技术领域：
本发明提供一种鉴别中药材及其伪品的方法，更确切地说是鉴别黄芪及其伪品的一种方 法，涉及SSR分子标记法。
背景技术：
黄芪是常用传统大宗中药材，我国对黄芪的需求量呈逐年上升趋势，而近几年由于黄芪 产地实行退耕还林、封山育林、保护生态环境，严禁采挖野生黄芪等政策，导致资源更加匮 乏。这种供需缺口致使黄芪价格稳步上扬，不断高涨的利润吸引了许多不法分子，现在市面 上对黄芪作伪十分猖獗，常见伪品包括：蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬 葵，锦鸡儿。市面上出现的这些伪品均是取它们的根，干燥后作为黄芪出售，这些伪品严重 危害到消费者健康。目前，现有的黄芪的鉴定鉴别方法有：性状鉴定，显微鉴定，理化鉴定 ，这些鉴别方法各有其局限性。性状鉴别法需要多年的中药经验，而培养一位有丰富经验的 中药师，其花费不菲，而且对于粉末型药剂，其鉴定鉴别的准确性也将大打折扣；显微鉴定 同样存在上述的需要丰富经验的问题，而且可能还需要借助扫描电镜，无疑提高了成本；至 于理化和色谱分析，是现行中药鉴别中用的最多的一种手段。但是，他们的共同局限就是， 它们都是以药材的药用成分为对象，而一般药材的药用成分基本上都是初期代谢物或次生代 谢物，药材在不同的发育阶段或不同的器官有不同的表达量，导致一种药材可能因为处在不 同的阶段或不同的器官产生不同的结果，这就可能导致一种药材出现多重标准。所以对中药 材的鉴别急需一种操作简便，成本低廉的方法。分子标记法就是一种比较好的选择。这些分 子标记法依赖的是中药材的遗传物质，受影响的因素相对较少，而且不需要太昂贵的仪器， 成本也相对降低。
但是现在各种分子标记法都有一定的缺陷：
RFLP，这种方法要经过Southern杂交，操作复杂，工作量大，最重要的是它一般选用单 拷贝探针，标记数量相对较少，多态性较低，DNA的用量多，相对要求DNA较完整，而且使酶 切反应，要求DNA纯度也较高，中药材由于DNA降解，所能提取到的量也不多，伴随的次生代 谢物质也不易除净，所以这种方法不可取。
RAPD，降解了的模板DNA在扩增时对模板浓度很敏感，即不同的浓度会出现不同的扩增 式样。而且，这种方法在扩增反应时要求模板尽量少含杂质，对于植物材料多糖与多酚等次 生物质必须尽可能的去除。最重要的是，RAPD使用低温复性，通常为36℃(温度在36℃以下 ，小于1℃的变化就会得到完全不同的扩增样式)，特异性低，引物与模板间有较高的错配率 ，而且重复性低，即便同一实验室也不易重复，不同的实验室间更是缺乏可比性。
AFLP，程序复杂，其实验程序比RAPD和SSR复杂得多，操作比较麻烦。而且AFLP的第一 步就是制备高分子量的基因组DNA，然后酶切。对中药而言，这和RFLP一样不可取。
DNA测序，测序成本较高，实验操作复杂，任何少量的DNA污染(如空气中的花粉、孢子 和细菌，操作人员的头屑等)都会造成假阳性扩增，致使测序的片段来自DNA污染物，出现 鉴定错误。因此这种方法对人员素质、仪器设备及经费的要求都较高。
相对而言，SSR分子标记法操作简单，多态性丰富，重复性较好。但是它最大的不便就 是其两端引物序列的设计。因为SSR序列两端序列的相对保守和单拷贝性，这种技术要在了 解物种的基因背景并设计出相应的引物时应用，目前由于对黄芪的分子信息知之甚少，国内 外还没有采用SSR方法对黄芪进行标记和鉴别报道。
本发明克服了已往黄芪伪品鉴别技术的缺陷，首先提取黄芪DNA，并参照同科植物大豆 的SSR引物设计了对黄芪进行SSR标记的引物，实现了对黄芪及其伪品的鉴别。
发明内容：
本发明提供一种采用分子标记法中的SSR标记法对黄芪及其伪品进行鉴别的方法。
本发明采用的SSR分子标记法鉴别黄芪及其伪品，该方法包括下
列步骤：
黄芪及其伪品总DNA的提取；
SSR位点两侧引物的筛选和引物浓度的优化；
PCR扩增；
PCR产物电泳及染色；
SSR指纹图谱结果分析及判定。
首先采用CTAB法提取黄芪及其伪品的总DNA，黄芪材料可以是干的或新鲜黄芪的任一部 分或黄芪粉末。CTAB法可以是CTAB高盐法，CTAB低pH法，或是SDS-CTAB法(田新莉等，石河 子大学学报，5(2)：95-98；禹山林等，花生学报，31(3)：20-23，2002)；其次，筛选合适 的SSR引物及其对应的浓度。本发明的引物设计参照了大豆分子标记中所采用的引物 (Akkayad，etal.，Crop Sci.35：1439-1445，1995)，这些引物可以在其两端添加不定数的保护 碱基，酶切位点或适当的接头而对后续的扩增结果并不产生影响(《基因工程原理》，吴乃 虎著，P99107)。同领域技术人员根据专业知识可以选用本发明任一引物对或是它们的组合 ，还可以在合成引物时使引物带上标记如荧光标记、同位素标记等；引物浓度，本发明采用 的是50μl反应体系，5’引物0.30μM～0.45μM，3’引物0.30μM～0.45μM，反应体系扩大 或缩小，引物可随之增多或减少。然后再根据已公知的技术，对所提取的DNA进行PCR扩增( 《分子克隆实验指南》)，PCR扩增产物的电泳可以采用琼脂糖凝胶法、变性或非变性胶聚 丙烯酰胺凝胶电泳(《分子克隆实验指南》)。一般地，优选分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电 泳。染色方法可以是溴化乙啶(EB)、银染、荧光技术或同位素法，优选银染法，这是本领 域技术人员所能够理解的。
最后，SSR指纹图结果分析及判定可以采用软件进行分析，也可以目测进行相似度的分 析，最后再利用软件进行聚类分析。
根据本发明提供的方法，所有试剂包括本发明CTAB法所用试剂；所筛选的引物，其它 PCR反应中所需用的酶或试剂，实现本发明所必需的其它酶或试剂或材料，可以液体形式或 冻干粉剂装入一个或多个可以接受的容器内制备成试剂盒，用于鉴别黄芪及其伪品。
具体实施方式：
实施例一、CTAB提取干黄芪及其伪品(蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨， 冬葵，锦鸡儿)的总DNA
(1)新鲜叶片加入液氮迅速研磨粉碎，干材料则在此前先用粉碎器粉碎，并取粉末。
(2)每管加入预热65℃的CTAB提取缓冲液(pH7.8)
700mmol/L NaCl，
50mmol/L Tris-HCl，
10mmol/L EDTA，
1％CTAB，
1％巯基乙醇，
混匀，65℃温浴约30-60钟。
(3)取出，10000转离心10分钟。
(4)取上清10000转离心10分钟，留上清。
(5)加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，混匀，10000转，10分钟。
(6)上清中加入0.1体积2M的醋酸铵，充分混匀，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，充分 混匀，4℃或-20℃放置20分钟，沉淀DNA。
(7)10000转离心10分钟，取沉淀。
(8)70％乙醇洗三次，灭菌双蒸水溶解。
(9)加入RNaseA，使终浓度达到20μg/ml，37℃温育30分钟。
(10)加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀，离心，12000转，10分钟。
(11)取上清，加入0.6倍异丙醇，4℃或-20℃放置20分钟，沉淀DNA。
(12)重复第8步，4℃保存备用。
实施例二、PCR扩增
引物序列 编号1 正义链 5′CAAAACATAAAAAAGGTGAGA 3′ 反义链 5′AAGAACCACACTAATATTATT 3′ 编号2 正义链 5′GGAAGAAAGTATTGGTCTGT 3′ 反义链 5′AGGAGAGAGTGGAGAGATTA 3′ 编号3 正义链 5′TTCGAAGCATCCAAGG 3′ 反义链 5′AAAAGACAAAAACATACTATAAAA 3′ 编号4 正义链 5′CGTGCCAAATTACATCA 3′ 反义链 5′TGATGGGAACAAGTACATAA 3′ 编号5 正义链 5′ATGGTTTTTTCCTGCCCTTT 3′ 反义链 5′AACAAGCCCCCCTAAAAGAA 3′ 编号6 正义链 5′CTTTGGCGCTGACACAT 3′ 反义链 5′CCCAGTGAACATTTTAGGATCA 3′ 编号7 正义链 5′AAGCTTAGAAGCAAACCAAAGAT 3′ 反义链 5′TGTTTTTCATTTTCACCCAAG 3′ 编号8 正义链 5′AATGAGGAACCTTTGACCCC 3′ 反义链 5′AATATGGGCTGTGTGGATC 3′ 编号9 正义链 5′GGAACCACTCTTGGATTATATC 3′ 反义链 5′GTTCTCTATTTAATGCCCCGC 3′ 编号10 正义链 5′CCAGACCAAACCTGAATTGT 3′ 反义链 5′GCATGGTTCCACTCTGCAAG 3′
扩增体系：50μl体系
模板DNA 150ng 1.5mM MgCl2
1×PCR buffer
150μM dNTPs 2.5U Taq DNA聚合酶
引物序号1：5’引物0.45μM 3’引物0.45μM
引物序号2：5’引物0.30μM 3’引物0.30μM
引物序号3：5’引物0.30μM 3’引物0.30μM
引物序号4：5’引物0.45μM 3’引物0.45μM
引物序号5：5’引物0.40μM 3’引物0.40μM
引物序号6：5’引物0.35μM 3’引物0.35μM
引物序号7：5’引物0.40μM 3’引物0.40μM
引物序号8：5’引物0.45μM 3’引物0.45μM
引物序号9：5’引物0.35μM 3’引物0.35μM
引物序号10：5’引物0.30μM 3’引物0.30μM
扩增程序：
95℃ 5min或10min
33个循环： 变性 92℃ 60s，
复性 47℃ 60s，
延伸 68℃ 60s
4℃ 1min
扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，结果如附图1～7。
其中引物3、4、5、9未能成功扩增；而引物1、2、6、7、8、10成功扩增。故而本发明 选用1、2、6、7、8、10这6对引物。
实施例三、SSR对黄芪及其伪品鉴定结果
电泳结果用生物学软件Orthogonality-Experiment Assistant(版本：2.0)转化为电 泳条带模式图(附图8～13)。以有条带的位点计为1，无条带位点处计为0，并从中扣除阴 性对照中的结果。并根据下面的公式分别对每对引物计算各个材料之间的相似指数Sxy：
Sxy＝2×Nxy/Nx+Ny
Nx是材料X的等位基因数，Ny是材料X的等位基因数，Nxy是指X和Y共有的等位基因数。
根据下列公式计算PIC值(polymorphism index content)：
PIC = 1 - Σ n = 1 i f i 2 ]]>fi是第i个等位基因的频率。
表一、引物1在八种材料间相似性系数S 黄芪 蜀葵 陆地棉 紫苜蓿 圆叶棉葵 白草木樨 冬葵 锦鸡儿 黄芪 0 0 0.4 0 0 0 0 蜀葵 0 0 0 0 0 0 0.286 陆地棉 0 0 0 0 0 0 0 紫苜蓿 0.4 0 0 0 0.667 0 0 圆叶锦葵 0 0 0 0 0 0 0 白草木樨 0 0 0 0.667 0 0 0 冬葵 0 0 0 0 0 0 0 锦鸡儿 0 0.286 0 0 0 0 0
表二、引物2在八种材料间相似性系数S 黄芪 蜀葵 陆地棉 紫苜蓿 圆叶棉葵 白草木樨 冬葵 棉鸡儿 黄芪 0.4 0.333 0.667 0 0.286 0.667 0.667 蜀葵 0.4 0.571 0.5 0 0.25 0.5 0.5 陆地棉 0.333 0.571 0.4 0 0.222 0.4 0.4 紫苜蓿 0.667 0.5 0.4 0 0.333 1 1 圆叶锦葵 0 0 0 0 0 0 0 白草木樨 0.286 0.25 0.222 0.333 0 0.333 0.333 冬葵 0.667 0.5 0.4 1 0 0.333 1 锦鸡儿 0.667 0.5 0.4 1 0 0.333 1
表三、引物6在八种材料间相似性系数S 黄芪 蜀葵 陆地棉 紫苜蓿 圆叶锦葵 白草木樨 冬葵 锦鸡儿 黄芪 0.286 0.222 0.2 0 0.571 0 0 蜀葵 0.286 0.462 0.143 0 0.444 0 0 陆地棉 0.222 0.462 0 0 0.154 0 0 紫苜蓿 0.2 0.143 0 0 0.286 0 0 圆叶锦葵 0 0 0 0 0 0 0 白草木樨 0.429 0.444 0.154 0.286 0 0 0 冬葵 0 0 0 0 0 0 0 锦鸡儿 0 0 0 0 0 0 0
表四、引物7在八种材料间相似性系数S 黄芪 蜀葵 陆地棉 紫苜蓿 圆叶锦葵 白草木樨 冬葵 锦鸡儿 黄芪 0 0 0.182 0 0.5 0 0 蜀葵 0 0 0.375 0 0.222 0 0.444 陆地棉 0 0 0 0 0 0 0 紫苜蓿 0.182 0.375 0 0 0.182 0 0 圆叶锦葵 0 0 0 0 0 0 0 白草木樨 0.5 0.222 0 0.182 0 0 0.5 冬葵 0 0 0 0 0 0 0 棉鸡儿 0 0.444 0 0 0 0.5 0
表五、引物8在八种材料间相似性系数S 黄芪 蜀葵 陆地棉 紫苜蓿 圆叶锦葵 白草木樨 冬葵 锦鸡儿 黄芪 0.5 0 0.4 0 0.333 0 0.857 蜀葵 0.5 0 0.286 0 0.25 0.25 0.444 陆地棉 0 0 0 0 0 0 0 紫苜蓿 0.4 0.286 0 0 0.8 0 0.333 圆叶锦葵 0 0 0 0 0 0 0 白草木樨 0.333 0.25 0 0.8 0 0 0.571 冬葵 0 0.25 0 0 0 0 0 锦鸡儿 0.857 0.444 0 0.333 0 0.571 0
表六、引物10在八种材料间相似性系数S 黄芪 蜀葵 陆地棉 紫苜蓿 圆叶锦葵 白草木樨 冬葵 锦鸡儿 黄芪 0.222 0 0 0 0 0 0.182 蜀葵 0.222 0 0.125 0.2 0.286 0 0.375 陆地棉 0 0 0 0 0 0 0 紫苜蓿 0 0.125 0 0.333 0.25 0.167 0.222 圆叶锦葵 0 0.2 0 0.333 0 0 0.167 白草木樨 0 0.286 0 0.25 0 0.2 0.5 冬葵 0 0 0 0.167 0 0.2 0 锦鸡儿 0.182 0.375 0 0.222 0.167 0.5 0
以上结果说明，对于黄芪，本发明所选用的10对大豆SSR引物，引物3、4、5、9这四对 引物没有扩增产物；而引物1、2、6、7、8、10获得了扩增产物，意想不到的是其中1、2、7 、10获得了清晰明显且离散度高的条带，使得黄芪同其它伪品的鉴别十分容易，甚至单独选 用引物1或7或10就足可以将黄芪同其伪品区分开来。
本发明中所选用的这些引物，PCR扩增条件采用了同一条件，显而易见，这些引物如果 以任一组合用于同一反应体系中，可以预见这样完全可用于黄芪同其伪品的鉴别。
此外，同领域技术人员根据专业知识可以在这些引物的两端添加不定数的保护碱基，酶 切位点或适当的接头而对后续的扩增结果并不产生影响；还可以在合成引物时使引物带上标 记如荧光标记、同位素标记等。
表七、6对引物的PIC值 引物1 引物2 引物6 引物7 引物8 引物10 PIC 0.898 0.789 0.943 0.936 0.865 0.945
PIC值反映了某一对引物的区分能力。以上所分析的6对引物中引物1、6、7、10的PIC 值较高，但引物6的离散度差，故而1、7、10为优选的引物对。
附图说明
附图1阴性对照是指在扩增管中分别加入这8种模板DNA，未加引物，其余的程序均与正 常PCR扩增一致。设置阴性对照的目的在于扣除模板DNA的存在对于产物判断的影响。图中1 ～8分别是黄芪，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图2为引物1在八种材料中的扩增结果。图中从左至右0～9分别是：DNA marker，黄芪 ，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。9是阴性对照，即是在扩 增管中不加入模板DNA，其余的处理则和对应的样品管一致。
附图3为引物2在八种植物中的扩增结果。图中从左至右0～9分别是：DNA marker，黄芪 ，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。9是阴性对照，即是在扩 增管中不加入模板DNA，其余的处理则和对应的样品管一致。
附图4为引物6在八种植物中的扩增结果。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪 ，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图5为引物7在八种植物中的扩增结果。图中从左至右0～9分别是：DNA marker，黄芪 ，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。9是阴性对照，即是在扩 增管中不加入模板DNA，其余的处理则和对应的样品管一致。
附图6为引物8在八种植物中的扩增结果。图中从左至右0～9分别是：DNA marker，黄芪 ，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。9是阴性对照，即是在扩 增管中不加入模板DNA，其余的处理则和对应的样品管一致。
附图7为引物10在八种植物中的扩增结果。图中从左至右0～9分别是：DNA marker，黄 芪，蜀葵，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。9是阴性对照，即是在 扩增管中不加入模板DNA，其余的处理则和对应的样品管一致。
附图8为引物1扩增结果模式图。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪，蜀葵， 陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图9为引物2扩增结果模式图。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪，蜀葵， 陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图10为引物6扩增结果模式图。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪，蜀葵 ，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图11为引物7扩增结果模式图。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪，蜀葵 ，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图12为引物8扩增结果模式图。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪，蜀葵 ，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。
附图13为引物10扩增结果模式图。图中从左至右0～8分别是：DNA marker，黄芪，蜀葵 ，陆地棉，紫苜蓿，圆叶锦葵，白草木樨，冬葵，锦鸡儿。