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1、(10)授权公告号 CN 103053422 B (45)授权公告日 2014.03.26 CN 103053422 B (21)申请号 201310007286.1 (22)申请日 2013.01.09 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 成都华都农业发展有限责任公司 地址 610000 四川省成都市双流县兴隆镇天 明村 4 组 （天明村村委会院内） (72)发明人 李明亮 叶子军 宋新元 林虹 梁果风 伍波 张治军 (74)专利代理机构 四川省成都市天策商标专利 事务所 51213 代理人 刘兴亮 CN 1561687 A,2005.01.12,说明书第2页第 4-23。
2、 行 . CN 1742563 A,2006.03.08, 权利要求 1. CN 1701661 A,2005.11.30, 全文 . CN 102450150 A,2012.05.16, 全文 . CN 1930953 A,2007.03.21, 全文 . 李洪林等 . 沉水植物微齿眼子菜的离体快速 繁殖 ( 简报 ). 亚热带植物科学 .2008, 第 37 卷 ( 第 2 期 ), 第 71 页 . 李洪林等 . 沉水植物竹叶眼子菜的组织培养 和快速繁殖 .植物生理学通讯 .2007, 第 43 卷 ( 第 2 期 ), 第 329 页 . (54) 发明名称 繁殖穿叶眼子菜的方法 (5。
3、7) 摘要 本发明公开了一种繁殖穿叶眼子菜的方法， 属于生物技术领域， 该方法包括以下的步骤 ： 采 集穿叶眼子菜， 去除叶和根， 用水冲洗 1 2h 后， 取顶端含 2 3 个节的茎， 用蒸馏水洗净茎 ； 先后 用乙醇和次氯酸钠对茎消毒灭菌 ； 将茎接种到装 有培养基的培养瓶中培养 30 35 天后即可繁殖 新植株， 所述的培养基经高温灭菌。 本发明的方法 中每 2-3 段茎可繁殖 4-9 新植株， 无感染率达 95% 以上 ； 培养周期为45天， 培养周期短 ； 新植株驯化 后作为工程苗使用的成活率为 99% 以上， 解决了 穿叶眼子菜种苗数量不足， 成活率低， 污染物多等 技术问题， 可。
4、快速、 大量繁殖无菌及成活率高的穿 叶眼子菜。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 冀敏 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 (10)授权公告号 CN 103053422 B CN 103053422 B 1/1 页 2 1. 一种繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于包括下述步骤 ： 1） 采集穿叶眼子菜， 去除叶和根， 用水冲洗 1 2h 后， 取顶端含 2 3 个节的茎， 用蒸 馏水洗净茎 ； 2） 先后用乙醇和次氯酸钠对茎消毒灭菌 ； 3） 将茎接种到装有培养基的培养瓶中培养 30 35 天后。
5、即可繁殖新植株， 所述的培养 基经高温灭菌 ； 所述的培养基每升中包含下述重量的组分 ： 蔗糖 20 30 克， NAA0.1 0.3 毫克， 6 BA0.3 0.6 毫克， 硝酸铵 1650 毫克， 硝酸钾 1900 毫克， 二水氯化钙 440 毫克， 硫 酸镁 370 毫克， 磷酸二氢钾 170 毫克， 碘化钾 0.83 毫克， 硼酸 6.2 毫克， 硫酸锰 22.3 毫克， 硫酸锌 8.6 毫克， 钼酸钠 0.25 毫克， 硫酸铜 0.025 毫克， 氯化钴 0.025 毫克， 硫酸亚铁 27.8 毫克， 乙二胺四乙酸二钠 37.3 毫克， 肌醇 100 毫克， 烟酸 0.5 毫克， 盐。
6、酸吡哆醇 0.5 毫克， 盐 酸硫胺素 0.1 毫克， 甘氨酸 2 毫克。 2. 根据权利要求 1 所述的繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于还包括下述的步骤 ： 将 新植株作为新一代培养的母本， 重复上述步骤 3） 。 3.根据权利要求1或2所述的繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于还包括下述的步骤 ： 将新植株置于 1/2 霍格兰溶液中炼苗 15 天后， 作为工程苗使用。 4. 根据权利要求 3 所述的繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于所述的 1/2 霍格兰溶液 每 2 升包含下述重量的组分 ： 硝酸钙 945 毫克， 硝酸钾 607 毫克， 磷酸铵 115 毫克， 硫酸镁 493毫克， 硫酸。
7、亚铁13.9毫克， 乙二胺四乙酸二钠37.3毫克， 碘化钾0.83毫克， 硼酸6.2毫 克， 硫酸锰22.3毫克， 硫酸锌8.6毫克， 钼酸钠0.25毫克， 硫酸铜0.025毫克， 氯化钴0.025 毫克。 5.根据权利要求1所述的繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于步骤2） 中所述的用乙醇 和次氯酸钠对茎消毒灭菌包括以下步骤 ： 用体积分数为 50% 70% 乙醇浸泡灭菌 30 60 秒钟， 然后用无菌蒸馏水冲洗3遍 ； 再用质量分数为0.51%的次氯酸钠浸泡灭菌1020 分钟， 再用无菌蒸馏水冲洗 3 遍。 6.根据权利要求1所述的繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于步骤3） 中所述的高温灭 。
8、菌是在 120 125 摄氏度下， 灭菌 30 40min。 7. 根据权利要求 1 所述的繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于步骤 3) 中所述培养的 条件为培养基 pH5.8 6.0， 温度 20 28， 光照强度 1800 2500Lx， 光照时间为每天 8-12h。 权 利 要 求 书 CN 103053422 B 2 1/4 页 3 繁殖穿叶眼子菜的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及到一种沉水植物穿叶眼子菜的繁殖方法。 背景技术 0002 近年来湖泊、 水库富营养化问题的日益严重， 水生态系统受到严重破坏。 沉水植物 是水生态系统中的初级生产者之一， 具有净化。
9、水质和减缓底泥释放的能力， 通过藻类的化 感作用， 抑制藻类的生长和繁殖。穿叶眼子菜应用于水生态系统工程中具有增加沉水植物 种群多样性、 提高水生态系统稳定性保证水体水质的功能。穿叶眼子菜作为高等水生植物 是水生态构建、 修复、 调控中主要的生物材料之一。 0003 穿叶眼子菜是多年生沉水草本， 具有发达的根茎， 在我国许多水体中都能生存， 对 水环境具有较宽的耐受能力和较强的适应能力。 0004 目前穿叶眼子菜种苗主要从自然河流、 湖泊中采集， 由于从自然界采集的种苗含 有大量污染物， 如藻类、 虫害及幼虫卵等。 应用于水生态系统工程时， 其植株生枝、 发根能力 弱， 成活率低。 因此通过人。
10、工培育具有无污物、 生根和发芽能力强的穿叶眼子菜种苗是成功 定植的关键。 发明内容 0005 本发明的目的是克服水生态构建、 修复、 调控工程中， 穿叶眼子菜种苗数量不足， 成活率低， 污染物多等缺点， 因此本发明提供一种利用穿叶眼子菜茎芽进行无菌培养大量 工程苗的繁殖方法， 该方法能够有效解决穿叶眼子菜用于水生态构建、 修复、 调控工程时， 其种苗数量不足、 质量差、 成活率低等缺点。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明采取以下的技术方案 ： 0007 一种繁殖穿叶眼子菜的方法， 其特征在于包括下述步骤 ： 0008 1） 采集穿叶眼子菜， 去除叶和根， 用水冲洗 1 2h 后， 取顶。
11、端含 2 3 个节的茎， 用蒸馏水洗净茎 ； 0009 2） 先后用乙醇和次氯酸钠对茎消毒灭菌 ； 0010 3） 将茎接种到装有培养基的培养瓶中培养 30 35 天后即可繁殖新植株， 所述的 培养基经高温灭菌。 0011 进一步的技术方案是 ： 将培养长出的新植株作为新一代培养的母本， 重复上述的 步骤 3） ， 穿叶眼子菜可连续培养多代。 0012 进一步的技术方案是 ： 将新植株置于 1/2 霍格兰溶液中练苗 15 天后， 可作为工程 苗使用。 0013 进一步的技术方案是 ： 所述的培养基每升中包含下述重量的组分 ： 蔗糖 20 30 克， NAA0.1 0.3 毫克， 6 BA0.3。
12、 0.6 毫克， 硝酸铵 1650 毫克， 硝酸钾 1900 毫克， 二水 氯化钙 440 毫克， 硫酸镁 370 毫克， 磷酸二氢钾 170 毫克， 碘化钾 0.83 毫克， 硼酸 6.2 毫克， 硫酸锰 22.3 毫克， 硫酸锌 8.6 毫克， 钼酸钠 0.25 毫克， 硫酸铜 0.025 毫克， 氯化钴 0.025 毫 说 明 书 CN 103053422 B 3 2/4 页 4 克， 硫酸亚铁 27.8 毫克， 乙二胺四乙酸二钠 37.3 毫克， 肌醇 100 毫克， 烟酸 0.5 毫克， 盐酸 吡哆醇 0.5 毫克， 盐酸硫胺素 0.1 毫克， 甘氨酸 2 毫克。 0014 进一步的。
13、技术方案是 ： 所述的 1/2 霍格兰溶液每 2 升包含下述重量的组分 ： 硝酸 钙 945 毫克， 硝酸钾 607 毫克， 磷酸铵 115 毫克， 硫酸镁 493 毫克， 硫酸亚铁 13.9 毫克， 乙二 胺四乙酸二钠 37.3 毫克， 碘化钾 0.83 毫克， 硼酸 6.2 毫克， 硫酸锰 22.3 毫克， 硫酸锌 8.6 毫克， 钼酸钠 0.25 毫克， 硫酸铜 0.025 毫克， 氯化钴 0.025 毫克。 0015 进一步的技术方案是 ： 步骤 2） 中所述的用乙醇和次氯酸钠对茎消毒灭菌包括以 下步骤 ： 用体积分数为50%70%乙醇浸泡灭菌3060秒钟， 然后用无菌蒸馏水冲洗3遍 。
14、； 再用质量分数为 0.5 1% 的次氯酸钠浸泡灭菌 10 20 分钟， 再用无菌蒸馏水冲洗 3 遍。 0016 进一步的技术方案是 ： 步骤 3） 中所述的高温灭菌是在 120 125 摄氏度下， 灭菌 30 40min。 0017 进一步的技术方案是 ： 步骤 3) 中所述培养的条件为培养基 pH5.8 6.0， 温度 20 28， 光照强度 1800 2500Lx， 光照时间为每天 8-12h。 0018 本发明的有益效果是 ： 0019 1） 利用穿叶眼子菜的茎采用无菌培养基进行无菌培养， 每 2-3 段茎可繁殖 4-9 新 植株， 无感染率达 95% 以上 ； 采用培养长出的新植株作。
15、为母本培养的下一代新植株， 无感染 率达99%以上， 新植株练苗后作为工程苗使用的成活率为99%以上， 解决了穿叶眼子菜种苗 数量不足， 成活率低， 污染物多等技术问题。 0020 2） 采用本发明培养穿叶眼子菜新植株的周期为 45 天左右， 培养周期短， 可快速大 量的繁殖穿叶眼子菜， 解决穿叶眼子菜种苗数量不足等问题。 0021 3） 本发明中配制的培养基可满足穿叶眼子菜的茎繁殖时所需的营养组分， 促进穿 叶眼子菜的茎快速繁殖。 具体实施方式 0022 下面结合本发明具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。 0023 实施例 1 ： 0024 本实施例为从野外采集 20 株穿叶眼子菜， 。
16、经过几个月的时间， 通过连续 5 代的无 菌培养共繁殖约 60000 株穿叶眼子菜。 0025 本实施例包括以下步骤 ： 0026 步骤 1 ： 采集自然水体中生长健壮的穿叶眼子菜 20 株， 去除叶和根， 用水冲洗 1-2h， 取顶端含 2-3 个节的茎， 在用蒸馏水将茎冲洗干净。 0027 步骤2 ： 先后用乙醇和次氯酸钠对茎消毒灭菌 ： 先用体积分数为50%70%乙醇浸 泡灭菌 30 60 秒钟， 然后用无菌蒸馏水冲洗 3 遍 ； 再用质量分数为 0.5 1% 的次氯酸钠 浸泡灭菌 10 20 分钟， 再用无菌蒸馏水冲洗 3 遍。 0028 步骤 3 ： 配制培养基及培养基高温灭菌 ： 。
17、每升培养基中包含下述重量的组分 ： 蔗糖 20 30 克， NAA0.1 0.3 毫克， 6 BA0.3 0.6 毫克， 硝酸铵 1650 毫克， 硝酸钾 1900 毫 克， 二水氯化钙 440 毫克， 硫酸镁 370 毫克， 磷酸二氢钾 170 毫克， 碘化钾 0.83 毫克， 硼酸 6.2毫克， 硫酸锰22.3毫克， 硫酸锌8.6毫克， 钼酸钠0.25毫克， 硫酸铜0.025毫克， 氯化钴 0.025 毫克， 硫酸亚铁 27.8 毫克， 乙二胺四乙酸二钠 37.3 毫克， 肌醇 100 毫克， 烟酸 0.5 毫 说 明 书 CN 103053422 B 4 3/4 页 5 克， 盐酸吡哆醇。
18、 0.5 毫克， 盐酸硫胺素 0.1 毫克， 甘氨酸 2 毫克， 其余为蒸馏水。培养基 pH 为 5.8-6.0， 培养基高温灭菌是在温度 120-125下， 灭菌 30-40min。 0029 步骤 4 ： 将茎接种到培养基中培养 ： 接种前用体积分数为 75% 的酒精喷洒工作台， 并用紫外线灯对操作间及工作台灭菌20-30min。 将步骤2消毒灭菌后的茎接种到装有培养 基的培养瓶中， 根据本发明的一个实施例， 每250ml的培养瓶中装有100ml的培养基可放置 2-3 段茎， 然后置于温度 20 28， 光照强度 1800 2500Lx， 光照时间为每天 8-12h 的培 养条件下培养， 。
19、培养30-35天后， 每个培养瓶中有4-9株新植株， 每株长为5-10cm， 无污染率 为 95% 以上。 0030 步骤 5 ： 将步骤 4 培养的新植株作为新一代培养的母本， 将新植株切成 2-3 段， 重 复上述步骤 4。 0031 采用新植株培养的二代、 三代及之后的每代的新植株的无污染率为 99% 以上。 0032 本实施例经过几个月时间， 连续培养 5 代， 共繁殖约 60000 株新穿叶眼子菜植株。 0033 实施例 2 ： 0034 本实施例为采集穿叶眼子菜苗的 1000 株， 经过 60 天左右， 连续培养二代后， 每 45 天可提供 20000 瓶约 100000 株新苗，。
20、 定植于水生态工程水体中， 成活率可达 99% 以上。 0035 本实施例包括下述步骤 ： 0036 步骤 1 ： 采集生长健壮的穿叶眼子菜 1000 株， 去除叶和根， 用水冲洗 1-2h， 取顶端 含 2-3 个节的茎， 在用蒸馏水将茎冲洗干净。 0037 步骤2 ： 先后用乙醇和次氯酸钠对茎消毒灭菌 ： 先用用体积分数为50%70%乙醇 浸泡灭菌 30 60 秒钟， 然后用无菌蒸馏水冲洗 3 遍 ； 再用质量分数为 0.5 1% 的次氯酸 钠浸泡灭菌 10 20 分钟， 再用无菌蒸馏水冲洗 3 遍。 0038 步骤 3 ： 配制培养基及培养基高温灭菌 ： 每升培养基中包含下述重量的组分 。
21、： 蔗糖 20 30 克， NAA0.1 0.3 毫克， 6 BA0.3 0.6 毫克， 硝酸铵 1650 毫克， 硝酸钾 1900 毫 克， 二水氯化钙 440 毫克， 硫酸镁 370 毫克， 磷酸二氢钾 170 毫克， 碘化钾 0.83 毫克， 硼酸 6.2毫克， 硫酸锰22.3毫克， 硫酸锌8.6毫克， 钼酸钠0.25毫克， 硫酸铜0.025毫克， 氯化钴 0.025 毫克， 硫酸亚铁 27.8 毫克， 乙二胺四乙酸二钠 37.3 毫克， 肌醇 100 毫克， 烟酸 0.5 毫 克， 盐酸吡哆醇 0.5 毫克， 盐酸硫胺素 0.1 毫克， 甘氨酸 2 毫克， 其余为蒸馏水。培养基 pH 。
22、为 5.8-6.0， 培养基高温灭菌是在温度 120-125下， 灭菌 30-40min。 0039 步骤 4 ： 将茎接种到培养基中培养 ： 接种前用体积分数为 75% 的酒精喷洒工作台， 并用紫外线灯对操作间及工作台灭菌 20-30min。将步骤 2 消毒灭菌后的茎接种到装有培 养基的培养瓶中， 根据本发明的一个实施例， 每250ml的培养瓶中放置100ml培养基可放置 2-3 段茎， 然后置于温度 20 28， 光照强度 1800 2500Lx， 光照时间为每天 8-12h 的培 养条件下培养， 培养30-35天后， 每个培养瓶中有4-9株新植株， 每株长为5-10cm， 无污染率 为 。
23、95% 以上。 0040 步骤 5 ： 将新植株切成 2-3 段， 作为二代培养的母本进行二代培养， 共接种 5000 瓶， 重复上述步骤 4， 培养得到二代新植株， 无污染率为 99% 以上。 0041 步骤 6 ： 将步骤 5 培养的二代新植株作为三代培养的母本进行三代培养， 将新植株 切成 2-3 段， 共接种 25000 瓶， 重复上述步骤 4， 得到三代新植株。 0042 步骤 7 ： 将三代新植株中 5000 瓶的新植株作为下一代的母本继续培养， 重复上述 说 明 书 CN 103053422 B 5 4/4 页 6 步骤 4。 0043 步骤 8 ： 配制 1/2 霍格兰溶液 ：。
24、 每 2 升 1/2 霍格兰溶液包含下述重量的组分 ： 硝酸 钙 945 毫克， 硝酸钾 607 毫克， 磷酸铵 115 毫克， 硫酸镁 493 毫克， 硫酸亚铁 13.9 毫克， 乙二 胺四乙酸二钠 37.3 毫克， 碘化钾 0.83 毫克， 硼酸 6.2 毫克， 硫酸锰 22.3 毫克， 硫酸锌 8.6 毫克， 钼酸钠 0.25 毫克， 硫酸铜 0.025 毫克， 氯化钴 0.025 毫克， 其余的为蒸馏水。 0044 步骤 9 ： 将三代新植株中剩余的 20000 瓶的新植株置于 1/2 霍格兰溶液中练苗 15 天后， 即可用于工程苗使用， 练苗可以提高植物对自然环境的适应性， 提高成活率等。 0045 利用 5000 瓶的植株作为母本连续培养， 平均每 45 天可提供 100000 株穿叶眼子菜 工程苗， 成活率可达 99% 以上。 0046 尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述， 上述实施例仅为本发 明较佳的实施方式， 本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 应该理解， 本领域技术人 员可以设计出很多其他的修改和实施方式， 这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则 范围和精神之内。 说 明 书 CN 103053422 B 6 。