发明领域
本发明涉及用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患(例如自身 免疫性疾病、移植排斥、手术后治疗和获得性血友病)的方法。
发明背景
IgG是包括通过二硫键结合在一起的两个重链和两个轻链的异四聚 体，形成被柔性并对蛋白酶敏感的铰链区隔开的三蛋白结构域。两个相同 的Fab部分结合抗原而单独的Fc部分负责效应功能，包括结合并活化补 体因子C1q和白细胞上的Fc受体。
除了多肽主链之外，Fc部分在每个重链上含有与Asn-297相连的保守 的聚糖。这一寡糖具有以核心岩藻糖与最深处的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc) 相连的复杂二天线型。这些聚糖位于CH2结构域(重链的第二恒定结构域) 间的界面上。
EndoS是由人类病原体化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)分泌的 内切糖苷酶。EndoS在两个核心GlcNAc残基间特异性地水解IgG上天冬 酰胺连接的聚糖。与许多相关的需要糖蛋白底物变性或被糖蛋白底物变性 加强的内切糖苷酶相比，EndoS只水解天然IgG。迄今没有发现EndoS的 其他底物。
发明概述
本发明人表明了EndoS在治疗和预防由IgG抗体介导的疾病中是有用 的。尤其是发明人表明了EndoS在人类血液中以及兔体内有效地水解IgG， 经由EndoS的IgG的去糖基化取消了其在小鼠中引起关节炎的能力，以及 EndoS在致死的IgG促使的特发性血小板减少性紫癜(ITP)的小鼠模型中 具有保护性作用。病原抗体的EndoS预处理抑制这一疾病的发展，而且所 述酶还在已出现严重的血小板减少和皮下出血时从已确定的疾病中解救 小鼠。
根据本发明，因此提供了EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸在 制备用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的药物中的用途。
本发明还提供了：
-EndoS肽，或编码EndoS多肽的多核苷酸，以用于治疗或预防由 IgG抗体介导的疾病或疾患的方法中；
-在需要其的受治疗者中治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患 的方法，所述方法包括对受治疗者施用治疗有效量的EndoS多肽，或编码 EndoS多肽的多核苷酸；以及
-离体处理采自患有由IgG抗体介导的疾病或疾患的患者的血液的 方法，包括将所述血液与EndoS多肽接触。
附图简述
图1A是人类IgG1的结构模型。括号标明IgG的结合抗原的Fab部分 和Fc效应子部分。箭头标明与重链的Asn-297相连的两个保守的聚糖。图 1B是完全取代的IgG重链聚糖的图示。S2标明完全唾液酸化的糖形，G0 和括号标明G0糖形的范围。LCA标明用于凝集素(lectin)实验的扁豆(Lens culinaris)凝集素(agglutinin)的结合位点而EndoS标明所述酶的切割位 点。
图2是来自不同化脓性链球菌血清型(马链球菌(S.equi)和兽疫链 球菌(S.zooepidemicus))的EndoS同系物的ClustalW氨基酸序列比对。 株系名称、种和M血清型示于左边。氨基酸同一性和相似性以灰色表示而 共有序列在比对下方表示。框出了保守的几丁质酶基序并用比对下方的星 号标记活性必需的谷氨酸。
图3是EndoS的α结构域和来自Elizabethkingia meningoseptica的 EndoF2以及来自假结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)的 CP40的ClustalW氨基酸序列比对。蛋白名称示于左边。以灰色表示氨基 酸同一性和相似性而共有序列在比对下方表示。框出了保守的几丁质酶基 序并用比对下方的星号标记活性必需的谷氨酸。
图4显示了EndoS的结构域组织。全长EndoS(SEQ ID NO：2)的995 个氨基酸的图示。Ss标明信号肽，标明了α-结构域中几丁质酶家族18活 性位点基序并用箭头标明了产生两个结构域的SpeB切割位点。
图5显示了对人类血液中EndoS活性的分析。图5A显示了对来自与 逐渐增加浓度的重组EndoS(rEndoS)一起孵育的人类血液的纯化的IgG的 SDS-PAGE分析。图5B显示了对来自与逐渐增加浓度的rEndoS一起孵育 的人类全血的纯化的IgG的LCA凝集素印迹分析。图5C显示了对从与逐 渐增加浓度的rEndoS一起孵育的人类血液纯化的IgG的凝集素印迹的光 密度分析。
图6显示了对兔中EndoS体内活性的分析。图6A显示了对来自在第 一次静脉内注射500μg的rEndoS后于标明的时间点从兔采集的血清样品 的纯化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(LCA印迹)。图 6B显示了对来自在第二次施用rEndoS后于标明的时间点从兔采集的血清 样品的纯化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(LCA印迹)。 图6C显示了对来自在第三次施用rEndoS后于标明的时间点从兔采集的血 清样品的纯化的IgG的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹分析(LCA印迹)。
图7显示了兔抗体对rEndoS的反应。在第一次、第二次和第三次注 射rEndoS后于标明的时间点从兔采集血清样品。在蛋白质印迹中，将所 述血清作为第一抗血清，用于具有SDS-PAGE分离的纯化的rEndoS的不 同的膜条上。
图7A也显示了兔抗体对rEndoS的反应。血清样品与图7的相同。插 图：如图7中的使用第一次注射后的血清样品作为第一抗血清的蛋白质印 迹。主图：第一次、第二次和第三次注射后的血清样品用作使用固定EndoS 进行的ELISA实验中的第一抗血清。抗EndoS的IgG的浓度(ng/ml)与 第一次注射前的浓度相比出现增加。展示了一个代表性实验。
图8显示了对与和不与EndoS孵育并通过10％的SDS-PAGE分离的 IgG单克隆抗体(CIIC1和M2139)的SDS-PAGE(染色)和凝集素印迹 分析(印迹)。通过考马斯蓝染色(染色)或通过对用GNL凝集素探测的 膜的印迹(印迹)分析凝胶。CIIC1(IgG2a)单克隆抗体与EndoS(泳道1)以 及不与EndoS(泳道2)孵育；M2139(IgG2b)单克隆抗体与EndoS(泳道3)以 及不与EndoS(泳道4)孵育。
图9显示了来自用正常的和EndoS处理的CII结合抗体：(a)M2139、 (b)M2139D、(c)CIIC1、(d)CIIC1D和(e)对照处理的大鼠的并染色的关节 切片(10μm)。放大倍率为x10。用EndoS去糖基化的抗体标明为“D”。 对1-2日龄的新生大鼠腹膜内注射1mg的CII结合抗体(正常的和EndoS 处理的)。抗体传输二十四小时后将爪解剖并在OCT化合物中用异戊烷和 干冰迅速冷冻。用生物素化的抗小鼠κ(187.1)抗体和HRP轭合的第二抗 体作为检测系统用标准实验方案进行免疫组织化学分析。
图10显示了接受未处理的或EndoS处理的抗CII单克隆抗体的小鼠 中关节炎的发生率(a)和严重度(b)。在0天用9mg未处理的(n＝7)或EndoS 处理的(n＝5)抗CII单克隆抗体(M2139和CIIC1)注射雄性(BALB/c X B10.Q) F1小鼠组。在第5天用50μg的大肠杆菌(E.coli)LPS腹膜内注射所有小 鼠。将所有小鼠用于计算。误差条线标明平均值±SEM。
图11显示了接受未处理的或EndoS处理的抗CII单克隆抗体的小鼠中 关节炎的发生率(a)和严重度(b)。在0天用9mg未处理的(n＝11)或EndoS 处理的(n＝12)抗CII单克隆抗体(M2139和CIIC1)注射雄性B10.RIII小鼠。 在第5天用50μg的大肠杆菌LPS腹膜内注射所有小鼠。将所有小鼠用于 计算。误差条线标明平均值±SEM。
图12显示了补体成分C1q在：(a)使用不同浓度的正常(BALB/c x B10.Q)F1血清的CII包被的抗体结合板上；和(b)以0.25％的正常(BALB/c x B10.Q)F1血清直接抗体包被的板上的沉积。误差条线标明平均值±SD。
图13显示了补体成分C3b在：(a)使用不同浓度的正常(BALB/c x B10.Q)F1血清的CII包被的抗体结合板上；和(b)以0.125％正常(BALB/c x B10.Q)F1血清直接抗体包被的板上的沉积。误差条线标明平均值±SD。
图14显示了单克隆抗体的去糖基化对嗜中性粒细胞(PMNL)氧化猝 发的影响。将正常的(M2139或CIIC1)或去糖基化的(M2139-D或CIIC1-D) 单克隆抗体包被在羧化聚苯乙烯微粒(1μm)上。在将来自肝素化的全血 样品的PMNL与抗体包被的珠孵育后使用FACS测定它们的氧化猝发能 力。结果是来自每组中5只小鼠的平均值。使用了具有三种不同基因型的 B10.Q小鼠(FcgR+/+、FcgR-/-和FcgR+/-)。“培养基”和“珠”组构成两 组不同的阴性对照。PMA组是阳性对照。用RB6-APC轭合物识别PMNL。
图15显示了在静脉内(第1天和第5天)传输9mg的单克隆抗体混 合物(M2139和CIIC1或M2139D和CIIC1D)的B10.RIII小鼠的血清中 通过ELISA测量的抗CII抗体的水平。使用多标记计数仪(VICTOR 1420， Wallac)测量平均铕荧光单位。
图16显示了病原IgG抗体的EndoS预处理抑制了小鼠中抗体介导的 血小板减少。图片A：雌性BALB/c小鼠(n＝3)接受腹膜内注射的兔抗小 鼠血小板IgG(αPLT-IgG)。每隔一定间隔采集血液样品并用流式细胞术测 定血小板计数。图片B：用已用GST-EndoS(n＝4)或GST(n＝4)预处理的 αPLT-IgG注射的BALB/c小鼠的存活标绘图。图片C：通过流式细胞术对 来自己接受GST-EndoS预处理的αPLT-IgG的小鼠的血液样品测定的随时 间的血小板计数。
图17显示了EndoS从致死的IgG介导的血小板减少解救小鼠。图片 A：用αPLT-IgG注射并且随后在施用αPLT-IgG 3小时后用GST-EndoS(n＝8) 或GST(n＝8)处理的BALB/c小鼠的存活标绘图。图片B：从注射αPLT-Ig 24、48或72(仅GST-EndoS处理)小时后GST-EndoS或GST-处理的小鼠 纯化的IgG的SDS-PAGE分析(染色)和LCA凝集素印迹分析(LCA印 迹)。图片C：在接受GST-EndoS处理的小鼠中每隔一定间隔采集血液样 品并用流式细胞术测定血小板计数。图片D：注射αPLT-Ig并随后在出现 明显的腹内出血迹象时(施用αPLT-Ig后5-7h)用GST-EndoS(n＝7)或GST (n＝7)处理的BALB/c小鼠的存活标绘图。
序列简述
SEQ ID NO：1是从化脓性链球菌AP1分离的EndoS的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是从化脓性链球菌AP1分离的EndoS的氨基酸序列， 包括信号序列。
SEQ ID NO：3是从化脓性链球菌AP1分离的编码EndoS的核酸序列， 包括信号序列。
发明详述
本发明提供了治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患的方法，该方 法包括对受治疗者施用EndoS多肽或编码EndoS多肽的多核苷酸。
本发明人发现EndoS在人类血液中以及兔体内水解IgG，经由EndoS 的IgG的去糖基化取消了其在小鼠中引起关节炎的能力，以及EndoS在致 死的IgG促使的特发性血小板减少性紫癜(ITP)的小鼠模型中具有保护 性作用。病原抗体的EndoS预处理抑制了这一疾病的发展，而且所述酶还 在已出现严重的血小板减少和皮下出血时从已确定的疾病中解救了小鼠。 因此，EndoS可用于治疗或预防由IgG抗体介导的疾病或疾患。
多肽
EndoS多肽优选为化脓性链球菌EndoS或保留了IgG内切糖苷酶活性 的化脓性链球菌EndoS的变体或片段。所述变体可是来自另一生物体例如 另一细菌的EndoS多肽。所述细菌优选为链球菌例如马链球菌、兽疫链球 菌或优选地化脓性链球菌。可选地，所述变体可来自假结核棒状杆菌例如 CP40蛋白；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)例如EndoE蛋白；或 Elizabethkingia meningoseptica(以前称为脑膜脓毒性黄杆菌 (Flavobacterium meningosepticum))例如EndoF2蛋白。来自不同化脓性 链球菌血清型以及来自马链球菌和兽疫链球菌的EndoS变体的序列示于图 2。图3显示了EndoS的α结构域和来自Elizabethkingia meningoseptica的 EndoF2以及来自假结核棒状杆菌的CP40的比对。
EndoS多肽可含有：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少50％的同一性并具有IgG 内切糖苷酶活性的其变体；或
(c)具有IgG内切糖苷酶活性的其任一片段。
优选地，所述多肽含有或由SEQ ID NO：1的序列组成。SEQ ID NO： 1是没有信号序列的成熟形式的EndoS的序列，并相应于SEQ ID NO：2 的氨基酸37至995。
此外多肽可包含信号序列。因此EndoS多肽可含有：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少50％的同一性并具有IgG 内切糖苷酶活性的其变体；或
(c)具有IgG内切糖苷酶活性的其任一片段。
EndoS多肽可由SEQ ID NO：2中所示的序列组成。
变体多肽是氨基酸序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的序列 不同但保留了与EndoS相同的本质特征或基本功能性的那些多肽。因此变 体多肽可显示出IgG内切糖苷酶活性。通常，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有大于约50％、55％或65％的同一性，优选至少70％、 至少80％、至少90％并尤其优选至少95％、至少97％或至少99％的同一性 的多肽被认为是所述蛋白的变体。只要所述肽保留了EndoS的基本功能性， 这些变体可包含等位基因的变体和蛋白序列中单个氨基酸或氨基酸组的 缺失、修饰或添加。可在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示序列的 至少100、至少250、至少500、至少750、至少800、至少850、至少900、 至少950、至少955或更多连续氨基酸的区域上或更优选地在SEQ ID NO： 1或SEQ ID NO：2的全长上测量SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的变体 的同一性。
可使用任何适合的算法计算氨基酸同一性。例如UWGCG包提供了可 用来计算同源性(例如在其默认设置上使用)的BESTFIT程序(Devereux 等人(1984)Nucleic Acids Research 12，387-395)。PILEUP和BLAST算法 可用于计算同源性或比对(line up)序列(例如鉴定相等或相应的序列(通 常在他们的默认设置上))，例如，如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S，F等人(1990)J Mol Biol 215：403-10中所描述的。
进行BLAST分析的软件是可通过National Center for Biotechnology Information(美国国家生物技术信息中心)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 公开获得的。这一算法包括首先在查询序列中通过鉴定长度W的短字(其 在与数据库序列中同等长度的字比对时匹配或满足某个正值的阈值分T) 鉴定高分序列对(HSP)。T被称为相邻字得分阈值(Altschul等人，同上)。 这些最初的相邻字匹配(hits)起到用于开始搜索以找到含有它们的HSP 的种子的作用。只要累积的比对得分可增加就将字匹配沿每一个序列向两 个方向延伸。当：累积的比对得分从其达到的最大值下降数量X；由于一 个或多个负分残基比对的积累，累积得分变为零或以下；或到达任一个序 列的末端时，停止字匹配在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T 和X决定了比对的敏感度和速度。BLAST程序使用字长(W)11， BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89：10915-10919)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝4和对比 两条链为默认值。
BLAST算法在两序列间进行相似性的统计分析；参见，例如Karlin 和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787。由BLAST算法 提供的一个相似性尺度是最小和概率(P(N))，其提供了在两个多核苷酸 或氨基酸序列之间的匹配随机发生的概率的标示。例如，如果在一序列和 另一序列的比较中最小和概率小于约1，优选地小于约0.1，更优选地小于 约0.01并且最优选地小于约0.001，那么认为第一序列与第二序列相似。
通常变体序列相差至少1、2、3、5、10、20、30、50、100或更多突 变(其可是氨基酸的取代、缺失或插入)。例如，可形成从1至100、2至 50、3至30或5至20个氨基酸的取代、缺失或插入。修饰的多肽通常保 留作为IgG特异性内切糖苷酶的活性。取代优选地是(例如依照下表的) 保守的取代。第二列中同一区中的氨基酸以及优选地第三列中同一行中的 氨基酸可互相取代：
SEQ ID NO：1的氨基酸序列的变体优选地含有SEQ ID NO：1的残 基191至199，即SEQ ID NO：1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、 Asp-195、Val-196、Asp-197、Val-198和Glu-199(其对应于SEQ ID NO： 2的残基227至235，即SEQ ID NO：2的Leu-227、Asp-228、Gly-229、 Leu-230、Asp-231、Val-232、Asp-233、Val-234和Glu-235)。这些氨基酸 构成了以谷氨酸结尾的完美的几丁质酶家族18活性位点。几丁质酶活性 位点中的谷氨酸对酶促活性来说是必须的。因此最优选地，SEQ ID NO：1 的变体含有SEQ ID NO：1的Glu-199而SEQ ID NO：2的变体含有SEQ ID NO：2的Glu-235。假如SEQ ID NO：1的变体含有SEQ ID NO：1的Glu-199， 那么所述变体可含有具有一个或多个保守性取代的SEQ ID NO：1的残基 191至199。可选择地，假如SEQ ID NO：2的变体含有SEQ ID NO：2的 Glu-235，那么所述变体可含有具有一个或多个保守性取代的SEQ ID NO： 2的残基227至235。
用于本发明的EndoS多肽的片段通常为至少10例如至少20、30、40、 50或更多个氨基酸长度直至100、200、250、300、500、750、800、850、 900、950或955个氨基酸长度，只要其保持EndoS的IgG内切糖苷酶活性。 优选地，用于本发明的EndoS多肽的片段包含SEQ ID NO：1的残基191 至199，即SEQ ID NO：1的Leu-191、Asp-192、Gly-193、Leu-194、Asp-195、 Val-196、Asp-197、Val-198和Glu-199(SEQ ID NO：2的残基227至235， 即SEQ ID NO：2的Leu-227、Asp-228、Gly-229、Leu-230、Asp-231、Val-232、 Asp-233、Val-234和Glu-235)。SEQ ID NO：2的优选片段由SEQ ID NO： 2的氨基酸37至995即SEQ ID NO：1组成，其相应于去除信号肽后的由 化脓性链球菌分泌的EndoS形式。本发明的另一个优选片段由SEQ ID NO： 1的氨基酸1至409(SEQ ID NO：2的氨基酸37至445)组成，其相应于 通过链球菌半胱氨酸蛋白酶SpeB切割产生的EndoS的酶学活性α结构域。
用于本发明的多肽可被化学修饰，例如翻译后修饰。例如它们可被糖 基化、磷酸化或含有修饰的氨基酸残基。它们可通过添加组氨酸残基以帮 助它们纯化或通过添加信号序列以促进对细胞膜的插入来修饰。这些修饰 的多肽属于本文所用的术语“多肽”的范围。
通常，依照本发明使用的多肽表现出免疫球蛋白内切糖苷酶活性尤其 是IgG内切糖苷酶活性。优选地，所述多肽水解IgG的天冬酰胺连接的聚 糖的β-1，4-二-N-乙酰壳二糖核。优选地，所述活性是对IgG特异性的。内 切糖苷酶活性可通过适当的测定方法测定。例如可将测试多肽与IgG在适 当的温度例如37℃孵育。之后可通过SDS PAGE分析起始材料和反应产物。 通常如果测试多肽具有IgG内切糖苷酶活性，则IgG重链的分子量被减少 约3kDa。另一种用于测定测试多肽是否具有IgG内切糖苷酶活性的测定是 经由使用扁豆凝集素(LCA)，可选择地使用辣根过氧化物酶和过氧化物 酶底物的糖基化IgG的检测。通常，如果测试多肽具有IgG内切糖苷酶活 性，则糖类信号被减小。另一种用于测定测试多肽是否具有IgG内切糖苷 酶活性的测定是通过将测试多肽与纯化的IgG的Fc片段孵育，之后用 10mM二硫苏糖醇还原样品并用质谱法(MALDI-TOF)分析。通常如果测 试多肽具有IgG内切糖苷酶活性，则单体IgG的Fc的质量被减少1417± 14Da。
多肽的内切糖苷酶活性可通过抑制研究被进一步表征。
多肽的内切糖苷酶活性通常是IgG特异性的，因为当与这些免疫球蛋 白在允许切割IgG的条件下孵育时，所述多肽不能降解其他类型的Ig，即 IgM、IgA、IgD和IgE。EndoS多肽具有水解待治疗的受治疗者中存在的 IgG分子的能力。因此，当受治疗者是人类时，EndoS多肽能够水解人类 IgG。EndoS能够水解所有四个亚类的人类IgG(IgG1-4)。在优选的实施方 案中，EndoS多肽具有水解人类、猕猴、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、犬 和猪IgG的能力。
用于本发明的多肽可以是基本上分离的形式。应当理解的是多肽可与 不干扰所述多肽的预期作用的载体或稀释剂混合并依旧被认为是基本上 分离的。用于本发明的多肽还可以是大致纯化的形式，在这种情况下其将 通常在制品中含有所述多肽，其中制品中多于50％，例如多于80％、90％、 95％或99％重量的多肽是本发明的多肽。
用于本发明的多肽可从表达EndoS多肽或EndoS多肽变体的任何适当 的生物体中分离。通常，EndoS多肽从适当的链球菌的EndoS表达菌株， 优选地化脓性链球菌的菌株中分离。适当的生物体和菌株可通过许多技术 鉴定。例如，最初可测试化脓性链球菌菌株的ndoS基因的存在。可以例 如SEQ ID NO：1、2或3为基础设计多核苷酸引物或探针。之后可通过使 用了这样的引物的PCR或通过探针与所述化脓性链球菌菌株的基因组 DNA杂交证实ndoS基因的存在。
可通过测定培养物上清液中IgG内切糖苷酶活性或通过使用针对 EndoS的抗体进行免疫检测来鉴定表达活性EndoS或其变体的链球菌菌 株。已被证实为表达活性EndoS的链球菌菌株是化脓性链球菌M1血清型 菌株AP1和SF370、马链球菌菌株4047和兽疫链球菌菌株H70。此外， 在下列化脓性链球菌菌株中发现了ndoS基因：M1血清型菌株SSI-1和 MGAS5005、M2血清型菌株MGAS10270、M3血清型菌株MGAS315、 M4血清型菌株MGAS10750、M5血清型菌株Manfredo、M6血清型菌株 MGAS10394、M12血清型菌株MGAS9429、M18血清型菌株MGAS8232、 M28血清型菌株MGAS6180和M49血清型菌株591。
从表达的化脓性链球菌培养物或从表达EndoS的其他细胞的培养物分 离和纯化EndoS通常是以IgG内切糖苷酶活性为基础的。优选地纯化方法 包括硫酸铵沉淀步骤和离子交换层析步骤。根据一种方法，通过加入逐渐 增加量的硫酸铵分级培养基。硫酸铵的量可为10％至80％。优选地用50％ 的硫酸铵分级培养基，并将所得上清液用70％的硫酸铵进一步沉淀。之后 粒状沉淀的多肽可经历离子交换层析，例如通过Mono Q柱上的FPLC。 可测定洗脱级分的IgG内切糖苷酶活性并收集峰值活性的级分。可通过 SDS PAGE分析级分。可将级分贮存于-80℃。在可选择的纯化EndoS的方 法中，使用GST基因融合系统(Amersham-Pharmacia Biotech，Uppsala， Sweden)在大肠杆菌中表达没有信号序列的EndoS(即，具有SEQ ID NO： 1的序列)。使用具有BamHI位点(下划线的)的引物5′-ACT-GGG-ATC-CCG-GAG-GAG-AAG-ACT-3′和具有XhoI位点(下划线的)引物 5′-TTA-ATC-TCG-AGG-TTG-CTA-TCT-AAG-3′从化脓性链球菌基因组 DNA扩增覆盖ndoS序列的碱基304至3232的2929碱基对的PCR产物。 将这一片段用BamHI和XhoI消化并连接至pGEX-5X-3产生用于转化大肠 杆菌BL21(DE3)pLys的质粒pGEXndoS。用0.1mM异丙基β-D-硫代半乳 糖吡喃糖苷诱导pGEXndoS/BL21(DE3)pLys。诱导后，用 BugBusterTM(Novagen)裂解细菌并在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶()上纯化GST-EndoS融合蛋白。根据实验方案 (Amersham-Pharmacia Biotech)使用因子Xa去除GST标记并用XarrestTM琼脂糖(Novagen)去除剩余的因子Xa。这产生了均质的重组EndoS(rEndoS) 的制品，如通过SDS-PAGE和使用EndoS特异性抗体的蛋白质印迹所估定 的。体内实验之前通过0.2μm的过滤器(Millipore)灭菌过滤蛋白样品。 将纯化的EndoS蛋白于-80℃贮存于磷酸盐缓冲盐水中。
本发明使用的多肽还可被制备为这些分离的多肽的片段。此外，还可 合成性地或通过重组的方法制得所述EndoS多肽。例如，可通过用含有与 适当的控制序列可操作地相连的编码所述多肽的核苷酸序列的表达载体 转染培养中的哺乳动物细胞，培养细胞，提取并纯化由细胞产生的EndoS 多肽来生产重组EndoS多肽。
用于本发明的多肽的氨基酸序列可被修饰以含有非天然存在的氨基 酸或增加化合物的稳定性。当通过合成的方法生产多肽时，可在生产过程 中引入这些氨基酸。多肽还可在合成或重组生产后被修饰。
还可用D-氨基酸生产用于本发明的多肽。在这样的情况中，氨基酸将 以C至N的反向的顺序连接。对于生产这种多肽来说，这在本领域中是常 规的。
在本领域中许多侧链修饰是已知的而且可用于EndoS多肽的侧链，只 要多肽保留IgG内切糖苷酶活性。
多核苷酸
编码EndoS多肽或变体的多核苷酸可用于治疗或预防由病原IgG抗体 介导的疾病或疾患。特别地，多核苷酸可包括或由下列物质组成：(a)SEQ ID NO：3的编码序列；(b)由于遗传密码而对于如(a)中所定义的序列为简 并的序列；(c)与如(a)或(b)中所定义的序列具有至少60％同一性并编码具 有IgG内切糖苷酶活性的多肽的序列；或(d)如(a)、(b)或(c)中所定义的序 列中的任何一个的片段，其编码具有IgG内切糖苷酶活性的多肽。
通常，多核苷酸是DNA。但多核苷酸可以是RNA多核苷酸。多核苷 酸可以是单链或双链并可包括合成的或修饰的核苷酸。
本发明的多核苷酸通常可与SEQ ID NO：3的编码序列或编码序列的 互补序列在显著高于背景的水平上杂交。例如，由于DNA文库中存在的 其他DNA，可发生背景杂交。本发明的多核苷酸和SEQ ID NO：3的编码 序列或编码序列的互补序列之间的相互作用产生的信号水平通常为其他 多核苷酸和SEQ ID NO：3的编码序列之间相互作用强度的至少10倍，优 选地至少100倍。可通过例如放射性标记探针(诸如用32P)测量相互作用 强度。通常可使用中至高严格度的条件实现选择性的杂交。但可在本领域 已知的任何适合的条件下进行这种杂交(参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，1989)。例如，如 果需要高严格度，那么适合的条件包括于60℃直到65℃下从0.1至0.2x SSC。如果需要较低的严格度，那么适合的条件包括于60℃下2xSSC。
可通过核苷酸取代(例如从1、2或3至10、25、50、100、200、500 或750个取代)修饰SEQ ID NO：3的编码序列。可通过一个或多个插入 和/或缺失和/或通过任一或两端的延伸可选择地或另外地修饰SEQ ID NO：3的多核苷酸。还可包括附加序列例如信号序列。修饰的多核苷酸通 常编码具有IgG特异性内切糖苷酶活性的多肽。如例如上文表中所示，可 进行简并取代和/或进行当修饰的序列被翻译时产生保守性氨基酸取代的 取代。
能够与SEQ ID NO：3的DNA编码序列的互补序列选择性地杂交的 核苷酸序列通常与SEQ ID NO：3的编码序列在至少20，优选地至少30， 例如至少40、至少60、至少100、至少200、至少500，更优选地至少750 个相连核苷酸的区域中或最优选地在SEQ ID NO：3的全长或编码具有 SEQ ID NO：1或2中所示序列的多肽的SEQ ID NO：3长度中具有至少 60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％ 的序列同一性。可通过任何适合的方法(例如如前文描述的)测定序列同 一性。
可用上文提及的序列同一性程度和最小大小的任何组合定义本发明 的多核苷酸，同时更严格的组合(即在较长的长度上较高的序列同一性) 是优选的。因此，例如和在500个核苷酸上具有至少95％序列同一性的多 核苷酸一样，在60，优选地100个核苷酸上具有至少90％序列同一性的多 核苷酸形成本发明的一个方面。
多核苷酸片段优选地为至少20，例如至少25、至少30或至少50个 核苷酸长度。通常它们将多达100、150、250或500个核苷酸长度。片段 可长于500个核苷酸长度，例如多达600、700、800、900、1000、1500、 2000、2500或3000个核苷酸长度，或者甚至直到缺少SEQ ID NO：3编 码序列的很少的核苷酸例如5、10或15个核苷酸。
可重组地、合成地或通过对本领域技术人员来说可行的任何方法生产 用于本发明的多核苷酸。还可通过标准技术克隆它们。多核苷酸通常以分 离和/或纯化的形式提供。
通常，通过合成的方法生产短的多核苷酸，所述方法包括一次一个核 苷酸的逐步制备所需核酸序列。在本领域中，使用自动化技术完成这一方 法的技术是很容易获得的。
通常使用重组方法例如用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术生产较长 的多核苷酸。这包括制备需要克隆的ndoS基因区域的一对引物(例如约 15-30个核苷酸)，将引物与从细菌细胞获得的DNA相接触，在发生所需 区域的扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过在 琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可将引物设计为含有 适当的限制性酶识别位点，以便可将扩增的DNA克隆至适合的克隆载体 中。
这些技术可被用来获得本文描述的ndoS基因序列的全部或部分。尽 管通常本文所提及的技术是本领域熟知的，还是特别引用了Sambrook等 人(1989)。
如本文所描述的EndoS多核苷酸在用于本发明的多肽的生产中有用， 其可在体外、体内或离体进行。多核苷酸本身可用作治疗剂或可用于重组 蛋白合成。
通常将用于本发明的多核苷酸并入重组的可复制载体中。载体可用于 在相容的宿主细胞中复制核酸。因此可通过将EndoS多核苷酸引入可复制 载体，将所述载体引入相容的宿主细胞并在发生载体复制的条件下培养宿 主细胞来制备用于本发明的多核苷酸。宿主细胞可以是例如大肠杆菌细 胞。
优选地载体是含有编码EndoS多肽的核酸序列的表达载体。这种表达 载体通常在分子生物学领域中被常规地构建并可例如包括使用质粒DNA 和适当的起始密码子、启动子、增强子和其他元件，例如诸如加A信号， 它们为使蛋白表达所必需的并以正确方向安置。对本领域的技术人员来说 其他适合的载体是清楚的。作为这一方面进一步的实例我们引用Sambrook 等人(1989)。
优选地，载体中用于本发明的多核苷酸被可操作地连接于能够提供通 过宿主细胞表达编码序列的控制序列，即载体是表达载体。术语“可操作 地连接”意指毗邻，其中所描述的组分所处的关系允许它们以它们预期的 方式发挥作用。以在与调节序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式 安置“可操作地连接”于编码序列的调节序列例如启动子。
载体可以是例如具有复制起点、可选择地表达所述多核苷酸的启动子 和可选择地所述启动子的调节子的质粒、病毒或噬菌体载体。载体通常适 应于体内使用。
启动子和其他表达调节信号可选择为与针对其设计表达的宿主细胞 相容。可使用哺乳动物启动子例如β-肌动蛋白启动子。组织特异性启动子 是尤其优选的。还可使用病毒启动子例如莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重 复序列(MMLV LTR)、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、 人类巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(诸如HSV IE 启动子)或HPV启动子，尤其是HPV上游调节区(URR)。本领域中可 容易地获得病毒启动子。
载体可进一步包括侧翼于所述多核苷酸的序列，产生含有与真核基因 组序列优选哺乳动物基因组序列同源的序列的多核苷酸。这将允许将本发 明的多核苷酸通过同源重组引入真核细胞的基因组。特别是，含有具有侧 翼病毒序列的表达盒的质粒载体可用于制备适于将本发明的多核苷酸递 送至哺乳动物细胞的病毒载体。适合的病毒载体的其他实例包括单纯疱疹 病毒载体和包括慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和HPV病毒的逆转录病毒。 使用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。逆转录病毒载体 例如可用于稳定地整合多核苷酸，导致多核苷酸进入宿主基因组。相比之 下复制缺陷型腺病毒载体保持游离并因此允许瞬时表达。
疾病和疾患
EndoS多肽或多核苷酸可用于治疗或预防由病原IgG抗体介导的疾病 或疾患。本领域中所熟知的是许多不同的疾病和疾患的发病机理涉及IgG 抗体。本发明人发现可使用EndoS多肽或多核苷酸抑制这类疾病中病原 IgG抗体的作用。
所述疾病或疾患可以是自身免疫性疾病。这类疾病包括艾迪生病、斑 秃、强直性脊柱炎(ankylosing spondilitis)、抗磷脂综合征、再生障碍性贫 血、自身免疫性胃炎、自身免疫性听力丧失、自身免疫性溶血性贫血、自 身免疫性肝炎、自身免疫性甲状旁腺功能减退症、自身免疫性垂体炎、自 身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性心肌炎、自身 免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多内分泌腺病、白塞氏病、 大疱性类天疱疮、心肌病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-施二氏 综合征(Churg-Strauss syndrome)、腹腔疾病(coeliac disease)、克罗恩病、 CREST综合征、德戈斯病(Degos disease)、获得性大疱性表皮松解症、原 发性混合型冷球蛋白血症、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合 征、格雷夫斯病、格林-巴利综合征(Guillan-Barre syndrome)、桥本甲状 腺炎、特发性血小板减少性紫癜、炎症性肠病、川崎病、梅尼埃综合征、 混合性结缔组织病、莫伦氏溃疡、多发性硬化、重症肌无力、落叶型天疱 疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、1型多腺体自身免疫性 综合征(PAS-1)、2型多腺体自身免疫性综合征(PAS-2)、3型多腺体自 身免疫性综合征(PAS-3)、多肌炎/皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、 银屑病关节炎、雷诺氏综合征、赖特尔综合征、类风湿性关节炎、结节病、 硬皮病、舍格伦综合征(syndrome)、亚急性甲状腺炎、交感性眼 炎、系统性红斑狼疮、高安氏动脉炎(Takayasu′s arteritis)、I型糖尿病、 白癜风、伏格特-小柳-原田疾病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)或韦格纳 氏肉芽肿病。优选地，所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎(RA)、系 统性红斑狼疮或特发性血小板减少性紫癜。
疾病或疾患可是哮喘。哮喘可是急性或慢性哮喘。
IgG活化补体系统中的经典途径。因此EndoS多肽和多核苷酸可用于 治疗其中补体活化对患者有害的疾病和疾患。例如EndoS多肽和多核苷酸 可用于治疗移植引起的病症例如移植排斥(诸如急性或慢性的同种异体移 植物排斥或异种移植物排斥)和移植物抗宿主病。移植引起的病症可由于 患者中组织或器官的移植而发生。
EndoS多肽和多核苷酸也可用于手术后治疗，例如经历过心脏旁路手 术的患者的治疗中。
此外，EndoS多肽和多核苷酸可用于治疗获得性血友病，即除去已产 生对凝血因子的自身抗体的血友病患者中的IgG。
通常受治疗者是哺乳动物受治疗者例如小鼠、大鼠或灵长类动物(例 如绒猴或猴)。受治疗者可以是人类或非人类的动物。当受治疗者是实验 室动物例如小鼠、大鼠或灵长类动物时，可处理动物以诱导由病原IgG抗 体介导的疾病或疾患。例如可使用Nandakumar等人描述的小鼠抗CII抗 体诱导的关节炎(CAIA)模型(Am.J.Pathol.163(5)：1827-1837，2003)或 这种模型的修饰形式。
治疗和预防
本发明提供了EndoS多肽和多核苷酸治疗或预防由病原IgG抗体介导 的疾病或疾患的用途。治疗可以是治疗性或预防性的。
为预防所述疾病或疾患的一种或多种症状的发作，可对个体施用 EndoS多肽或多核苷酸。在这一实施方案中，受治疗者可是无症状的。受 治疗者可具有对所述疾病的遗传易感性。将预防有效量的多肽或多核苷酸 施用于这样的个体。预防有效量是预防疾病或疾患的一种或多种症状的发 作的量。
EndoS多肽或多核苷酸的治疗有效量是对改善疾病或疾患的一种或多 种症状有效的量。优选地，待治疗的个体是人类。
可通过任何适合的方法对受治疗者施用EndoS多肽或多核苷酸。可通 过肠内或肠胃外的途径例如经由口、口腔、肛门、肺、静脉内、动脉内、 肌肉内、腹膜内、关节内、局部或其他适当的施用路线施用所述多肽或多 核苷酸。
可以诸如对特定部位的靶向治疗的方式对受治疗者施用EndoS多肽或 多核苷酸。例如可将EndoS多肽直接施用于器官移植的部位。可将EndoS 多肽局部地例如在关节内或一个或多个关节注射。对于类风湿性关节炎 (RA)的预防或治疗来说，对关节局部施用EndoS是尤其优选的。可将 EndoS多肽与特异性结合软骨的试剂轭合。对于EndoS多核苷酸来说，可 使用编码EndoS多肽的表达载体直接将EndoS表达于特定的组织，例如通 过使用组织特异性启动子或RNAi。
本文提及的任何多肽和多核苷酸的制剂将取决于例如多肽或多核苷 酸的性质和待治疗的疾患的因素。可以不同的剂型施用多肽或多核苷酸。 它可是口服(例如片剂、糖锭(troche)、锭剂(lozenge)、水性或油状悬浮液、 可分散的粉剂或粒剂)、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内、经皮 或通过输注技术施用的。还可将多肽或多核苷酸作为栓剂施用。医生能够 确定每个特定的患者所需要的施用路线。
通常将多肽或多核苷酸与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制以 便使用，而且这可使用制药领域中的常规方法实现。药物载体或稀释剂可 是例如等渗溶液。例如固体口服形式可含有(与活性化合物一起的)稀释 剂，诸如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂， 诸如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇；粘合剂， 诸如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷 酮；崩解剂(disaggregating agent)，诸如淀粉、海藻酸、海藻酸盐或淀粉乙 醇酸钠；泡腾混合物；着色剂；甜味剂；润湿剂诸如卵磷脂、聚山梨醇酯、 十二烷基硫酸盐(laurylsulphate)；以及通常无毒并且药理上无活性的用于 药物制剂的物质。可以已知的方法，例如通过混合、粒化、压片、包糖衣 或薄膜包衣过程制备这样的药物制品。
用于口服施用的液体分散体可是糖浆、乳剂和悬浮液。糖浆可含有作 为载体的例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨醇。
悬浮液和乳剂可含有作为载体的例如天然树胶、琼脂、海藻酸钠、果 胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。用于肌肉内注射的悬浮液或 溶液可含有(与活性化合物一起的)药学上可接受的载体，例如无菌水、 橄榄油、油酸乙酯、二醇诸如丙二醇以及如果需要，适量的盐酸利多卡因。
用于静脉内或输注的溶液可含有作为载体的例如无菌水或优选地它 们可是无菌的、含水的、等渗的盐水溶液的形式。
对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酸 酯；这种栓剂可从含有0.5％至10％、优选地1％至2％范围内的活性组分 的混合物形成。
口服制剂包括像例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精 钠、纤维素、碳酸镁以及类似物这样的通常使用的赋形剂。这些组合物采 取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉剂的形式并含有 10％至95％、优选地25％至70％的活性成分。当药物组合物被冷冻干燥时， 冷冻干燥的材料可在施用前复原为例如悬浮液。优选地在缓冲液中实现复 原。
用于对患者口服施用的胶囊、片剂和丸剂可具有肠溶包衣，包括例如 Eudragit“S”、Eudragit“L”、醋酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙 基甲基纤维素。
还可使用适于通过无针注射(例如经皮)递送的药物组合物。
施用治疗有效量的多肽或多核苷酸。可根据不同的参数，尤其是根据 所使用的多肽或多核苷酸；待治疗的患者的年龄、体重和疾患；施用路线 和所需的治疗方案确定剂量。再一次地，医生能够确定任何特定患者所需 的施用路线和剂量。依照特异性抑制剂的活性，待治疗的受治疗者的年龄、 体重和疾患，疾病的类型和严重度以及施用的频率和路线，典型的日剂量 是从约0.1至50mg/kg体重，优选地从约0.1mg/kg至10mg/kg体重。优 选地日剂量水平为5mg至2g。
上文描述的EndoS核苷酸序列和含有这样的序列的表达载体也可用作 如上文概括的药物制剂。优选地，以可在待治疗个体的细胞中表达的表达 载体的形式提供核酸，例如RNA或DNA，尤其是DNA。疫苗可含有裸露 的核苷酸序列或与阳离子的脂质、聚合物或靶向系统结合的核苷酸序列。 可通过任何可用的技术递送疫苗。例如可通过针注射，优选地皮内、皮下 或肌肉内地引入核酸。可选择地，可使用核酸递送设备例如粒子介导的基 因递送直接穿过皮肤递送核酸。可对皮肤或通过例如鼻内、口、阴道内或 直肠内施用对粘膜表面局部地施用核酸。
可通过几种已知的转染技术(例如包括使用转染剂的那些)增强核酸 构建体的摄入。这些剂的实例包括阳离子剂例如磷酸钙和DEAE-Dextran (DEAE-葡聚糖)以及脂质转染剂例如lipofectam和transfectam。可改变 待施用的核酸的剂量。通常以1pg至1mg，优选地对粒子介导的基因递送 来说lpg至10μg以及对其他路线来说10μg至1mg的核酸范围施用核酸。
本发明还提供了离体处理采自患有由病原IgG抗体介导的疾病或疾患 的患者的血液的方法，其包括将血液与EndoS多肽接触。因此EndoS可被 用于血液的体外处理。EndoS可用于处理血液的一种或多种组分例如血浆 或血清。本文描述的离体方法可对已从患者身体取出的血液实施。在与 EndoS多肽接触后可将血液或血液产品可选择地返回到患者。
下列实施例示例性说明本发明：
实施例1：在人类血液中EndoS有效地水解IgG
为了在作为抗病理IgG的治疗剂时有效，在人类全血环境中EndoS需 要在低浓度时有活性。为了研究这一点，如以前所描述的生产并纯化没有 信号序列(即具有SEQ ID NO：1的序列)的重组EndoS(rEndoS)(Collin &Olsén，2001，Infect.Immun.69：7187-7189)。将逐渐增加终浓度的(0、 0.31、0.63、1.25、2.5、5、10和20μg/ml)的rEndoS在500μl的来自健康 志愿者的肝素化的人类血液中于37℃翻滚(end over end)旋转孵育1小时。 将样品于4℃以720x g离心10分钟，之后用蛋白G琼脂糖凝胶依照制造 商的使用说明(GE Healthcare Biosciences，Uppsala，Sweden)纯化血浆中 的IgG。与之前关于IgG结合蛋白蛋白H(来自化脓性链球菌)和蛋白A (来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))的发现(Collin&Olsén 2001，EMBO J.20：3046-3055)一致，完全糖基化的IgG和EndoS处理的 IgG在对蛋白G的结合效力上没有差别。在10％的SDS-PAGE上分离纯化 的IgG，用考马斯染色或电印迹至PVDF(lmmobilon-P，Millipore，Bedford， MA)上。用5μg/ml生物素化的扁豆凝集素(LCA)和1μg/ml的链霉抗生 物素-辣根过氧化物酶(Vector Laboratories，Burlingame，CA)和SuperSignal West Pico过氧化物酶底物(Pierce，Rockford，IL)检测糖基化的IgG。用 Chemidoc XRS成像系统和Quantity One图像分析软件(Bio-Rad，Hercules， CA)分析膜。
这些实验显示逐渐增加浓度的EndoS逐渐将IgG重链转变为小了约 3kDa的表观分子量并且在2.5-5μg/ml以上浓度的rEndoS时几乎看不到完 整大小的重链(图5A)。对同样的样品进行的LCA凝集素印迹实验显示逐 渐增加浓度的rEndoS逐渐产生较低的糖信号并且事实上在2.5-5μg/ml以 上浓度的rEndoS时没有信号(图5B)。先前显示过缺乏凝集素信号与如由 质谱法分析的完全的IgG聚糖水解很好地对应(Collin&Fischetti，2004， J.Biol.Chem.279：22558-22570)。此外峰密度分析显示在大约5μg/ml的 rEndoS浓度的背景水平时变平的剂量响应曲线(图5C)。
这些结果表明5μg/ml的rEndoS在1小时内完全水解了人类血液中的 IgG库。假定IgG血浆浓度为10mg/ml，这将意味着以1∶2000的rEndoS∶ IgG比率在1小时内完全水解IgG。因此，在如人类血液这样复杂的环境 中，rEndoS显示出对功能上重要的IgG聚糖的显著有效的水解。
实施例2：在兔中EndoS有效地水解IgG
为了进一步证实EndoS作为治疗剂的用途，研究了在活体动物的循环 中EndoS的IgG聚糖水解活性。相应于约1∶2000的rEndoS∶IgG比率(假 定rEndoS仅在血液中分布)，用1mg的rEndoS静脉内注射体重约3kg的 Swedish loop兔。动物没有显示疾病迹象。在0、1、2、4、6、8和12小 时以及第1、2、3、4、5、6、8和10天采集血清样品。如前文对人类血 液描述过的用SDS-PAGE和凝集素印迹分析来分析血清IgG的糖基化状 况。
这些实验显示，在注射前，IgG重链的表观分子量与完全糖基化完整 的兔IgG相当(图6A，染色、0小时以及IgG)。相比之下，rEndoS注射 后1小时已经有IgG重链向小约3kDa的蛋白条带的部分转变。rEndoS注 射后4小时IgG重链被完全转变为较小表观分子量形式并且这一结果被维 持直到注射后第10天的最后的样品(图6A，染色，4小时至第10天)。 相同样品的凝集素印迹分析显示在rEndoS注射后6-8小时IgG重链糖信号 几乎消失并且这一结果被维持直到第10天，此时凝集素信号只有轻微增 加(图6A，LCA印迹)。
为了了解rEndoS在已经暴露于酶的动物中是否有活性，在第一次注 射后第35天用1mg的rEndoS进行第二次注射。再一次地，动物看起来没 有受注射影响并且如上文采集并分析血清样品。SDS-PAGE显示在第二次 注射前IgG重链变为与完全糖基化的对照兔IgG重链一样(图6B，0小时， IgG)。1小时后，IgG重链部分地向小3kDa的表观分子量转变，而6-8小 时后IgG重链被完全转变并且这一转变被维持直到这一第二次施用后的第 10-14天(图6B，染色，1小时至第14天)。凝集素印迹分析显示在rEndoS 注射后1-2小时IgG重链糖信号几乎消失并且这一结果被维持直到第8天， 此时凝集素信号有轻微增加并在第10和14天之间进一步轻微增加(图6B， LCA印迹，第1-14天)。
为了研究rEndoS在已经两次静脉内暴露于rEndoS的动物中是否仍然 有活性，在第一次注射后130天用1mg的rEndoS进行第三次注射。再一 次地，动物没有受注射影响并且如上文采集并分析血清样品。SDS-PAGE 显示在第三次注射前，IgG重链变为与完全糖基化的对照兔IgG重链一样 (图6C，0小时，IgG)。1小时后，IgG重链部分地向小3kDa的分子量转 变，并且这一转变被维持直到这一第三次施用后的第8-10天(图6C，染 色，1小时至第14天)。凝集素印迹分析显示在第三次rEndoS注射后一小 时IgG重链糖信号消失并且这一结果被维持直到第5天，此时凝集素信号 有轻微增加并在第6和14天之间进一步增加(图6C，LCA印迹，第1-14 天)。
总体来看，这些结果表明低浓度的EndoS于体内有效地水解了全兔 IgG库上的重链聚糖。此外，之前静脉内暴露于EndoS没有显著影响EndoS 的体内酶促活性。
实施例3：尽管有针对EndoS酶的抗体但EndoS在兔中是有活性的
由于在注射第二次和第三次时EndoS具有完全的活性，因此确定这是 由于对酶的免疫应答是没有或低水平的还是具有不干扰酶促活性的抗 EndoS的特异性抗体是令人感兴趣的。自从已知健康个体和用化脓性链球 菌感染的那些个体都有抗EndoS的抗体(等人，2004，J.Infect.Dis. 189：797-804)以来，这是尤其令人感兴趣的。
为了研究这一点，在10％SDS-PAGE上分离纯化的rEndoS并电印迹 至被切割为1.5mn的条的PVDF上。将条与来自第一次、第二次和第三次 注射的所有血清样品的1∶500的稀释液孵育，之后用过氧化物酶标记的 山羊抗兔抗体(Pierce)孵育。如上文对凝集素印迹描述过的将条用化学 发光显影。
这一实验显示在第一次注射前已有与rEndoS反应的抗体(图7，第一 次注射，0小时)。注射后10天对rEndoS的反应性上仅有轻微增加(图7， 第一次注射和图7A插图)，但是在注射后6和8小时之间有个反应性缺口 (图7，第一次注射)。这一发现的一种可能的原因是结合于rEndoS的特 异性抗体被复合并被网状内皮组织系统从循环中除去。恰好在第二次注射 rEndoS前，抗rEndoS的反应性与第一次注射前相当或略高，并且在注射 后的最初3天中反应性没有增加(图7，第二次注射，0小时-第3天)。第 二次注射后从第4天到第14天，抗rEndoS的反应性逐渐增加(图7，第 二次注射，第4天-14天)。第三次注射rEndoS前，抗rEndoS的反应性比 第二次注射前略高，并且反应性在注射后的第一天中没有增加(图7，第 三次注射，0小时-1天)。第三次注射后从第2天到第14天，抗rEndoS反 应性增加(图7，第三次注射，第2-14天)，尽管高信号水平使测定增加 的水平变得困难。
考虑到来自第二次和第三次注射后获得的样品的蛋白质印迹中的非 常高的信号水平，还通过ELISA分析了全部三次注射之前和之后的样品。 对于ELISA实验，用2μg的EndoS包被微量滴定板(Nunc，Roskilde， Denmark)，之后用溶于PBS中的20mg/ml的牛血清白蛋白封闭。将来自 EndoS注射前和注射后0.5、1、5和10天的动物的血清以1∶100至1∶200,000 的系列稀释用作第一抗血清。过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(Pierce) 用作第二抗体而ABTS(Roche，IN)作为过氧化物酶底物。通过用系列稀 释的多克隆兔IgG(Sigma)如上文包被微量滴定板并用过氧化物酶标记的 山羊抗兔抗体为第二抗体生成兔IgG的标准曲线。在Victor3多标记读数 器(Perkin-Elmer，Waltham，MS)中于405nm分析板。
ELISA实验证实了恰好在第二次注射EndoS前，抗EndoS反应性与第 一次注射前相当或略高，并在注射后5天时反应性仍旧没有增加(图7A， 第一次和第二次注射)。第二次注射后从第5至10天，抗EndoS反应性逐 渐增加(图7A，第二次注射，第5-10天)。在第三次注射EndoS前，ELISA 数据证实抗EndoS反应性比第二次注射前略高，并且在注射后第一天中反 应性没有增加(图7A，第三次注射，第0-1天)。第三次注射后从第5至 10天，ELISA数据显示抗EndoS反应性显著增加(图7A，第三次注射， 第5-10天)。
这些结果表明在未暴露的动物中存在针对EndoS的抗体并且在兔中重 复静脉内暴露时rEndoS产生免疫应答。但是在三次连续的施用期间这些 抗体没有干扰rEndoS在循环中的活性。
此外重复的施用没有影响酶的大约12小时的循环时间(定义为检测 EndoS的能力)，如通过对来自兔血清样品的EndoS的免疫沉淀和蛋白质 印迹分析所分析的。
实施例4：EndoS切割CII特异性单克隆抗体
进行了与和不与EndoS孵育的并用10％的SDS-PAGE分离的IgG单 克隆抗体(CIIC1和M2139)的SDS-PAGE和凝集素印迹分析并将结果示 于图8。
EndoS特异性地水解免疫球蛋白(IgG)的天冬酰胺连接的聚糖的β-1，4- 二-N-乙酰壳二糖核。用EndoS除去糖侧链之后，IgG分子量降低。在染色 的凝胶图片中可清楚地看到用EndoS处理的IgG样品和未处理的IgG之间 γ-链大小的差异。
为了证实IgG的大小变化是由EndoS活性而不是由蛋白水解性的降解 导致的并且产生γ-链上的聚糖部分的去除，进行了凝集素印迹分析。来自 雪花莲(Galanthus nivalis)(GNL)的凝集素优先识别存在于γ-链上二天线 型聚糖中的α-1，3甘露糖残基。当与EndoS孵育时，使用GNL凝集素的相 同样品的凝集素印迹分析显示出显著下降的信号。相比之下，在不存在 EndoS的情况下孵育时，γ-链依旧是糖基化的。这些数据表明EndoS具有 从小鼠IgG的γ-链除去含有α-1，3甘露糖的结构的能力。
实施例5：去糖基化的抗体在体内结合于软骨
进行这一实验以了解从II型胶原蛋白(CII)特异性IgG单克隆抗体 (mAb)除去糖部分是否影响其在体内对II型胶原蛋白的结合能力。
用1mg的CII结合抗体(正常的和EndoS处理的)腹膜内注射1-2日 龄的新生大鼠。抗体传输二十四小时后将爪解剖并在OCT化合物中用异 戊烷和干冰迅速冷冻。用生物素化的抗小鼠κ(187.1)抗体和HRP轭合的 第二抗体作为检测系统用标准实验方案进行免疫组织化学分析。结果示于 图9。EndoS处理和未处理的抗体在体内对关节软骨的结合模式上没有差 别。
实施例6：通过抗CII单克隆抗体的去糖基化的关节炎致病力 (arthritogenicity)丧失
CII特异性单克隆抗体在小鼠中诱导了急性型关节炎，即Nandakumar 等人(2003)中描述的所谓的胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)。CAIA类 似于关节炎的效应阶段而不涉及免疫应答的引发阶段。这种抗体介导的关 节炎取决于补体成分，FcγR，效应细胞因子TNF-α和IL-1β以及取决于嗜 中性粒细胞和巨噬细胞。CAIA用于本研究中以了解通过EndoS处理将IgG 去糖基化的重要性。使用含有两种抗体：结合于J1表位(551-564； GERGAAGIAGPK)的M2139mAb(IgG2b)和结合于II型胶原蛋白的C11(359-363；ARGLT)的CIIC1(IgG2a)的单克隆抗体混合物诱导急性型关节 炎，CAIA。
为了测定去除糖侧链是否影响II型胶原蛋白的病原单克隆抗体诱导关 节炎的能力，将用EndoS处理或或未处理的这一单克隆抗体的混合物注射 入小鼠中。在0天用9mg未处理(n＝7)或EndoS处理的(n＝5)抗CII单克隆 抗体(M2139和CIIC1)注射雄性(BALB/c X B10.Q)F1小鼠组。第5 天时用50μg的大肠杆菌LPS腹膜内注射所有小鼠。关节炎发生率(a)和平 均关节炎得分(b)示于图10。
如可从图10a和10b见到的，在早期显示为对胶原蛋白抗体诱导的关 节炎(CAIA)高度易感的(BALB/c X B10.Q)F1小鼠中出现了临床关节炎 的完全抑制。因此，明显是通过EndoS从IgG的γ-链去除糖取消了其关节 炎诱导能力(关节炎致病力)。
为了证实通过除去IgG的糖侧链的单克隆抗体的关节炎致病力的丧 失，在具有另一种遗传背景B10.RIII的小鼠中诱导了CAIA。
在0天用9mg的未处理的(n＝11)或EndoS处理的(n＝12)的抗CII 单克隆抗体(M2139和CIIC1)注射雄性B10.RIII小鼠。在第5天时用50μg 的大肠杆菌LPS腹膜内注射所有小鼠。关节炎发生率(a)和平均关节炎得分 (b)示于图11。如从图11所看到的，在B10.RIII小鼠中，与未处理的mAb 混合物相比，由EndoS处理的mAb混合物诱导的关节炎的发生率和严重 度显著下降。
实施例7：体外经由CII反应性单克隆抗体的补体活化
为了了解为什么从IgG的γ-链除去糖降低或取消了mAb的临床关节 炎诱导能力，用EndoS处理或未处理的抗体进行体外实验以评估它们诱导 补体活化的能力。
图12显示了在与II型胶原蛋白(a)或直接与塑料表面(b)结合的mAb 上沉积的第一补体成分C1q。在通过EndoS处理(M2139D)和未处理 (M2139)的抗体的补体系统的活化之间没有差别。CIIC1(EndoS处理和 未处理的)mAb根本没有活化补体。G11(IgG2b)和L243(IgG2a)是结合于 无关抗原的对照单克隆抗体。
图13显示了补体成分C3的切割产物(C3b)在与II型胶原蛋白(a)或 直接与塑料表面(b)结合的mAb上的沉积。在通过EndoS处理(M2139D) 和未处理(M2139)的抗体的补体系统的活化之间没有差别。CIIC1(EndoS 处理和未处理的)mAb根本没有活化补体。G11(IgG2b)和L243(IgG2a)是 结合于无关抗原的对照单克隆抗体。
实施例8：CII特异性单克隆抗体的去糖基化对嗜中性粒细胞(PMNL) 氧化猝发的影响
为了测定在糖基化和去糖基化抗体在诱导多形核白细胞PMNL(嗜中 性粒细胞)的氧化猝发的能力上是否有功能性差异，将聚苯乙烯微粒用 EndoS处理和未处理的抗体包被并和来自具有三种不同基因型(FcgR+/+、 FcgR-/-和FcgR+/-)的小鼠的全血孵育。之后用FACS(荧光激活细胞分选 术)分析进行氧化猝发测定。用RB6抗体识别PMNL。
结果示于图14。糖基化和去糖基化的抗体之间的氧化猝发的活化没有 差别。
实施例9：小鼠爪的组织学
为了检查来自接受糖基化或EndoS处理的mAb的小鼠的爪的关节的 组织学状态，用标准的苏木精-伊红染色给来自用9mg未处理的、去糖基 化的或未处理和EndoS处理的抗体混合物的等量混合物注射的(BALB/c x B10.Q)F1小鼠(n＝3-4)的福尔马林固定的脱钙关节的6μm切片染色。
结果表明在来自用糖基化抗体注射的小鼠的关节中出现大量的细胞 浸润以及软骨和骨的糜烂。相比之下，用EndoS处理的抗体注射的小鼠爪 仅显示较小的骨糜烂并且没有大量的细胞浸润。在这些小鼠中软骨看上去 是正常的。
实施例10：体内正常和去糖基化抗体的清除率
为了测定去糖基化抗体的减小的关节炎致病力是否是由于这些抗体 与糖基化抗体相比从小鼠中早期并且提高的清除率，用在第1和5天从 B10.RIII小鼠收集的血清进行通过ELISA(酶联免疫吸附测定)的II型胶 原蛋白结合抗体的分析。结果示于图15。用糖基化和EndoS处理的mAb 注射的小鼠的血清中存在的抗体水平之间没有差异，表明去糖基化的抗体 从小鼠的正常的清除率水平。
实施例11：通过去糖基化抗体的免疫复合体的形成
我们想要确定除对FcγR分子的结合差异之外，糖基化和EndoS处理 的抗体之间是否存在任何的显著差异。最有可能的是在抗体传输关节炎模 型中最初的触发事件中的第一步骤是软骨表面上或滑膜中胶原蛋白-IgG 免疫复合体的形成。胶原蛋白表位位于在软骨表面上形成的重复结构中， 因此可能的是两种不同的抗体可在关节表面上形成多体复合体，以通过最 佳的补体活化或通过与FcγR负载细胞结合来促进关节炎致病力。
为了研究稳定的免疫复合体形成的问题，在琼脂糖上进行抗体的单向 免疫扩散。将以1mg/ml溶于含有0.05％叠氮钠的PBS的大鼠CII浸润至 1％的琼脂糖(低成胶温度琼脂糖26-30℃)凝胶中。将25ul的1mg/ml浓 度的抗体对每孔上样。用考马斯蓝对凝胶染色。结果显示去糖基化的抗体 与糖基化的mAb相比没有形成稳定的免疫复合体。对形成稳定免疫复合 体的这种无能力可能是对去糖基化抗体丧失关节炎致病力的另一种解释。
实施例12：EndoS从致死的抗体介导的血小板减少中解救小鼠
证实EndoS在体内有效地水解IgG聚糖并且动物耐受所述酶的施用之 后，我们研究了EndoS治疗严重的IgG介导的疾病的用途。所选择的疾病 模型是免疫性血小板减少性紫癜(ITP)的小鼠模型。在这一模型中，腹 膜内注射对抗小鼠血小板的多克隆兔IgG(αPLT-IgG)，导致严重的血小板 减少、出血和在较高剂量的IgG时的最终的死亡。
抗小鼠血小板的兔抗血清是从Inter-Cell Technologies(Jupiter，FL)购 得。使用蛋白G琼脂糖凝胶从这一血清分离IgG级分。通过SDS-PAGE 分析确认蛋白纯度并用Advanced Protein Assay Reagent(高级蛋白测定试 剂)(Cytoskeleton，Denver，CO)测定蛋白浓度。对使用预处理的IgG的实 验，将纯化的兔抗小鼠血小板IgG(αPLT-IgG)以1∶500的酶比底物比率 用纯化的GST-EndoS或GST于37℃孵育24小时，之后在谷胱甘肽-琼脂 糖凝胶(GE Healthcare)上除去GST-EndoS和GST。如上文所述通过 SDS-PAGE和使用LCA的凝集素印迹确认IgG聚糖的水解。在标准的光 照和温度条件下安置雌性BALB/c小鼠(约重20g)并用标准的实验室食 物和水随意喂食。将溶于0.25ml PBS的1.2mg抗小鼠血小板IgG(未处 理、EndoS处理或GST处理的)通过腹膜内注射(i.p.)施用于动物。监 测动物粘膜与皮肤的出血、身体活动、从组中的孤立并记录存活时间。
在即将注射兔抗小鼠血小板IgG之前以及在实验过程中每隔一定间隔 从小鼠收集血液样品。从预热的尾静脉将5μl全血收集至含有45μl溶于 PBS的0.1M柠檬酸钠/柠檬酸(pH6.5)的管中。用流式细胞术确认这些 血液样品中的血小板群。用仓鼠抗小鼠CD-61 PE(BD Biosciences，San Jose，CA)于室温标记样品10分钟。将10μl的SPHEROa彩色校准粒子(BD Biosciences)加至每一个试管以使得能够计数。用Utilysea(Dako Cytomation， Glostrup，Denmark)裂解红细胞群并在FacsCalibur流式细胞计(BD Biosciences)上以对数模式分析样品。通过在Neubauer室中人工计数来延 续红细胞裂解后血液样品中的血小板数目计算。
在预实验(pilot experiment)中，用1.2mg的αPLT-IgG注射三只雌性 BALB/c小鼠并如上文描述的用流式细胞术和显微镜方法观察随时间的血 小板计数。这显示出所有三只小鼠迅速发生血小板减少并在αPLT-Ig施用 后24小时内发生死亡(图16A)。
接下来，我们测试了在对小鼠施用前用GST-EndoS或作为对照的GST 预处理αPLT-IgG是否对疾病的发生和存活率有任何影响。用GST-EndoS 处理的αPLT-IgG注射的所有动物(n＝4)没有发生疾病的任何征兆都存活 了，而用GST处理的αPLT-Ig注射的所有动物(n＝4)发生严重的皮下出 血并在24小时内死亡(图16B)。这代表在两组动物中统计学上显著的差 异(p＝0.0082)。此外，通过流式细胞术的每日血小板计数分析显示 GST-EndoS处理的αPLT-IgG对小鼠血小板计数没有明显的影响，而GST 处理的αPLT-IgG导致了血小板计数的迅速下降(图16C)。这些实验证明 αPLT-IgG的离体EndoS处理取消了IgG抗体的致病力，这一结果与EndoS 的体内活性一起促使我们去研究是否可在疾病发作后对小鼠施用EndoS以 阻止致死的血小板减少的发展。用1.2mg的αPLT-IgG注射小鼠(n＝8只/ 组)，之后在施用αPLT-Ig后3小时腹膜内注射100μg的GST-EndoS或 GST。所有用GST处理的动物(8/8)在两天内死亡，而只有2/8的用GST- EndoS处理的动物死亡(图17A)。这代表了在组之间存活率的统计学上的 显著差异(p＝0.003)。来自GST-EndoS或GST处理的小鼠的总IgG的 SDS-PAGE和凝集素印迹分析显示在GST-EndoS处理的动物中αPLT-IgG 处理后24、48和72小时重链聚糖被完全水解，而GST处理的动物中的IgG 是完全糖基化的直到在24小时死亡发生(图17B)。此外如流式细胞术所 分析的血小板计数显示αPLT-IgG的施用诱导了血小板计数的迅速下降， 但是在GST-EndoS处理的小鼠中血小板计数开始稳步上升并在2-3天后达 到正常值(图17C)。
为了进一步质询我们的假设，我们试图模拟ITP患者的临床情况。当 这些患者寻求医疗帮助时，血小板计数常常非常低并且已显露出皮下和其 他的出血并发症。因此我们在小鼠(n＝14)中用αPLT-IgG诱导疾病但直到在 αPLT-IgG注射后5-7小时动物表现出明显可见的皮肤血肿才开始用 GST-EndoS或GST处理。在这些实验中，5/7的用GST-EndoS处理的小鼠 存活并恢复，而所有(7/7)用GST处理的小鼠在两天内死亡，再次代表 了在两组之间存活率的统计学上显著的差异(p＝0.0015)(图17D)。总之 我们的结果证明了小鼠中αPLT-IgG的致病特性取决于抗体的糖基化状态， 并且EndoS在离体和体内都强烈地降低了抗血小板IgG抗体的致病力。总 的来说，在用EndoS酶预处理病原抗体时和在疾病过程中早期或晚期施用 EndoS时，EndoS对血小板计数和存活率都具有显著的积极影响。据发明 人所知，将IgG聚糖的体内水解用作自身免疫性疾病的实验性治疗尚属首 次。
由于发明人先前发现IgG的EndoS水解抑制所有亚类的IgG与FcR的 结合并且还减少了补体活化，因此EndoS的积极影响的机制从理论观点上 讲是非常清楚的。尤其令人感兴趣的是EndoS不仅抑制IgG与FcR结合， 并且还可通过水解重链聚糖释放已经与FcR结合的IgG。还应注意到的是 似乎有一种IgG-FcR相互作用没有像其他相互作用那样受到影响；在某些 条件下EndoS水解的IgG比未水解的IgG与人类FcR11b的确结合得更好 (数据未显示)。由于IgG与FcR11b的相互作用已经显示出对用于治疗自 身免疫性疾患的静脉内注射免疫球蛋白(IVIG)的抗炎活性来说是重要的， 因此在抗炎活性的背景下这可能具有相关性。没有被任何假设束缚，发明 人提出EndoS在一定条件下可通过直接抑制病原IgG与活化的FcR的结合 和向通过FcR11b介导的抑制活性的转变而具有双倍的抗炎活性。
EndoS的特性使其成为对涉及病原抗体的疾患的现有治疗的具有吸引 力的替代方案，尤其是鉴于几项最近的研究证实IgG聚糖为IgG效应调节 的关键。这包括发明人自己的关于这一聚糖的EndoS水解几乎取消了通过 经典通路的补体活化并且减低了对白细胞上Fc受体的结合的发现。基于 发明人的观察结果，显示EndoS可用于治疗其中IgG抗体起到病原作用的 疾患，包括如本文通过ITP示例性说明的自身免疫性疾病和急性的抗体介 导的器官同种异体移植物排斥。