一种治疗肿瘤的小牛脾提取物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 101940595 A (43)申请公布日 2011.01.12 CN 101940595 A *CN101940595A* (21)申请号 201010257796.0 (22)申请日 2010.08.19 A61K 35/28(2006.01) A61K 31/675(2006.01) A61K 9/08(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 7/00(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (71)申请人 吉林敖东洮南药业股份有限公司 地址 137100 吉林省洮南市团结东路。

2、 16 号 (72)发明人 杨振军 邹兆鹏 王银叶 王国栋 (74)专利代理机构 北京太兆天元知识产权代理 有限责任公司 11108 代理人 刘伟 (54) 发明名称 一种治疗肿瘤的小牛脾提取物 (57) 摘要 本发明公开了一种治疗肿瘤的小牛脾提取 物， 其中小牛脾提取物中含 5-15 重量份多肽、 0.4-1 重量份核糖。该提取物制剂可明显抑制肿 瘤， 显著拮抗化疗药环磷酰胺所致小鼠白细胞减 少、 逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制， 并且该提取 物能够治疗急性早幼粒细胞白血病。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 13 。

3、页 CN 101940599 A1/1 页 2 1. 一种治疗肿瘤的小牛脾提取物， 其特征在于小牛脾提取物中多肽与核糖的重量比 为 ： 5-15 0.4-1。 2. 如权利要求 1 所述的小牛脾提取物， 其特征在于小牛脾提取物中多肽与核糖的重量 比为 ： 6.2 0.475。 3. 一种治疗肿瘤的药物组合物制剂， 其特征在于该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取 物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成， 其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量 比为 ： 5-15 0.4-1。 4. 如权利要求 3 所述的药物组合物制剂， 其特征在于该制剂由临床日用剂量的小牛脾 提取物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂。

4、组成， 其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的 重量比为 ： 6.2 0.475。 5.如权利要求1或2所述的小牛脾提取物， 其特征在于小牛脾提取物由如下方法制备 ： 取乳牛的脾脏， 用0.9氯化钠溶液清洗， 加入1-5倍量的生理盐水进行匀浆15次， 胶体 磨粒度为 2 8m ； 将匀浆液 -10 -30深冻， 达到完全冻结后， 取出放入 20 50 以下水浴中解冻， 完全融化后继续 -10 -30条件下深冻， 如此反复进行三次 ； 将冻融 后的药液 60 100保温 30-40 分钟， 速降温至 10 20； 将上述溶液离心， 离心速度 为 3000-4000 转 / 分， 温度 0 10以下，。

5、 离心 15-30 分钟， 收集上清液 ； 分别用 100000 50000 道尔顿、 10000 9000 道尔顿、 8000 5000 道尔顿的膜超滤。 6. 如权利要求 3 或 4 所述的药物组合物制剂， 其特征在于该制剂中小牛脾提取物由如 下方法制备 ： 取乳牛的脾脏， 用 0.9氯化钠溶液清洗， 加入 1-5 倍量的生理盐水进行匀浆 1 5 次， 胶体磨粒度为 2 8m ； 将匀浆液 -10 -30深冻， 达到完全冻结后， 取出放 入2050以下水浴中解冻， 完全融化后继续-10-30条件下深冻， 如此反复进行 三次 ； 将冻融后的药液 60 100保温 30-40 分钟， 速降温至。

6、 10 20； 将上述溶液离 心， 离心速度为 3000-4000 转 / 分， 温度 0 10以下， 离心 15-30 分钟， 收集上清液 ； 分别 用 100000 50000 道尔顿、 10000 9000 道尔顿、 8000 5000 道尔顿的膜超滤。 7.如权利要求1或2所述的小牛脾提取物在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的 应用。 8. 如权利要求 1 或 2 所述的小牛脾提取物在制备拮抗环磷酰胺副作用药物中的应用。 9. 如权利要求 8 所述的应用， 其特征在于拮抗环磷酰胺所致白细胞减少、 骨髓抑制的 副作用。 10. 一种抗肿瘤用药剂盒， 其特征在于由置于包装单位中的许多独立。

7、包装且各自可取 出的 7 个日剂量单位组成， 其中第一个日剂量单位包含 4-12g 环磷酰胺注射剂和 4-12ml 小 牛脾提取物注射液， 其余六个日剂量单位仅包含小牛脾提取物注射液 4-12ml。 权 利 要 求 书 CN 101940595 A CN 101940599 A1/13 页 3 一种治疗肿瘤的小牛脾提取物 技术领域 0001 本发明涉及一种提取物， 特别涉及一种治疗肿瘤的小牛脾提取物。 技术背景 0002 癌症发病率和死亡率逐年上升， 严重威胁人类健康， 已成为人类死亡的主要原因 之一。 西医治疗多以手术、 放疗、 化疗为主， 但是应用化疗或放疗， 往往引起恶心， 食欲不振， 。

8、血象变化， 机体免疫功能损害等毒副作用， 在癌细胞受到抑制或部分杀灭的同时， 人体正常 组织细胞也相应的受到极大地摧残和伤害， 因此导致许多患者无法坚持完成放、 化疗疗程， 失去有效治疗机会。 0003 本发明提供的小牛脾提取物注射液， 是由健康乳牛 ( 出生 24h 以内 ) 脾脏为原料 提取而成的无菌水溶液。 其既能抑制肿瘤细胞， 同时可以拮抗化疗药的副作用， 提高患者体 质， 使患者能坚持完成放、 化疗疗程， 延长生存期。 发明内容 0004 本发明一个目的在于提供一种治疗肿瘤的小牛脾提取物 ； 本发明的另一个目的在 于提供小牛脾提取物在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。 000。

9、5 本发明目的在于提供一种治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液， 其中 2 6 体积份小 牛脾提取物注射液中含 5-15 重量份多肽、 0.4-1 重量份核糖 ； 所述小牛脾提取物注射液是 由如下方法制备 ： 领取乳牛的脾脏 ( 出生 24 小时以内 )， 除去掉结缔组织和脂肪， 用 0.9 氯化钠溶液清洗， 加入 1-5 倍量的生理盐水进行匀浆 1 5 次， 胶体磨粒度为 2 8m ； 将 匀浆液 -10 -30深冻， 达到完全冻结后， 取出放入 20 50以下水浴中解冻， 完全 融化后继续 -10 -30条件下深冻， 如此反复进行三次 ； 将冻融后的药液 60 100 保温30-40分钟， 速降温。

10、至1020； 将上述溶液离心， 离心速度为3000-4000转/分， 温 度 0 10以下， 离心 15-30 分钟， 收集上清液 ； 分别用 100000 50000 道尔顿、 10000 9000 道尔顿、 8000 5000 道尔顿的膜超滤 ； 0.20m 滤芯无菌过滤分装， 即得注射液。所 述重量份与体积份的关系为 mg/ml 的关系。 0006 上述治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液， 其中 2.5 体积份小牛脾提取物注射液中优 选含 6.25 重量份多肽、 0.475 重量份核糖。 0007 上述治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液， 其中 2.5 体积份小牛脾提取物注射液中优 选含 10.5 。

11、重量份多肽、 0.95 重量份核糖。 0008 上述治疗肿瘤的小牛脾提取物注射液， 其中 2.5 体积份小牛脾提取物注射液中优 选含 9 重量份多肽、 0.6 重量份核糖。 0009 本发明目的在于提供一种治疗肿瘤的制剂， 该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取 物制剂和临床日用剂量的环磷酰胺制剂组成， 其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量 比为 ： 5-15 0.4-1。 0010 上述治疗肿瘤的制剂， 该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A2/13 页 4 量的环磷酰胺制剂组成， 其中小牛脾提取物制剂中多肽与核。

12、糖的重量比为 ： 6.25 0.475。 0011 上述治疗肿瘤的制剂， 该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂 量的环磷酰胺制剂组成， 其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为 ： 9 0.6。 0012 上述治疗肿瘤的制剂， 该制剂由临床日用剂量的小牛脾提取物制剂和临床日用剂 量的环磷酰胺制剂组成， 其中小牛脾提取物制剂中多肽与核糖的重量比为 ： 10.5 0.95。 0013 所述小牛脾提取物制剂优选注射制剂。 0014 小牛脾提取物及其注射制剂在制备治疗急性早幼粒细胞白血病药物中的应用。 0015 小牛脾提取物及其注射制剂在制备拮抗环磷酰胺副作用中的应用。 0016 本发。

13、明提取一种抗肿瘤用药剂盒， 由置于包装单位中的许多独立包装且各自可取 出的 7 个日剂量单位组成， 其中第一个日剂量单位包含 4-12g 环磷酰胺注射剂和 4-12ml 小 牛脾提取物注射液， 其余六个日剂量单位包含小牛脾提取物注射液 4-12ml。 0017 上述小牛脾提取物可以通过现有技术制备， 小牛脾提取物注射制剂优选如下方法 制备 ： 0018 领取乳牛的脾脏 ( 出生 24 小时以内 )， 除去掉结缔组织和脂肪， 用 0.9氯化钠 溶液清洗， 加入 1-5 倍量的生理盐水进行匀浆 1 5 次， 胶体磨粒度为 2 8m ； 将匀浆 液 -10 -30深冻， 达到完全冻结后， 取出放入 。

14、20 50以下水浴中解冻， 完全融化 后继续 -10 -30条件下深冻， 如此反复进行三次 ； 将冻融后的药液 60 100保温 30-40 分钟， 速降温至 10 20 ； 将上述溶液离心， 离心速度为 3000-4000 转 / 分， 温度 010以下， 离心15-30分钟， 收集上清液 ； 分别用10000050000道尔顿、 100009000 道尔顿、 8000 5000 道尔顿的膜超滤 ； 0.20m 滤芯无菌过滤分装， 即得注射液。 0019 小牛脾提取物制剂可显著拮抗化疗药环磷酰胺 (CTX) 所致小鼠白细胞减少 ； 可逆 转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制， 刺激骨髓细胞的增殖， 使。

15、骨髓细胞的数量增加 ； 小牛脾提取 物均可以显著抑制 HL60 细胞的增殖， 用于治疗急性早幼粒细胞白血病。 0020 下述实验用于进一步说明本发明， 但是对本发明范围的限制。 0021 实验例 1 拮抗环磷酰胺副作用研究 0022 1. 小牛脾提取物注射液对化疗药环磷酰胺 (CTX) 所致小鼠白细胞减少的作用 0023 1.1 摘要 0024 ICR 小鼠腹腔注射小牛脾提取物注射液 9 天。第 7 天开始给予 CTX， 连续 3 天以建 立白细胞减少症动物模型， 末次给CTX后24h眼眶取血， 通过血常规分析评价小牛脾提取物 注射液对白细胞数量的影响。结果表明 ： 低剂量 (2.5ml/kg。

16、) 和中剂量 (5ml/kg) 的小牛脾 提取物注射液有升高白细胞的趋势， 但与模型相比无显著性差异， 高剂量 (10ml/kg) 小牛 脾提取物注射液可以显著升高白细胞数量。 0025 1.2 实验材料 0026 (1) 实验动物 ： 18-22g 的 ICR 小鼠 60 只， 雌雄各半。动物生产合格证号 ： scxk 京 2006-0008 0027 (2) 实验药物 ： 0028 a. 小牛脾提取物注射液 ( 实施例 1 方法制备 ) ： 吉林敖东洮南药业股份有限公司 提供， 产品批号 ： 20090505135， 为淡黄色澄明液体。有效成分含量 ： 2.5mg 多肽 /ml， 190g。

17、 核糖 /ml。临用时用灭菌生理盐水稀释。 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A3/13 页 5 0029 b. 环磷酰胺 (CTX) ： 江苏恒瑞医药股份有限公司生产， 产品批号 09081521， 为白色 粉末。临用前用灭菌生理盐水配制， 需现用现配。 0030 c. 重组人粒细胞刺激因子注射液 (rhG-CSF) ： 华北制药金坦生物技术股份有限公 司生产， 产品批号 ： 200909Y22， 为无色透明液体。临用时用用灭菌生理盐水稀释。 0031 (3) 实验仪器 ： 血液分析仪， 型号 MEK-6318K， 日本光电工业株式会社生产。 0032 1.。

18、3 实验方法与步骤 0033 ICR 小鼠 (18-22g)60 只， 雌雄各半， 动物生产合格证号 ： scxk 京 2006-0008。购自 北京大学医学部动物科学部， 随机分成 6 组 ： 正常对照组、 模型组、 阳性药 rhG-CSF(40g/ kg) 组、 小牛脾提取物低 (2.5ml/kg， 相当于 6.25mg 多肽 /kg， 475g 核糖 /kg)、 中 (5.0ml/ kg， 相当于 12.5mg 多肽 /kg， 950g 核糖 /kg)、 高剂量组 (10.0ml/kg， 相当于 25mg 多肽 / kg， 1900g 核糖 /kg)。 0034 小鼠给连续予小牛脾提取物。

19、注射液 9 天， 2 次 / 天。第 7 天开始小牛脾提取物注射 液减为 1 次 / 天， 同时给予 CTX 80mg/kg， 连续 3 天以制备模型， 末次给 CTX 后 24h 眼眶取 血， 测定白细胞数量。 0035 1.4 实验结果 0036 结果显示 ： 模型组动物的白细胞数明显低于正常对照组， 表明模型成功。 小牛脾提 取物注射液高剂量组的白细胞数量明显高于模型组， 说明该剂量下小牛脾提取物注射液可 以抑制白细胞数下降， 与阳性对照 GM-CSF 组药效相当。中剂量有升高白细胞数量的趋势， 但模型组相比无显著性差异， 低剂量无效(见表1)。 同时分析白细胞分类计数结果后， 发现 小。

20、牛脾提取物高剂量组和 GM-CSF 组的淋巴细胞数量均较模型组有显著性升高 ( 见表 2)。 说明小牛脾提取物注射液高剂量和 GM-CSF 主要升高白细胞中的淋巴细胞数量。提示小牛 脾提取物注射液可以提高小鼠机体免疫力。 0037 表 1 小牛脾提取物对环磷酰胺诱导的白细胞减少症的影响 (n 10) 0038 0039 正常组比较 ： P 0.01 ； 与模型组比较 ： *P 0.05， *P 0.01 0040 表 2 小牛脾提取物对环磷酰胺诱导的淋巴细胞减少的影响 (n 10) 0041 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A4/13 页 6 0042 与正。

21、常组比较 ： P 0.01 ； 与模型组比较 ： *P 0.05， *P 0.01 0043 2. 小鼠血清中 GM-CSF 含量测定 0044 2.1 摘要 0045 ICR 小鼠腹腔注射小牛脾提取物注射液 9 天。第 7 天开始给予 CTX， 连续 3 天以建 立白细胞减少症动物模型， 末次给CTX后24h 眼眶取血， 测定血样中GM-CSF的含量， 评价小 牛脾提取物注射液对机体生成 GM-CSF 的影响， 以反映骨髓造血系统的功能。结果表明 ： 模 型组中的 GM-CSF 含量较正常组显著升高， 提示化疗药引起骨髓抑制， 反馈性刺激机体生成 过量的 GM-CSF。小牛脾提取物显著减少 。

22、GM-CSF 含量， 使之接近正常组。表明提取物改善了 骨髓细胞功能， 减轻了骨髓抑制对 GM-CSF 的反馈性刺激。 0046 2.2 实验材料 0047 (1) 测定试剂盒 ： 小鼠 GM-CSF Elisa 检测试剂盒， 美国 RB 公司产品产品批 ； 0048 (2) 血清样品 ： 末次给予环磷酰胺 24h 后摘眼球取血， 离心 (3000r/min， 10min) 所 得血清， -20冻存备用。 0049 2.3 实验仪器 0050 550 型酶标仪， 美国 BIO-RAD 产品 ； MCO-15AC 二氧化碳培养箱， 日本 SANYO 产品 0051 2.4 实验方法与结果 005。

23、2 ICR 小鼠 (18-22g)60 只， 雌雄各半， 动物生产合格证号 ： scxk 京 2006-0008。购自 北京大学医学部动物科学部， 随机分成 6 组 ： 正常对照组、 模型组、 阳性药 rhG-CSF(40g/ kg) 组、 小牛脾提取物低 (2.5ml/kg， 相当于 6.25mg 多肽 /kg， 475g 核糖 /kg)、 中 (5.0ml/ kg， 相当于 12.5mg 多肽 /kg， 950g 核糖 /kg)、 高剂量组 (10.0ml/kg， 相当于 25mg 多肽 / kg， 1900g 核糖 /kg)。 0053 小鼠连续给予小牛脾提取物注射液 9 天， 2 次 。

24、/ 天。第 7 天开始小牛脾提取物注 射液减为 1 次 / 天， 同时给予 CTX 80mg/kg， 连续 3 天以制备模型， 末次给 CTX 后 24h 眼眶 取血， 按试剂盒步骤测定血样中 GM-CSF 的含量。结果显示 ： 模型组中的 GM-CSF 含量较正常 组显著升高， 提示因骨髓抑制反馈性刺激机体生成过量的 GM-CSF。小牛脾提取物显著减少 GM-CSF 含量， 使之接近正常组 ( 见表 3)。表明提取物改善了骨髓细胞功能， 减轻了骨髓抑 制对 GM-CSF 的反馈性刺激。 0054 表 3 小牛脾提取物对小鼠血清中 GM-CSF 含量的影响 (n 10) 0055 说 明 书 。

25、CN 101940595 A CN 101940599 A5/13 页 7 0056 与正常组比较 ： P 0.01 ； 与模型组比较 ： *P 0.01 0057 3. 小牛脾提取物注射液对骨髓细胞体外增殖的作用 0058 3.1 摘要 0059 无菌条件下取白细胞减少症小鼠的股骨骨髓， 用 10 RPMI 1640 培养基制备成细 胞悬液， 用 MTT 法测定小牛脾提取物注射液在体外对骨髓细胞增殖的影响， 以评价小牛脾 提取物注射液是否通过刺激骨髓细胞的增殖来升高白细胞数量。结果表明 ： 小牛脾提取物 注射液各个浓度组的 OD 值与生理盐水组相比均显著升高。表明小牛脾提取物注射液在体 外可。

26、逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制， 刺激骨髓细胞的增殖， 使骨髓细胞的数量增加。 0060 3.2 实验材料 0061 (1) 实验动物 ： 18-22g 的 ICR 小鼠 4 只， 雄性。生产合格证号 ： scxk 京 2006-0008 0062 (2) 实验药物 ： 0063 a. 小牛脾提取物注射液 ( 实施例 1 方法制备 ) ： 吉林敖东洮南药业股份有限公司 提供， 产品批号 ： 20090505135， 为淡黄色澄明液体。临用时用灭菌生理盐水稀释 ； 0064 b. 环磷酰胺 (CTX) ： 江苏恒瑞医药股份有限公司生产， 产品批号 09081521， 为白色 粉末。临用前用灭菌生理。

27、盐水配制， 需现用现配 ； 0065 c. 重组人粒细胞刺激因子注射液 (rhG-CSF) ： 华北制药金坦生物技术股份有限公 司生产， 产品批号 ： 200909Y22， 为无色透明液体。临用时用用灭菌生理盐水稀释。 0066 (3) 实验仪器 ： 550 型酶标仪， 美国 BIO-RAD 产品 ； 3K15 台式离板机， Sigma 产品 ； Anke TDL-40B 离心机， 上海安亭科学仪器厂产品。 0067 (4)实验试剂 ： RPMI 1640培养基为美国GIBCOBRL公司产品， 噻唑兰(MTT)为美国 GIBCOBRL 公司产品， PAA 实验室胎牛血清， 二甲基亚砜为天津化工。

28、厂产品。 0068 3.3 实验方法 0069 连续3天给予小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg/kg以制备骨髓抑制模型， 末次给药24h 后无菌取小鼠双侧股骨， 用 6 号针头插入股骨， 连接已吸入 5ml 不完全 RPMI-1640 培养基的 注射器用于冲取骨髓细胞， 将细胞冲入烧杯中， 连续冲洗三次， 总量为 8ml， 将冲出的骨髓细 胞于4号半针头过滤以制成单细胞悬液， 然后离心(1000r/min10min)， 弃上清， 用含10 FBS 的 RPMI-1640 培养基制备成 5105/ml 的细胞悬液。于 96 孔板中每孔加入细胞悬液 100l， 设为五组， 每组 6 个复孔， 分组情况为。

29、 ： 0070 a. 生理盐水组 ： 每孔加入无菌生理盐水 100l ； 0071 b.rhG-CSF 组 ： 每孔加入浓度为 2g/ml 的 G-CSF 溶液 100l， rhG-CSF 终浓度为 1g/ml ； 0072 c. 小牛脾提取物注射液高剂量组 ： 每孔加入注射液 100l， 终浓度为 500l/ 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A6/13 页 8 ml ； 0073 d. 小牛脾提取物注射液中剂量组 ： 每孔加入用无菌生理盐水稀释 4 倍的注射液 100l， 终浓度为 125l/ml ； 0074 e. 小牛脾提取物注射液低剂量组 ： 每孔加。

30、入用无菌生理盐水稀释 16 倍的注射液 100l， 终浓度为 31.2l/ml。 0075 然后置 96 孔板于 5 CO2， 37饱和湿度培养箱中培养， 24h 后每孔加入 0.5 (5mg/ml)噻唑蓝(MTT)20l， 继续反应4h， 1000r/min离心15min， 弃上清， 每孔加入二甲基 亚砜(DMSO)200l， 充分混匀后静置数分钟， 置酶标仪于570nm处测定吸光度(OD)值， 以代 表骨髓细胞的数量。 0076 3.4 实验结果 0077 小牛脾提取物注射液各个浓度组的OD值与生理盐水组相比均显著升高(见表4)， 表明小牛脾提取物注射液在体外可逆转环磷酰胺对骨髓细胞的抑制。

31、， 刺激骨髓细胞的增 殖， 使骨髓细胞的数量增加。 0078 表 4 小牛脾提取物对骨髓细胞体外增殖的影响 (n 4) 0079 0080 与生理盐水组相比 ： *P 0.05 ； *P 0.01 0081 实验例 2 小牛脾提取物注射液治疗急性早幼粒细胞白血病的研究 0082 1. 小牛脾提取物注射液对 HL60 细胞生长的影响 0083 1.1 摘要 0084 将 HL60 细胞在含有不同浓度的小牛脾提取物的培养液中培养不同的时间， 用 MTT 法测定其在570nm处的吸光度以评价细胞的增殖程度。 结果表明 ： 与生理盐水组相比， 各个 浓度的小牛脾提取物均可以显著抑制 HL60 细胞的增。

32、殖， 并随时间延长作用增强。 0085 1.2 实验材料 0086 (1) 细胞系 ： HL60 细胞， 为急性早幼粒细胞白血病细胞系 0087 (2) 实验药物 ： 小牛脾提取物注射液 ( 实施例 1 方法制备 ) ： 吉林敖东洮南药业股 份有限公司提供， 产品批号 ： 20100101 133， 为淡黄色澄明液体， 临用前用灭菌生理盐水稀 释。 0088 (3) 实验仪器 ： 550 型酶标仪， 美国 BIO-RAD 产品 ； 3K15 台式离板机， Sigma 产品 ； Anke TDL-40B 离心机， 上海安亭科学仪器厂 ； MCO-15AC 二氧化塘培养箱， 日本 SANYO 产品。

33、 ； DL-CJ-1N 高性能无菌实验台哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司产品 ； HH-W420 数显三用恒温水浴箱， 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 0089 (4) 实验试剂 ： RPMI 1640 培养基 ： 美国 GIBCO 产品 ； 噻唑兰 (MTT) ： 美国 GIBCO 产 品 ； 胎牛血清 ： PAA 产品 ； DMSO ： 天津化工厂产品。 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A7/13 页 9 0090 1.3 实验方法 0091 (1) 配制 RPMI 1640 高糖培养基 ： 精确称取 250mg 葡萄糖， 用 10ml 的 1。

34、0 FBS RPMI1640 培养基溶解， 然后用 0.22m 滤膜过滤于一个 100ml 的玻璃瓶中， 再补加 90ml 的 10FBS 1640培养基即可配制成葡萄糖浓度达4.5g/l的高糖培养基， 仅用于实验， 以刺激 HL60 细胞的糖酵解。平时培养仍使用含糖量正常的 10 FBS RPMI 1640 培养基 ( 下同 ) ； 0092 (2) 收集处于对数生长期， 状态良好的 HL60 细胞， 离心 (4， 1000rpm8min)， 然 后用高糖培养基重悬， 计数， 然后稀释至 2102/ml ； 0093 (3) 加入 100l 细胞悬液至 96 孔板， 分为生理盐水组、 小牛脾。

35、提取物注射液高、 中、 低浓度组。 每组4个复孔， 然后分别加入生理盐水和不同浓度的小牛脾提取物各100l 至对应的孔中， 使小牛脾提取物的终浓度分别达到 ： 0， 31.2， 125和500l/ml。 振摇孔板数 次以使细胞混匀， 然后放入 CO2培养箱 (5 CO2， 37 ) 中培养， 分别在开始培养后 2h， 4h， 8h 三个时间点各取出一块 96 孔板， 每孔加入 0.5 (5mg/ml)MTT 20l， 继续培养 4h， 使用 离板机离心 (1000rpm15min)， 弃上清， 每孔加入 DMSO 200l， 充分混匀后静置数分钟， 置酶标仪于 570nm 处测定吸光度， 以反。

36、映 HL60 细胞的生长情况。 0094 1.4 实验结果 0095 统计结果表明 ： 与各时间点生理盐水对照组相比， 各个浓度的小牛脾提取物均可 以显著抑制 HL60 细胞的增殖， 并随时间延长作用增强 ( 见表 5)。 0096 表 5 小牛脾提取物对 HL60 细胞体外增殖的影响 (n 4) 0097 0098 与生理盐水组相比 ： *P 0.05， *P 0.01 0099 2. 小牛脾提取物注射液对 HL60 细胞乳酸生成的作用研究 0100 2.1 摘要 0101 将 HL60 细胞与不同浓度的小牛脾提取物共培养 8h， 然后离心取上清， 脱蛋白后测 定上清中乳酸的含量。结果表明 。

37、： 与生理盐水组相比， 31.2， 125 和 500l/ml 三个浓度的 小牛脾提取物注射液均可以显著的抑制 HL60 细胞产生乳酸， 尤其是较高的两个浓度。 0102 2.2 实验材料 0103 (1) 细胞系 ： HL60 细胞 0104 (2) 实验药物 ： 小牛脾提取物注射液 ( 实施例 1 方法制备 ) ： 吉林敖东洮南药业股 份有限公司提供， 产品批号 ： 20100101 133， 为淡黄色澄明液体， 临用前用灭菌生理盐水稀 释。 0105 2.3 实验仪器 0106 UV-1100 型紫外可见分光光度计， 北京普瑞分析仪器公司产品 ； Anke TGL-16G-A 高速离心机。

38、， 上海安亭科学仪器厂 ； MCO-15AC 二氧化塘培养箱， 日本 SANYO 产品 ； DL-CJ-1N 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A8/13 页 10 高性能无菌实验台， 哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公司产品 ； HH-W420 数显三 用恒温水浴箱， 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。 0107 2.4 实验试剂 0108 乳酸检测试剂盒 ： 南京建成生物工程研究所产品， 批号 ： 20100324 ； 70.0高氯 酸 ： 分析纯， 天津市鑫源化工有限公司产品 ； 氯化钠 ： 分析纯， 北京北化精细化学品有限责 任公司 ； RPMI 。

39、1640 培养基 ： 美国 GIBCO 产品 ； 胎牛血清 ： PAA 产品 ； G250 考马斯亮蓝 ： 北京 鼎国生物技术有限公司产品 0109 2.5 实验方法 0110 (1)收集处于对数生长期、 状态良好的HL60细胞， 离心(4、 1000rpm、 8min)， 然后 用高糖培养基重悬， 计数， 约为 15105/ml ； 0111 (2) 加入 6 孔板， 330l 细胞悬液 / 孔， 再加 670l 的高糖培养基 / 孔 ( 序贯法 加液)， 分为 ： 生理盐水和不同浓度给药组。 每组3个复孔， 然后分别加入生理盐水和不同浓 度的小牛脾提取物各 1000l 至对应的孔中， 使小。

40、牛脾提取物的终浓度分别达到 ： 0， 31.2， 125 和 500l/ml。振摇孔板数次， 以使细胞混匀， 然后放入 CO2培养箱中， 培养 8h。将细胞 收集于2ml EP管中， 离心(4， 1000rpm8min)， 吸取上清置于另一2ml EP管中， 用于测定 上清中的乳酸含量 ； 细胞用于测定总蛋白含量 ( 所有 EP 管均需标明 1， 2， 3 等序号， 以保证 乳酸测定数据和蛋白测定数据可以准确对应 ) ； 0112 (4) 上清液预处理 ： 分别转移 3 份体积的上清液或乳酸标准品溶液于 1 份体积的 20冰高氯酸中， 然后冰上孵育至少 30min， 离心 (4， 13000r。

41、pm， 6min)， 转移上清于另一 个 EP 管中， -20冻存备用。剩余操作严格按照试剂盒要求进行 ； 0113 (5) 细胞总蛋白提取及含量测定 ： 每管加入细胞裂解液 200l， 用涡旋混合器震 荡 30s 以使细胞充分裂解， 离心 (4， 10000rpm5min)， 吸取上清， -20冻存备用。然后 采用 BCA 法测定样品中蛋白含量 ； 0114 (6) 乳酸浓度校正 ： 用细胞总蛋白校正， 单位换算为 mol/mg 蛋白。 0115 2.6 实验结果 0116 统计结果标明 ： 小牛脾提取物与HL60细胞共培养8h后， 各个浓度的小牛脾提取物 组乳酸含量均明显下降， 表明它抑制。

42、了 HL60 细胞的糖酵解过程， 因而乳酸生成减少 ( 见表 6)。 0117 表 6 小牛脾提取物对 HL60 细胞乳酸含量的影响 (n 3) 0118 0119 与生理盐水组相比 ： *P 0.05， *P 0.01 0120 3. 小牛脾提取物注射液对 HL60 细胞 ATP 含量的作用研究 0121 3.1 摘要 0122 将 HL60 细胞在含不同浓度的小牛脾提取物的高糖培养液中培养 8h， 离心去除上 清， 裂解细胞， 利用生物发光法检测胞内ATP水平。 结果表明 ： 与生理盐水组相比， 31.2， 125 说 明 书 CN 101940595 A CN 101940599 A9/。

43、13 页 11 和 500l/ml 三个浓度的小牛脾提取物均可显著降低 HL60 细胞的 ATP 水平， 提示小牛脾提 取物可能抑制 HL60 细胞的糖酵解。 0123 3.2 实验材料 0124 (1) 细胞系 ： HL60 细胞 0125 (2) 实验药物 ： 小牛脾提取物注射液 ( 实施例 1 方法制备 ) ： 吉林敖东洮南药业股 份有限公司提供， 产品批号 ： 20100101 133， 为淡黄色澄明液体， 临用前用灭菌生理盐水稀 释。 0126 (3) 实验仪器 ： 20/20n Luminometer， Turner BioSystems 产品 ； 550 型酶标仪， 美 国 BI。

44、O-RAD 产品 ； Anke TDL-40B 离心机， 上海安亭科学仪器厂 ； MCO-15AC 二氧化塘培养箱， 日本 SANYO 产品 ； DL-CJ-1N 高性能无菌实验台哈尔滨东联电子技术开发有限公司北京分公 司产品 ； HH-W420 数显三用恒温水浴箱， 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 0127 (4) 实验试剂 ： ATP 生物发光检测试剂盒， 威格拉斯生物技术 ( 北京 ) 有限公司产 品 ； 氯化钠 ： 分析纯， 北京北化精细化学品有限责任公司 ； RPMI 1640 培养基 ： 美国 GIBCO 产 品 ； 胎牛血清 ： PAA 产品 ； G250 考马斯亮蓝 ： 北京。

45、鼎国生物技术有限公司产品。 0128 3.3 实验方法 0129 (1)收集处于对数生长期、 状态良好的HL60细胞， 离心(4、 1000rpm、 8min)， 然后 用高糖培养基重悬， 计数， 约为 15105/ml。 0130 (2) 加入 6 孔板， 330l 细胞悬液 / 孔， 再加 670l 的高糖培养基 / 孔 ( 序贯法 加液)， 分为 ： 生理盐水和不同浓度给药组。 每组3个复孔， 然后分别加入生理盐水和不同浓 度的小牛脾提取物各 1000l 至对应的孔中， 使小牛脾提取物的终浓度分别达到 ： 0， 31.2， 125 和 500l/ml。振摇孔板数次， 以使细胞混匀， 然后。

46、放入 CO2培养箱中， 培养 8h ； 0131 (3)测定样品ATP浓度 ： 将细胞收集于2ml EP管中， 离心(4， 1000rpm， 8min)， 弃 上清， 每管加入 1ml 冰 PBS 清洗细胞， 离心， 弃上清， 每管加入 150l 裂解液 (EP 管应始终 置于冰上， 因为细胞裂解后释放的 ATP 酶可以降解 ATP)， 涡旋震荡 30s 以使其充分裂解， 然 后上机检测(由于发光液不稳定， 尽量在配置好2h内用完 ； 同时， 应保持每个样品的操作时 间一致 )。其余操作严格按试剂盒要求进行 ； 0132 (4) 测定样品总蛋白 ： 测定 ATP 浓度的剩余样品用于测定细胞总蛋。

47、白含量， 采用 BCA 法 ( 预实验发现样品浓度过高， 超过标准品线性范围， 稀释 3 倍重新测定 ) ； 0133 (5)ATP 浓度校正 ： 用细胞总蛋白校正， 单位换算为 mol/g 蛋白。 0134 3.4 实验结果 0135 统计结果表明 ： HL60 细胞在含有小牛脾提取物的高糖培养液培养 8h 后， 牛脾提取 物可浓度地降低 HL60 细胞的 ATP 含量 ( 见表 7)。提示该提取物可能抑制了肿瘤细胞的糖 酵解途径， 因而 ATP 生成减少。 0136 表 7 小牛脾提取物对 HL60 细胞 ATP 生成的影响 (n 3) 0137 说 明 书 CN 101940595 A 。

48、CN 101940599 A10/13 页 12 0138 与生理盐水组相比 ： *P 0.05， *P 0.01 0139 4. 小牛脾提取物注射液对 HL60 细胞凋亡的影响 0140 4.1 摘要 0141 将 HL60 细胞在含有不同浓度的小牛脾提取物的培养液中培养 8h， 离心收集细胞， 70冰乙醇固定过夜， 250g/ml RNase 37水浴消化 30min， 然后上机检测分析 HL60 细 胞的凋亡率和细胞周期。 结果表明 ： 与生理盐水组相比， 高浓度(125l/ml)的小牛脾提取 物可明显地增加 HL60 细胞凋亡率， 并明显增加 S 期细胞的百分率。 0142 4.2 实验材料 0143 (1) 细胞系 ： HL60 细胞 0144 (2) 实验药。