都采用改进后的根癌农杆菌 (含有Ti质粒)，但不同菌株对不同棉花品种的亲和力也不一样,直接影响转化效率。农 杆菌介导的基因转化所适用的外植体非常广泛，包括叶片、茎段、胚轴、叶柄、子叶、 幼胚、愈伤组织或成熟种子，但在棉花上最常用的为下胚轴。
微弹轰击法又叫基因枪转化法，利用动力将包裹DNA的微粒加速后直接射入受体 细胞中，使得外源DNA能与细胞遗传物质相接触，进而整合到基因组中。微弹轰击时 常用的受体是茎尖分生组织、胚性愈伤组织和悬浮培养细胞。
花粉管通道法最早是20世纪80年代初周光宇提出的。最初主要是通过注射将 构建的重组基因或质粒注入子房中。后来进一步发展成柱头涂抹法和花粉携带法。
这些棉花转化方法都获得了成功。但是其中应用最为广泛的仍是农杆菌介导的转 发方法，获得了多个生产中应用的转化事件。它具有以下特点：转化机理较为清楚， 转化的外源DNA片段可长达50kb，外源基因以单拷贝或低拷贝形式整合到染色体上， 遗传稳定性好。但应用该方法需要先建立完整的组织培养和植株再生体系，目前还只 在珂字棉的部分品种上建立起来，并且耗时长，转化效率较低。
提高再生的抗性植株的移栽效率将有助于提高棉花的遗传转化效率。目前主要是 通过直接生根后炼苗移栽的方法，或者通过嫁接的方法进行移栽。嫁接的方法技术性 强，对操作者的要求比较高。而通过直接生根后炼苗来移栽，容易造成大量抗性苗移 栽不成功，因为在长时间的组织培养、抗性筛选和分化过程中，许多再生植株变得生 长能力弱，根系不发达，甚至玻璃化。因此建立一种简便可行的提高移栽效率的方法 十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种栽培目的棉花植株的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）先去除目的棉花植株的茎尖、枝叶和须根，保留1-2根白色的须根或保留须 根基部，得到主干；再沿所述主干靠近根部的第一个节处断开，保留带有根部的主干 第一节，得到待继代培养的植株；
2）将所述待继代培养的植株在再生植株继代培养基中继代培养，得到再次继代 培养后再生植株；
3）将所述再次继代培养后再生植株经过炼苗、移栽，得到移栽后棉花植株；
所述目的棉花植株为经过组织培养后得到的再生棉花植株。
上述方法中，步骤2）中，所述继代培养为继代培养1-2次。
上述方法中，步骤2）中，所述再生植株继代培养基为含有终浓度为0.1mg/l NAA 的MSB固体培养基。
MSB固体培养基配方如实施例中所示。
上述方法中，步骤2）中，所述培养条件为温度33℃光培养16小时、温度25℃ 暗培养8小时；上述光培养的光照强度具体为2000LUX。
上述方法中，所述移栽包括如下步骤：
1）将经过炼苗的植株移入装有土壤的容器中，再套袋或者覆盖保鲜膜保湿一周；
2）将经过1）处理的植株去除袋或者保鲜膜，培养，得到移栽后棉花植株。
上述方法中，所述土壤为育苗基质（润坤牌，大森林花卉市场购买）与1/2体积 蛭石混合而成。
上述方法中，所述经过组织培养后得到的再生棉花植株为通过农杆菌介导的组织 培养后得到的再生棉花植株或者通过微弹轰击法介导的组织培养后得到的再生棉花植 株。
上述通过农杆菌介导的组织培养的方法得到的再生棉花植株按照实施例1的一进 行；
上述通过微弹轰击法介导的组织培养得到的再生棉花植株按照实施例2的一进 行。
本发明的实验证明，采用本发明的方法移栽棉花再生植株，可大大提高棉花再生 植株的移栽成活率。本发明操作简单，实用性强，有助于提高棉花的遗传转化效率。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中MSB培养基中的组分如表1所示，液体MSB培养基为将表1的溶质 按所示的终浓度均溶于水,并添加葡萄糖至终浓度30克/l配制得到。固体MSB培养 基是在液体MSB培养基中添加固化剂phytagel至终浓度2.5g/l。
表1为MSB培养基中的组分
大量元素 培养基中终浓度（g·L-1） NH4NO3 1.65 KNO3 1.9 KH2PO4 0.17 MgSO4.7H2O 0.37 CaCl2 0.44 微量元素 培养基中浓度（mg·L-1） FeSO4.7H2O 27.8 Na2EDTA 37.3 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.4H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 有机成分 培养基中浓度（mg·L-1） 甘氨酸 2.0 盐酸硫胺素 10 盐酸吡哆素 1 烟酸 1 肌醇 100
实施例1、农杆菌介导获得再生棉花植株的移栽
一、农杆菌介导的棉花遗传转化获得再生棉花植株
目前报道获得成功的案例中,棉花的受体品种主要是珂字棉，但也包括其它一些 品种，如中棉所12、泗棉3号、晋棉7号、华抗6号等，印度栽培棉品种Anjli(LRK 516)和LRA 5166等。遗传转化大都采用改进后的根癌农杆菌(含有Ti质粒)，如 LBA4404，PGV2260，EMH105等，但不同菌株对不同棉花品种的亲和力也不一样,直接 影响转化效率。所使用的外植体非常广泛，包括叶片、茎段、胚轴、叶柄、子叶、幼 胚、愈伤组织或成熟种子，但最常用的仍是下胚轴。在转化过程中使用的培养基成分， 激素类型，培养条件等都不尽相同。
本发明的实施例具体所使用的棉花受体品种为Coker312（利用新的外植体建 立棉花高效转化系统的研究；棉花学报，2002，14（1）：22～27.；公众可从中国 农业科学院生物技术研究所获得），农杆菌为LBA4404（购自北京天恩泽公司， 货号为12-96）,棉花受体为下胚轴。具体步骤如下：
1）无菌苗培养：Coker312种子中倒入少量浓硫酸脱绒，用75%的酒精灭菌5min， 然后用1.8%有效浓度的次氯酸钠溶液浸泡30分钟，无菌水清洗3遍。将灭菌好的种 子浸泡于无菌水中，37℃过夜。将开口的种子剥去种皮，种于1/2MSB培养基中，暗 培养9天，温度28℃，得到无菌苗。
2）农杆菌菌液的制备
将含有目的质粒pCambia3301（购自Cambia公司）的农杆菌LBA4404菌液接种到 50ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃,220rpm摇床培养至OD 0.6左 右。将菌液于5,000rpm离心5min，弃上清液，沉淀用添加了100mg/L乙酰丁香酮 的MSB液体培养基重悬起来，得到农杆菌菌液。
3）侵染和共培养
去掉1）得到的无菌苗的根和子叶，将下胚轴切成1cm左右的小段即为外植体， 将2）得到的农杆菌菌液加入外植体中，放置20min，期间摇动几次，得到侵染后的 外植体；
取出侵染后的外植体，用灭菌的滤纸吸干，然后放置在共培养基中，15个外植体 /皿，暗培养72h，温度22℃，得到共培养后的外植体。
上述共培养基按照如下方法制备：添加终浓度为0.1mg/l KT、0.1mg/l 2,4-D和 50mg/l乙酰丁香酮的的MSB固体培养基。
4）愈伤诱导和继代培养
（1）诱导培养
将3）得到的经共培养后的外植体转入诱导培养基中，培养条件为光照16小时， 黑暗8小时，温度28℃，1个月后能见到愈伤产生，得到诱导后愈伤组织；
上述诱导培养基按照如下方法制备：添加0.1mg/l KT、0.1mg/l 2,4-D、500mg/L cef、25mg/L kan的MSB固体培养基。
（2）将上述（1）得到的诱导后愈伤组织每隔1个月左右继代培养1次，共继代 5次，得到胚性愈伤组织；继代培养的条件与上述诱导培养条件一致；
第1、2次继代培养基按照如下方法制备：添加0.1mg/l KT、0.1mg/l 2,4-D、500mg/L cef、50mg/L kan的MSB固体培养基
第3次以后的继代培养基按照如下方法制备：添加0.01mg/l KT、0.01mg/l 2,4-D、 100mg/L kan的MSB固体培养基；
5）分化培养和胚状体诱导
将上述4）得到的胚性愈伤组织转入分化培养基中，培养条件为光照16小时，黑 暗8小时，温度28℃；培养2月时间，直至胚状体形成。
分化培养基按照如下方法制备：添加终浓度为0.15mg/l的KT、终浓度为0.5mg/l 的IBA、终浓度为50mg/L的kan的MSB固体培养基。
6）子叶胚和成芽诱导培养
将5）得到的胚状体愈伤转入芽诱导培养基，培养条件为光照16小时，黑暗8小 时，温度28℃，培养3月时间，直至小芽产出。
芽诱导培养基按照如下方法制备：添加了终浓度为0.15mg/l的KT、终浓度为0.5 mg/l的IBA、终浓度为1.0mg/l的Gln(谷胺酰胺)、终浓度为0.5mg/l的Asn(天冬酰 胺)、终浓度为100mg/L的kan的MSB固体培养基。
7）成苗生根培养基
将上述6）得到的长至4cm高的小芽，转入以30mg/l的蔗糖为碳源的MSB固体 中生根，培养条件为光照16小时，黑暗8小时，温度28℃，培养3月时间，得到再 生棉花植株。
将50个种子经过上述培养，得到42株再生棉花植株。
二、再生棉花植株移栽
将上述42株再生棉花植株均采用下述方法处理：
1、再生植株继代培养
1）处理
将21株再生棉花植株均先剪掉茎尖及枝叶，去掉全部褐色的须根，保留1-2根 白色的须根或者保留须根的基部，得到主干；再沿主干靠近根部的第一个节处剪断主 干，保留带有根部的主干段，得到待继代培养的植株；
2）继代培养
将1）得到的待继代培养的植株接入再生植株继代培养基中，按33℃光培养（光 照强度为2000LUX）16小时、温度25℃暗培养8小时；培养1个月左右，得到重新生 根的植株；该继代植株可长至5cm高左右、主干增粗、根系的量增加、且颜色为白色 或黄白色。
再生植株继代培养基为含有终浓度为0.1mg/l NAA的MSB固体培养基。
将上述重新生根的植株再次继代培养（培养条件和培养基不变），得到再次继代 培养后再生植株。
2、练苗和移栽
1）练苗
向含有上述1得到的长至约5cm高再次继代培养后再生植株的培养瓶中倒入2cm 厚的无菌水，将封口膜松开但不要完全移去，在培养箱中放置3天，按光照（光照强 度为2000LUX）培养16小时，温度33℃，黑暗8小时，温度25℃培养，然后将封口 膜完全移去，再放置3天，期间可以适当的加入一些无菌水，得到练苗后植株。
2）移栽
移栽时所使用的土壤为育苗基质（润坤牌，大森林花卉市场购买），其中加入1/2 体积的蛭石。移栽前一天晚上将土壤浇透，放置到第二天早上土壤的湿度刚好合适。
将练苗后植株连同培养基轻轻取出，用清水将培养基洗干净，放入花盆土壤中， 覆盖土壤并把土压实，在花盆上用吸管搭上支架，覆盖上保鲜膜或者薄塑料袋保湿， 并在塑料袋上扎孔以透气；将花盆移入培养箱中放置1个周，培养条件为光培养16 小时（光照强度为2000LUX），温度33℃，黑暗8小时，温度25℃培养。然后移除保 鲜膜或者薄塑料袋，继续放置一周。上述移栽过程中4~5天浇30ml水，以土壤不太 干为准。再将花盆移到温室中培养，培养30天，统计存活株数，共得到21株生长良 好的移栽后棉花植株。
对照：将21株再生棉花植株不经过上述二的1的再生植株继代培养，直接进行练 苗、移栽，得到12株移栽后棉花植株。
可以看出，经过继代培养后的植株存活率提高了很多。
实施例2、微弹轰击法介导获得再生棉花植株的移栽
一、微弹轰击法介导获得再生棉花植株
基因枪轰击法进行棉花遗传转化时常用的受体有茎尖分生组织、胚性愈伤组织和 悬浮培养细胞。报道获得成功的棉花受体品种有陆地棉和海岛棉。受体细胞的内在因 素和基因枪轰击参数会影响外源基因的转化效率。受体自身的因素包括外植体种类、 细胞的生理状态、细胞潜在的再生能力、轰击前后对细胞的处理以及细胞内环境对外 源DNA的接受能力等。基因枪轰击参数一般要考虑到轰击压力、轰击距离、微弹的分 散范围、程度和轰击次数。在轰击前和轰击后对细胞进行适当的渗透处理会增加外源 DNA进入细胞的机会,同时这种处理造成的轻度质壁分离可减少胞质渗漏,提高转化细 胞存活率。
本发明的实施例具体所使用的棉花受体品种为Coker312，受体材料为下胚 轴产生的胚性愈伤组织；具体步骤如下：
1）无菌苗培养：与实施例1的一的1的方法相同；
2）愈伤诱导和继代培养：
去掉1）得到的无菌苗的根和子叶，将下胚轴切成1cm左右的小段即为外植体；
将外植体转入诱导培养基中，培养条件为光照16小时，黑暗8小时，温度28℃， 1个月后能见到愈伤产生，得到诱导后愈伤组织；
上述诱导培养基按照如下方法制备：添加终浓度为0.1mg/l KT、0.1mg/l 2,4-D 的MSB固体培养基。
将上述得到的诱导后愈伤组织每隔1个月左右继代培养1次，共继代5次，得到 胚性愈伤组织；继代培养的条件和培养基成分与上述诱导培养条件一致；
3）微弹轰击
（1）将胚性愈伤组织接种到高渗固体培养基上处理4小时，温度28℃，得到待轰 击愈伤组织；
高渗固体培养基按照如下方法制备：添加终浓度0.2mol/L甘露醇+0.2mol/L山梨 醇的MSB固体培养基。
（2）将pCambia3301质粒浓缩至浓度为1μg/μl；
（3）金粉处理
①将50mg 1.0μm金粉置于1.5ml进口离心管中；
②加入1ml无菌水，充分涡旋，10000r/m离心10s，去上清，无菌水重复洗涤3 次；
③用1ml无菌50%甘油重悬金粉粒，处理后的金粉溶液可以在-20℃长期保存；
（4）微弹制备
在无菌的进口1.5ml EP管中加入30μl处理好的金粉溶液，10μlpCambia3301 的质粒DNA，100μl 2.5mol/L CaCl2，40μl 0.1mol/L亚精胺，涡旋震荡1min，迅 速置于冰上，如此重复10次。置于冰上30min以上。于12000r/m离心15s，除去上 清液。加入400μl 70%乙醇，混匀，于12000r/m离心15s，去上清液。用80μl无 水乙醇（HPLC）重悬，得到微弹无水乙醇悬浮液。
（5）微弹轰击
所用为Bio-Rod PDS-1000/He型基因枪；
①取15μl微弹无水乙醇悬浮液，点于载体膜中心位置，晾干；
②打开基因枪和氦气阀门,设置氦气压强。安装可裂膜、载体膜；
③将（1）得到的装有待轰击愈伤组织的培养皿放于是适当位置，使轰击距离为 9cm，于1100psi轰击两次愈伤，得到轰击后样品。
4）共培养、筛选培养
将3）的（5）得到的轰击后样品在高渗固体培养基上继续处理16h，然后转入诱 导培养基上培养7天，再转入筛选培养基培养2个月，得到继代后愈伤组织；上述培 养条件都是光照16小时，黑暗8小时，温度28℃。
筛选培养基按照如下方法制备：添加终浓度为0.1mg/l KT、0.1mg/l 2,4-D、50mg/L kan的MSB固体培养基；
5）分化培养和胚状体诱导
与上述实施例1的一的5）的方法相同；
6）子叶胚和成芽诱导培养
与上述实施例1的一的6）的方法相同；
7）成苗生根培养基
与上述实施例1的一的7）的方法相同，得到再生棉花植株。
将50个种子经过上述培养，得到139株再生棉花植株。
二、再生棉花植株移栽
将上述69株再生棉花植株均采用下述方法处理：
1、再生植株的继代培养
1）处理：与实施例1的方法相同；
2）继代培养：与实施例1的方法相同。
2、练苗和移栽
1）练苗：与实施例1的方法相同；
2）移栽：与实施例1的方法相同；
得到68株移栽后棉花。
对照：将69株再生棉花植株不经过上述二的1的再生植株的继代培养，直接进行 练苗、移栽，得到42株移栽后棉花。
可以看出，经过继代培养后的植株存活率提高很多。