抗-HIV奎宁环化合物
发明背景
2003年，全球300多万患者死于HIV/AIDS流行，并且据估计 全球范围5百万例新感染人免疫缺陷病毒(HIV)-使带毒者达到4 千万。不论抗病毒疗法开发的进展如何，对AIDS还没有完全有效 的疗法。目前的治疗策略包括蛋白酶抑制剂、核苷类似物反转录抑 制剂、非核苷类似物反转录抑制剂、融合抑制剂以及高毒性羟基脲 (Yarchoan R et al。(1986)Lancet 1(8481)：575-580；Richards AD et al. (1989)FEBS Lett 247(1)：113-117；Gao WY et al.(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92(18)：8333-8337；De Clercq E(1999)Farmaco 54(1- 2)：26-45；Williams IG(2003)MJ CHn Pract 57(10)：890-897)。遗憾 的是，病毒基因组突变导致的抗性(Cavert W and Balfour HH(2003) Clin Lab Med 23(4)：915-928；Gallant JE et al.(2003)Antivir Ther 8(6)：489-506；Olson WC and Maddon PJ(2003)Curr Drug Targets Infect Disord 3(4)：283-294)以及严重的毒副作用都严重限制了治疗 的有效性。
目前需要抗病毒药物，包括抗-反转录病毒药物。还需要药理学 工具以进一步研究感染相关的药理学过程。
发明概述
本发明通过阻断或抑制病毒(如反转录病毒，包括HIV)在体内 外感染哺乳动物细胞的能力来预防病毒复制的方法。因此，本发明 提供了治疗暴露于感染性病原体的哺乳动物，包括受感染性病原体 (如细菌或病毒)威胁或侵害的哺乳动物的治疗方法，所述方法包括给 予所述哺乳动物治疗有效量的式I的奎宁环化合物：
其中：
a)R1、R2、R3和R5独立为H、OH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6) 烷氧基、(C3-C6)环烷基、(C3-C6)环烷基((C1-C6)烷基)、(C2-C6)烯基、 (C2-C6)炔基、(C1-C6)烷酰基、卤代(C1-C6)烷基、羟基(C1-C6)烷基、(C1-C6) 烷氧基羰基；(C1-C6)烷硫基或(C1-C6)烷酰基氧基；或R1和R2合在一 起表示亚甲基二氧基；
b)X1为NO2、CN、-N＝O、(C1-C6)烷基C(O)NH-、唑啉基或 N(R6)(R7)，其中R6和R7独立为H、(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C3- C6)环烷基、((C1-C6)烷基)，其中环烷基任选包含1-2个S、非过氧化 物O或N(R8)，其中R8为H、O、(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、(C3- C6)环烷基(C1-C6)烷基、苯基、或苄基；芳基、芳基(C1-C6)烷基、芳 基(C2-C6)烯基、杂芳基、杂芳基(C1-C6)烷基，或R6和R7与连接它们 的氮共同形成5-或6-原杂环或杂芳基环，任选被R1取代并任选包含 1-2个S、非过氧化物O或N(R5)；
c)Y和Z为＝O、-O(CH2)mO-或-(CH2)m-，其中m为2-4，或Y 为H，Z为OR9或SR9，其中R9为H或(C1-C4)烷基；
及其药学可接受盐。
优选，R1、R2和R3中1、2或3个为H。
优选，R6和R7独立为H、(C1-C4)烷基、(C3-C6)环烷基、(C3-C6) 环烷基(C1-C6)烷基或苄基。
优选，X1为-N(R6)(R7)。
优选，R1、R2或R3中1或2个为(C1-C6)烷氧基。
优选，Z和Y合在一起表示＝O。
本发明还提供例如单位剂量形式的药用组合物，其包含所述式I 化合物，或其药学可接受盐，以及药学可接受稀释剂或载体，该组 合物可任选包括一种或多种类型的上述抗HIV药物中的抗HIV药 物，并可任选包括稳定剂、防腐剂和吸收控制剂。
此外，本发明提供预防或治疗哺乳动物如人的病理学症状的治 疗方法，其中病原体或微生物体如病毒或反转录病毒的感染性是相 关因素，因此需要抑制其感染性，所述方法包括给予需要该治疗的 哺乳动物治疗有效量的式I化合物或其药学可接受盐。
本发明提供用于治疗用途的所述式I化合物(如，用于治疗感染 有反转录病毒如HIV的哺乳动物)，以及所述式I化合物在制备治疗 哺乳动物如人感染的药物中的用途。
本发明提供了将所述式I化合物结合于哺乳动物细胞以改变细 胞膜对感染原的通透性的方法，包括在体内外用有效量的所述式I 化合物接触细胞以改变所述细胞膜的性质，例如改变所述细胞膜的 甾醇组成。包含所述式I化合物作为配体结合于受体位点的细胞可 用来检测化合物对细胞膜上或细胞膜内特异性受体的选择性，或可 用作工具来鉴定治疗依赖于细胞膜通透性的疾病或病症的潜在的治 疗药物，方法为使所述药物与所述配体受体复合物接触，并检测配 体的置换程度和/或药物的结合程度。
本发明还提供了本文公开的新型的式I化合物，以及对制备式(I) 化合物或其盐有用的方法和中间体。这其中包括其中C(Y)(Z)基团 结合于奎宁环的环-CH-基团的类似物，以及其中Y和R2通过键连接 的类似物。许多式I化合物也用作制备式I化合物的中间体。
附图简述
图1所示为(4-氨基苯基)(1-氮杂-二环[2，2，2]辛-4-基)-甲酮或4-(4- 氨基苯甲酰基)-1-氮杂-二环[2，2，2]-辛烷(SP003)的结构。
图2为SP003对HIV-1 IIIB株在Hela细胞中复制的抑制效果图。 化合物稀释于水或为制剂形式(SP003 A)，ddI为已知抗-病毒化合物.
图3为预先24小时给予SP003对HIV-1 IIIB株在Hela细胞中 复制的抑制效果图。实验SP003为制剂形式(SP003A)。
图4为预先48小时给予SP003对HIV-1 IIIB株在Hela细胞中 复制的抑制效果图。
图5为SP003对多药耐药HIV MDR-769株在Hela细胞中复制 的抑制效果图。AZT为已知的抗病毒化合物。
发明详述
除另有说明外，以下所用的定义其含义为：卤素为氟、氯、溴 或碘。烷基、烷氧基、烯基、炔基等表示直链和支链基团两者；但 是指单个基团时，如“丙基”仅包括直链基团，支链异构体如“异 丙基”要具体指出。芳基表示苯基或邻位稠合的含约9-10个环原子 的其中至少一个环为芳环的二环碳环基团。杂芳基包括通过单环芳 环的环碳原子连接的含5-6个由碳原子和1-4个各自选自非过氧化物 氧、硫和N(R8)，其中R8不存在或为H、O、(C1-C4)烷基、苯基或苄 基的杂原子组成的环原子的基团，以及约8-10个环原子的邻位稠合 二环杂环的基团，具体而言该环原子得自苯并衍生物或与亚丙基、 三亚甲基或四亚甲基二基稠合而成的基团。
本领域技术人员应该理解，本发明具手性中心的化合物可以光 学活性和外消旋形式存在和分离纯化。这些化合物可表现出多晶形 性。可以理解本发明包括本发明化合物的任何外消旋、光学活性、 多晶型或其立体异构或混合物形式，这些化合物具有本文所述的有 用的性质，在本领域众所周知如何制备光学活性形式(例如通过重结 晶技术拆分外消旋形式，从光学活性原料开始合成，或用手性柱进 行色谱分离)以及如何用本文所述标准试验或用其它类似试验确定抗 感染活性。
具体且优选的下列基团、取代基的取值和范围仅供说明；不排 除其它限定值或该基团和取代基定义范围内的其它值。
特定的(C1-C6)烷基可为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异 丁基、仲丁基、戊基、3-戊基或己基；(C3-C6)环烷基可为环丙基、 环丁基、环戊基或环己基；(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基可为环丙基甲 基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、2-环丙基乙基、2-环丁 基乙基、2-环戊基乙基或2-环己基乙基；杂环烷基和杂环烷基烷基 包括上述环烷基，其中所述环任选包含1-2个S、非过氧化物O或 N(R8)以及2-5个碳原子；例如吗啉基、哌啶基、哌嗪基、茚满基、 1，3-二噻烷-2-基等；(C1-C6)烷氧基可为甲氧基、乙氧基、丙氧基、 异丙氧基、丁氧基、异-丁氧基、仲-丁氧基、戊氧基、3-戊氧基或己 氧基；(C2-C6)烯基可为乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁 烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊 烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基或5-己烯基；(C2-C6) 炔基可为乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁 炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己 炔基、3-己炔基、4-己炔基或5-己炔基；(C1-C6)烷酰基可为甲酰基、 乙酰基、丙酰基或丁酰基；卤代(C1-C6)烷基可为碘甲基、溴甲基、 氯甲基、氟甲基、三氟甲基、2-氯乙基、2-氟乙基、2，2，2-三氟乙基 或五氟乙基；羟基(C1-C6)烷基可为被1或2个OH取代的烷基，如 羟基甲基、1-羟基乙基、2-羟基乙基、1-羟基丙基、2-羟基丙基、3- 羟基丙基、1-羟基丁基、4-羟基丁基、3，4-二羟基丁基、1-羟基戊基、 5-羟基戊基、1-羟基己基或6-羟基己基；(C1-C6)烷氧基羰基可为甲 氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、 戊氧基羰基或己基氧基羰基；(C1-C6)烷硫基可为甲硫基、乙硫基、 丙硫基、异丙硫基、丁硫基、异丁硫基、戊硫基或己硫基；(C2-C6) 烷酰基氧基可为乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊 酰氧基或己酰氧基；芳基可为苯基、茚基或萘基；杂芳基可为呋喃 基、咪唑基、三唑基、三嗪基、唑基、异唑基、噻唑基、异噻 唑基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基(或其N-氧化物)、 噻吩基、嘧啶基(或其N-氧化物)、1H-吲哚基、异喹啉基(或其N-氧 化物)或喹啉基(或其N-氧化物)。
术语″反转录病毒″包括但不限于，反转录病毒科(family retroviridae)的成员，包括α反转录病毒(如，禽造血白细胞组织增 生病毒)、β反转录病毒(如，小鼠乳腺瘤病毒)、Y反转录病毒(如， 鼠白血病病毒)、δ反转录病毒(如，牛白血病病毒)、ε反转录病毒 (如，Walley皮肤肉瘤病毒)、慢病毒(如，HIV-1、HIV-2)以及泡沫 病毒(如，人泡沫病毒)。
可如方案A所示，通过将N-取代的或N-保护的苯基格氏试剂 或苯基锂与4-氰基-1-氮杂-二环[2.2.2]辛烷(4)或4-氰基-奎宁环反应制 备本发明化合物，其中苯基格氏试剂的例子有4-(二(三甲基甲硅烷 基))氨基-1-苯基-溴化镁。
方案A
与格氏试剂或芳基锂试剂反应的苯基上的基团R1、R2和/或R3， 如含羟基的基团可用可除去的保护基如乙氧基乙基、THP、(C1-C4)3甲硅烷基等保护。受保护的HO和羟基烷基可通过有机合成领域的 公知方法进行脱保护，并转化为卤素、CN、烷氧基羰基、烷酰基氧 基和烷酰基。受保护的氨基可通过有机合成领域的公知方法进行脱 保护，并转化为N(R6)(R7)。如果需要，转化过程中C＝O基团可进 行保护和/或还原，然后脱保护并再氧化为C＝O。见，例如，F.T. Harrison，Compendium of Organic Synthetic Reactions，Wiley- Interscience，N.Y.(1971)；L.F.Fieser et al.，Reagents for Organic Synthesis，John Wiley&Sons，Inc.，N.Y.(1967)，和美国专利No. 5,411,965。
因此，上式I中R1的具体值为H、(C2-C4)烷基、(C2-C4)烷氧基 或(C3-C6)杂环烷基。
R2的具体值为H。
N(R6)(R7)的具体值为氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、环己基 氨基或丙基氨基，因此R3的具体值为NH2。
另一个优选的化合物为式I化合物，其为2，3或4-(4-取代苯甲 酰基)-1-氮杂-二环[2，2，2]辛烷。
优选的本发明化合物为SP003(Fig.1)。
在化合物的碱性或酸性强到足以形成稳定的无毒酸或碱盐的情 况下，给予盐形式的化合物是合适的。药学可接受的盐的实例为与 形成生理学可接受阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸 盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸 盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐。也可形成合适的无机 盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。
药学可接受盐可用本领域公知标准技术制备，例如通过将碱性 足够强的化合物如胺与合适的提供生理学可接受阴离子的酸反应进 行。也可形成碱金属(例如钠、钾或锂)、碱土金属(如钙或镁)或锌盐。
一个本发明的实施方案提供了包含式I化合物和锌盐如七水硫 酸锌的组合物，其中抗坏血酸优选不存在于组合物中，原因是一种 或多种组分的降解导致的褐变效应。在一个实施方案中，所述式I 化合物和锌盐如七水硫酸锌在组合物中存在的比例为约27-107∶1。
式I化合物可配制为药用组合物并以各种适于所选给药途径的 形式给予哺乳动物宿主如病人，即口服或胃肠外、静脉内、肌内、 局部或皮下途径，或吸入或吹入给药。
本发明化合物可经系统给药，如与药学可接受载体如惰性稀释 剂或可吸收的食用载体一起口服。该化合物可作为粉末、小丸或混 悬体包于硬或软明胶胶囊中，或可压制成片。对口服治疗给药而言， 活性化合物可与一种或多种赋形剂一起给予，所用形式为可吸收片、 含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等。这类 组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制剂 的百分比可有所变化，并可根据需要占所给单位剂型的约2-约60％ 重量。这类治疗用途的组合物中活性化合物的量为能够达到有效剂 量水平的量。
可吸收片、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有以下成分：粘合剂如 西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解 剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味 剂如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜；或矫味剂如欧薄荷、冬青油或 樱桃矫味剂等。当所述剂型为胶囊时，其可含有上述类型物质外还 含有如植物油或聚乙醇。可存在其它材料作为包衣，或用来修饰所 述固体单位剂型的物理形式。例如片剂、丸剂或胶囊剂可包有明胶、 蜡、虫胶或糖等。糖浆剂或酏剂可含有活性化合物、蔗糖或果糖作 为甜味剂，甲基和丙基尼伯金类作为防腐剂，染料和矫味剂如樱桃 或桔子香料。当然，制备任何单位剂型的任何材料应该是药学可接 受的并基本上在其给药剂量时无毒。此外，可将活性化合物掺入缓 释制剂和装置中，如贴剂、输液泵或移植型长效制剂。
活性化合物也可经静脉或腹膜内输注或注射给予。活性化合物 或其盐的溶液可在水中制备，任选与无毒表面活性剂混合。分散体 也可在甘油、液体聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物和油中制备。 在正常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防微生物生长。
适于注射、输注或吸入的药剂可包括无菌水溶液或分散体。可 制备含有活性成分的无菌粉末，其适于无菌注射或输注溶液或分散 体的临用制剂，任选包覆于脂质体中。在所有情况下，最终制剂应 是无菌、液态的并在制备和储存条件下稳定。液体载体或溶媒可为 包含以下物质的溶剂或液体分散体介质：如水、乙醇、多元醇(如 甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油基酯，及其稳 定混合物。可通过形成脂质体保持流动性，在分散体情况下通过保 持所需粒径或通过使用表面活性剂保持流动性。可通过使用各种抗 菌剂和抗真菌剂如尼伯金类、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等防 止微生物作用。在许多情况下，可优选包括等渗剂如糖类、缓冲剂 或氯化钠。注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延缓吸收 剂来达到，如使用单硬脂酸铝、纤维素醚和明胶。过滤除菌后，根 据需要，将所需量的活性化合物以及上述其它成分加入到合适的溶 剂中制备无菌注射溶液。在制备无菌注射溶液用无菌粉末时，优选 的制备方法为真空干燥和冻干技术，使用该技术可得到前述无菌过 滤溶液中的活性成分与任何所需成分的粉末。
对局部给药，当本发明化合物为液体时可以纯形式使用。但是， 通常需要以组合物或制剂形式与液体或固体皮肤可接受载体一起给 予。
所用的固体载体包括细碎的固体如滑石粉、黏土、微晶纤维素、 硅胶、二氧化铝等。所用的液体载体包括水、醇或甘醇或水-醇/甘醇 混合物，其中本发明化合物可以有效水平任选与无毒表面活性剂一 起溶解或分散。可添加辅助剂氟芳香剂和附加的抗微生物剂以优化 所给用途的性质。所得液体组合物可应用自吸收剂垫，用来浸渍绷 带和其它敷料，或用泵或气雾剂喷雾器喷到患处。
增稠剂如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性 纤维素或改性矿物材料也可与液体载体一起使用以形成分散糊剂、 凝胶剂、软膏剂、皂等，直接施用于患者皮肤。
可用来给予式I化合物的有用的皮肤病学组合物在本领域已知； 例如，参见Jacquet et al.(U.S.Pat.No.4,608,392)，Geria(U.S.Pat.No. 4,992,478)，Smith et al.(U.S.Pat.No.4,559,157)和Wortzman(U.S.Pat. No.4,820,508)。
式I化合物的有用剂量可通过对比其动物模型中体外和体内活 性确定。小鼠和其它动物中有效剂量外推至人的方法为本领域已知 的；例如，参见美国专利No.4,938,949。
一般而言，液体组合物如洗剂中式I化合物的浓度范围为约0.1- 25wt-％，优选约0.5-10wt-％。半固体或固体组合物如凝胶或粉末中 的浓度为约0.1-5wt-％，优选约0.5-2.5wt-％。
治疗中需要使用的化合物或其活性盐或衍生物的量不仅根据所 选的特定的盐调节，还根据给药途径、待治疗的病症性质、患者的 年龄和条件调节，并且最终由主治医师或内科医生慎重决定。
但是，一般来说合适的剂量范围为约0.5-约100mg/kg，如，为 约10-约75mg/kg体重每天，如3-约50mg每公斤体重每受试者每 天，优选范围为约6-90mg/kg/天，最优选范围为15-60mg/kg/天。
所述化合物方便地以单位剂型给予；如，含5mg至高达1-3g， 方便地10-1000mg，最优选50-500mg的活性成分每单位剂型。
理想的，应给予活性成分使其达到活性化合物的峰血浆浓度， 该浓度为约0.5-约75μM，优选约1-50μM，最优选约2-约30μM。 可通过静脉注射0.05-5％的任选在生理盐水中的活性成分溶液来达 到。例如，约0.5-3g所述式I化合物可溶于约125-500ml静脉注射 溶液中，该溶液含有如，0.9％NaCl、约5-10％葡萄糖。可在长达7 小时的时间里输注这种溶液，任选与其它抗病毒药物、抗生素等联 用。所述活性成分还可作为含约1-100mg活性成分的大丸剂口服给 药。理想的血液水平通过约提供0.01-5.0mg/kg/hr连续输注保持， 或通过不连续输注约0.4-15mg/kg的活性成分保持。
所需的剂量可根据情况以单剂量或以适当的间隔以分剂量给 药，例如每天二、三、四或更多分剂量。分剂量其自身可再行细分 成数个不连续非紧密间隔的给药；如来自一个吹入剂的多个吸入剂， 或将多个滴剂施用于眼睛。
本发明化合物用作抗病毒药物的能力可用本领域已知的药理学 模型确定，或用下述测试确定。
以下详细说明代表性药剂，其含有治疗或预防性应用于哺乳动 物如人的式I化合物
(I)片剂1 mg/片
SP003 100.0
乳糖 77.5
聚维酮 15.0
交联羧甲基纤维素钠 12.0
微晶纤维素 92.5
硬脂酸镁 3.0
300.0
(ii)片剂2 mg/片
SP003 20.0
微晶纤维素 410.0
淀粉 50.0
淀粉羟乙酸钠 15.0
硬脂酸镁 10
500.0
(iii)胶囊 mg/胶囊
SP003 10.0
胶体二氧化硅 1.5
乳糖 465.5
预胶凝淀粉 120.0
硬脂酸镁 3.0
600.0
(iv)注射剂1(1mg/ml) mg/ml
SP003(游离碱形式) 1.0
磷酸氢二钠 12.0
磷酸二氢钠 0.7
氯化钠 4.5
1.0 N氢氧化钠溶液(pH调至 适量
7.0-7.5)
注射用水适量 加至1mL
(v)注射剂2(10me/ml) mg/ml
SP003(游离碱形式) 10.0
磷酸二氢钠 0.3
磷酸氢二钠 1.1
聚乙二醇400 200.0
01 N氢氧化钠溶液(pH调至 适量
7.0-7.5)
注射用水适量 加至1mL
(vi)气雾剂 mg/罐
SP003 20.0
油酸 10.0
三氯一氟甲烷 5,000.0
二氯二氟甲烷 10,000.0
二氯四氟乙烷 5,000.0
以上制剂可根据药学领域常规的方法制备。本发明结合以下详 细的实施例做进一步阐述。
实施例1.合成(4-氨基-苯基)(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-4-基)甲酮(SP003)
化合物4的合成方法见T.Kanai，heterocycles(1992)Vol.34，No. 11,213，如上述方案A所述，N，N-双-(三甲基甲硅烷基)-4-溴苯胺购 自Sigma-Aldrich。溶剂通过标准方法纯化。EI-Mass质谱用VG Tribid， Varian CH7仪器记录。薄层色谱(TLC)分析在硅胶60 F254铝板 (Merck)上进行。NMR-光谱仪：Bruker AMX300。化学位移记录为 ppm。
在氩气下，N，N-二-(三甲基甲硅烷基)-4-溴苯胺(2.5ml，8.86mmol) 滴加到在无水THF(2ml)中的Mg旋转混悬液(250mg，10.3mmol) 中，保持速率使Mg的消耗可观察到。将1.1ml的等分格氏试剂滴 加到溶于无水THF(2ml)的4(200mg，1.47mmol)中。搅拌后，回流 溶液2小时，加入冰冷的HCl(20％，4ml)水溶液。室温搅拌过夜后， 用饱和NaHCO3水溶液中和该混合物，用二氯甲烷提取。分离有机 层，经MgSO4干燥，真空浓缩。残留物在硅胶上用PTLC纯化得到 SP003(44mg，0.19mmol，13％)。
1H NMR(d-甲醇)δ7.66(d，2H、9Hz)，6.51(d，2H、9Hz)，2.86(m， 6H)，1.86(m，6H)MS(EI)m/z 230(M+)，174，135，110，96。
实施例2.SP003抑制Hela细胞中HIV-1 IIIB复制的研究
A.方法
为研究病毒体外复制，采用GenPhar AV-FinderTM-HIV药物开 发试验，这是一种新技术，由两部分组成：(1)一种克隆的连续传 代HeLa细胞系，含HIV-1 tat-活化的分子开关和绿色荧光蛋白基因； (2)重组腺病毒(rAd)载体，其含所有三种转导入HeLa细胞的HIV-1 受体/共受体(CD4、CXCR4和CCR5)基因，并将它们转化为高敏感 性HIV-1指示基因供实验用。指示细胞过表达HIV-1受体基因并易 受HIV-1株或分离体感染。所有待测HIV-1株，无论共受体优选与 否，以及所有HIV-1的亚型或类将感染此指示细胞。受感染细胞的 荧光明亮，因此易于用标准实验室读板技术检测和定量潜在抗病毒 药物对病毒复制的抑制。
检测器板在第一天建立，方法为将HeLa细胞(3000/孔)添加至含 CCS和腺病毒AD-3R的在96孔板中的DMEM培养基中，并于37℃、 95％湿度和5％CO2下培养两天。在没有预先用药的情况下，在第三 天加入HIV-1 IIIB(200IP/孔)和浓度逐渐升高的SP003或对照化合物 (AZT、ddI、3TC)并孵育过夜。第四天，将培养基换成含相应浓度 的目标化合物的新鲜培养基。第七天通过检测各孔的荧光评估感染 性(λemis＝485nm；λexc＝520nm)。在预先24小时用药的情况下，在 第三天加入浓度逐渐升高的SP003或对照化合物(AZT、ddI、3TC) 并孵育过夜。在第四天加入HIV-1 IIIB(200IP/孔)和浓度逐渐升高的 SP003或对照化合物(AZT、ddI、3TC)并孵育过夜。第五天，将培养 基换成含相应浓度的目标化合物的新鲜培养基。第八天通过检测各 孔的荧光评估感染性。结果以病毒复制抑制百分比形式表达。
上述细胞处理方案之后，测定细胞的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)- 2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)还原水平，并测定线粒体完整性，以检 查待测化合物是否具有细胞毒性。
使用(4-氨基-苯基)-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-4-基)-甲酮(Fig.1)的单 独水溶液形式(SP003)或含水制剂形式(SP003A)，该制剂中药剂：硫 酸锌：抗坏血酸的比例为26.6/1/1.6(例如，200mg SP003中有7.5mg 硫酸锌七水合物和12.5mg抗坏血酸；Xu，J.et al.，J.Pharmacol.Exper. Ther.、(2003)307：1148-1157。
B.结果
1.对HIV-1 IIB病毒复制的影响。无预先给药(Fig.2)
化合物(4-氨基-苯基)-(1-氮杂-二环[2，2，2]辛-4-基)-甲酮(SP003) 的结构示于Fig.1。将化合物溶于水，或溶于含七水硫酸锌、抗坏血 酸和苯甲酸钠的制剂(SP003A)中。当给药浓度达1μM 时，SP003抑 制HIV-1 IIIB病毒复制的有效性高于经典抗病毒药物ddI(Fig.2)。 SP01A在非常低的浓度下也抑制病毒复制(Fig.2)。令人感兴趣的是， SP003和SP003A在所有测试浓度，直至100μM，用MTT细胞毒 性试验分析都没有检测到细胞毒性，相反，经典抗病毒药ddI、AZT 和3TC都显示出毒性，其IC50浓度值分别为89、161和71μM。因 此，对于今后的实验，并且为了能够精确对比待测化合物与经典抗 病毒药物的抗病毒性质，要评价pM至10μM的浓度范围。
2.对HIV-1 IIB病毒复制的影响。预先24小时给药的效果(Fig.3)
在该研究中使用SP003A。预先24小时给予SP003 A后，其对 病毒复制影响的有效性强于AZT(Fig.3)。
3.对HIV-1 IIB病毒复制的影响。预先48小时给药的效果(Fig.4)
预先48小时给予SP003，50％HIV复制抑制的IC50值为0.03nM (Fig.4)。使用同样方案的AZT以剂量依赖性方式抑制HIV复制，IC50值为30nM。
4.对HIV MDR 769病毒复制的影响。没有预先给药的效果(Fig.5)
不出所料，AZT不能有效抑制HIV MDR 769株复制(Fig.5)。 SP003抑制60％的HIV MDR 769病毒复制，IC50值为0.01nM(Fig. 5)。
这些实施例表明，奎宁环化合物(4-氨基-苯基)-)1-氮杂-二环[2，2，2] 辛-4-基)-甲酮(SP003)降低人细胞中HIV-1 IIB复制的能力高于AZT 或ddI。在一个没有预先给药的试验方案中，观察到该化合物抑制50％ 以上的HIV-1 MB复制的浓度在纳摩尔范围，并且在化合物水溶液 形式和溶于七水硫酸锌和抗坏血酸溶液的形式(SP003A)之间没有显 著差异。
为了确定该化合物是否直接靶向病毒，或是否有另外的机制介 导该化合物作用于病毒复制，将Hela细胞在加入病毒前用SP003以 含七水硫酸锌和抗坏血酸的形式预先处理24小时。令人感兴趣的 是，所得效应远强于没有预先处理的情形以及浓度在皮摩尔范围的 情形。SP003 A的曲线平顶位于60％抑制以上，而AZT的约在40 ％。与待测化合物预孵育48小时也显示出显著的效果。预先给药与 未预先给药间显示的有效性差别暗示式I化合物可能不直接靶向病 毒，更可能改变细胞对病毒进入的敏感性，从而使其更抗感染。与 经典抗病毒药物AZT和ddI相比，SP003由于降低了细胞的感染性 从而应该能有效阻断HIV MDR 769病毒复制。实际上，虽然AZT 不能有效阻断HIV MDR 769病毒复制，但SP003有效阻断病毒复制 /细胞的感染性。
总之，本文的数据证明了(4-氨基-苯基)-(1-氮杂-二环[2.2.2]辛-4- 基)-甲酮(SP003)提供了新型抗反转录病毒疗法，该疗法单独使用或 与HAART和mega HAART疗法联用均有效。这些结果表明这些化 合物最有可能通过提高细胞对病毒进入的抗性发挥作用，而不是直 接作用于病毒本身。虽然其作用机理不十分清楚，其作用于宿主细 胞而不是作用于病毒预计可降低抗性株的发生率并因此提高抗反转 录病毒疗法的有效性。
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