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1、(10)申请公布号 CN 101985045 A (43)申请公布日 2011.03.16 CN 101985045 A *CN101985045A* (21)申请号 201010517341.8 (22)申请日 2010.10.18 A61K 51/00(2006.01) A61K 101/02(2006.01) (71)申请人 北京大学第一医院 地址 100034 北京市西城区西什库大街 8 号 北京大学第一医院 (72)发明人 王荣福 魏海亮 闫平 张春丽 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 131I 标记 SAP 在制备诊。
2、断淀粉样变的药物中 的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 131I标记SAP的新应用。 该 新应用为 131I 标记 SAP 在制备诊断淀粉样变的试 剂中的应用。本发明采用碘 131 标记的 SAP 进行 完整的动物体内试验及临床前试验研究， 建立了 淀粉样变的小鼠模型， 经病理证实后进行 131I 标 记SAP显像， 结果显示小鼠腹部有浓聚。 并进一步 通过实验证明了 131I 标记 SAP 作为诊断淀粉样变 的药物准确性高。 该新应用， 填补国内淀粉样变诊 断的核医学技术的空白， 满足临床早期发现并及 早干预淀粉样变性发展改善预后并便于随访的需 要。 (51)Int.Cl. (19)中。
3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 101985045 A1/1 页 2 1.131I 标记 SAP 在制备诊断淀粉样变的试剂中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述淀粉样变为肝器官和 / 或肾器官的 淀粉样变。 3. 一种诊断淀粉样变的试剂， 其活性成分为 131I 标记 SAP。 权 利 要 求 书 CN 101985045 A1/4 页 3 131I 标记 SAP 在制备诊断淀粉样变的药物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及 131I 标记 SAP 在制备诊断淀粉样变的药物中的应用。 背景技术 00。
4、02 淀粉样变疾病是细胞附属结构的病变， 细胞合成和分泌的可溶性蛋白质分子形成 不溶性纤维组织沉积， 并最终导致器官功能障碍而致患者死亡。目前对于淀粉样变的诊断 多来自于组织活检， 但是该检查具有创伤性而且组织来源有限， 难以提供病变范围、 定位、 进展或退化的信息。 0003 血清淀粉样P成分(SAP)是一种常见血浆蛋白， 是淀粉样沉积中的非纤维性成分， 在淀粉样变性物质形成稳定的不溶性结构中起了关键、 特异的作用， 并存在于所有不同类 型的淀粉样变性物质中。 发明内容 0004 本发明的目的是提供 131I 标记 SAP 作为诊断淀粉样变的试剂， 即作为一种新型的 手段诊断淀粉样变性。 0。
5、005 本发明所提供的新应用为 131I标记SAP(碘131 标记的SAP)在制备诊断淀粉样变的 试剂中的应用 ； 特别是在制备诊断肝器官和 / 或肾器官的淀粉样变的药物中的应用。 0006 本发明还提供诊断淀粉样变的试剂， 其活性成分为 131I 标记 SAP。 0007 本发明利用 SAP 的特异性作用， 并在其适合分子功能基团上进行放射性核素碘 131I 标记， 研究活体状态下淀粉样变的无创、 特异性检查方法的可行性。 0008 SAP是一种常见血浆蛋白， 是淀粉样沉积中的非纤维性成分。 其通过钙依赖性结合 反应特异、 可逆地表达在各种类型的淀粉纤维上， 可以对淀粉样沉淀在体内定量多次的。
6、评 价。该示踪剂在无淀粉样变的正常个体中不聚集， 但是会迅速特异地定位于患病个体的淀 粉样变部位。相比组织活检技术更安全， 提供的信息也更多。放射性核素标记的血清淀粉 样P成分(SAP)作为一种特异性淀粉样变的核医学示踪剂克服了目前临床诊断方法的诸多 缺点。 0009 本发明采用碘 131 标记的 SAP 进行完整的动物体内试验及临床前试验研究， 建立了 淀粉样变的小鼠模型， 经病理证实后进行 131I-SAP 显像， 结果显示实验小鼠腹部有明显浓 聚， 与对照组形成显著区别。并进一步通过生物分布实验证明了 131I-SAP 作为诊断淀粉样 变的药物准确性高。从而建立有效的核医学诊断方法， 填。
7、补国内淀粉样变诊断的核医学技 术的空白， 满足临床早期发现并及早干预淀粉样变性发展改善预后并便于随访的需要。 0010 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 具体实施方式 0011 下述实施例所述的方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0012 实施例 1、 放射性碘标记 SAP 诊断淀粉样变的实验研究摘要 0013 一、 实验材料 说 明 书 CN 101985045 A2/4 页 4 0014 1、 实验动物 0015 6-8 周雌性 KM 小鼠 (20-25g)68 只， 由北京大学医学部动物室提供。 0016 2、 主要试剂 0017 SAP( 免疫化学纯度 99 ) Merck。
8、 公司， 500g 0018 Sephadex G25(Fine) GE 公司 0019 Iodogen(1， 3， 4， 6- 四氯 3， 6- 二苯 - 甘脲 )Sigma 公司， 250mg 0020 酪蛋白 (Casein) Merck 公司， 100g 0021 PB(0.5M)100ml 的配制 ： Na2HPO4(14.5047g) 溶于 81ml 蒸馏水 ； 0022 NaH2PO4(1.482g) 溶于 19ml 蒸馏水中， 然后二者混合即得。 0023 以上 PB 稀释 10 倍即成 0.05M PBS。 0024 3、 主要设备 0025 井型测量仪， 放射性测量仪， S。
9、PECT 显像仪。 0026 二、 淀粉样变动物模型的建立 0027 8 只 6-8 周雌性 KM 小鼠 (20-25g)， 北京大学医学部动物室， 均经颗粒饲料喂 养， 符合实验动物质量标准， SPF 级饲养环境。先随机取 5 只依据文献 Mcadam KPWJ， SipeJD.Murine mode for human secondary amyloidosis ： cenetic variability of the accute-phase serum protein SAA response to endotoxins and casein.The journal of experi。
10、mental medicine， 1976， (144) ： 1121-1128 ； Wall JS， Kennel SJ， Paulus MJ.et al.Quantitative high-resolution microradiographic imaging of amyloid deposits in a novel murine model of AA amyloidosis.Amyloid， 2005， 12， (3) ： 149-156 用 0.5M NaHCO3溶液为溶剂配置 10酪蛋白 (Casein) 溶液 (0.4205g NaHCO3溶于 100ml 蒸馏水中， 待全。
11、部溶解后、 在搅拌下逐渐加入 Casein 10g 得到溶液 )， 取 4冰箱冷藏备用的酪蛋白 (Casein) 溶液， 每次 0.5ml 背部皮下多点注射连续 21 天， 另 3 只同步背部注射 0.5ml 生理 盐水对照。5 只中随机取两只解剖分别取肝、 脾、 双肾、 主动脉、 脑等 10福尔马林固定后送 病理行 HE 及刚果红染色， 确定淀粉样变模型建立 ； 另两组 6 只小鼠待显像。 0028 上述取实验组小鼠肝、 脾、 肾、 主动脉、 脑组织， 冰冻、 切片、 HE 染色及刚果红 染色， 可见小鼠肾脏基底层间质血管壁内多处染色呈明显砖红色， 脾脏内小血管亦可见少许砖红 色， 证实模型。
12、建立成功。 0029 三、 131I-SAP 的制备 0030 将 500g 人 SAP 用蒸馏水 500l 溶解后分装成十份， 即每份含 50g 人 SAP， 置 于 2-4冰箱备用 ； 取 1mg Iodogen 溶于 7.5ml 三氯甲烷中， 分装于分别含 20g、 40g、 60g、 80g Iodogen 的无菌 EP 管， 氩气吹干后成功铺管， 密封、 -20保存 ； sephadexG25 浸泡、 装柱并用10BSA溶液(1g BSA溶于10ml蒸馏水中)饱和后备用 ； 先后取用不同含量 Iodogen管并加入上述配置的SAP 50g及Na131I溶液(Na131I溶液分别试用3。
13、0l、 40l、 50l、 60l、 70l、 80l( 放射性浓度为 1MBq/l)， 用 0.05M PBS 加至 200l， 充分摇 匀 2 分钟后， 加入层析柱中心， 待液平面逐渐浸没后沿管壁缓慢加满 PBS， 接管、 测量， 分别 计算标记率， 摸索最佳反应比例。 0031 标记率 ( 蛋白峰各管放射性记数总和 )/( 蛋白峰 + 游离峰放射性记数总 和 )100。 说 明 书 CN 101985045 A3/4 页 5 0032 比活度 ( 放射性核素投入量 标记率 )/ 投入的 SAP 质量。 0033 结果表明， 70l(1mCi)Na131I、 50gSAP 与 80l 0.。
14、05M PBS， Iodogen 用量 80g 的反应条件下， 室温反应2分钟为最佳反应条件条件， 制备的 131I标记SAP(131I-SAP)的标记 率为 70.6， 经分离纯化后的放化纯度 90。 0034 按照上述最佳反应条件进行 131I 标记 SAP 的制备， 并对其进行体外及血清稳定性 测定 131I 标记 SAP 放化纯度及体外稳定性至 96h。4冰箱放置及体外 37人新鲜血清中 0h、 24h、 48h、 72h、 96h 的放射化学纯度分别为均超过 90。 0035 结果表明 131I-SAP 有良好的体外稳定性。 0036 四、 显像 0037 各取 200l 131I-。
15、SAP(7.4MBq) 分别注入步骤二获得的两组 KM 小鼠尾静脉后分别 于 1h、 3h、 6h、 24h、 48h 及 72h 显像。 0038 显像结果提示， 1h、 3h、 6h 两组小鼠全身均可显影， 但对照组摄取较淡、 模糊， 范围 广， 提示为血池相， 实验组小鼠腹部较浓， 24h 后实验组小鼠腹部摄取显着增浓而对照组无 明显摄取。 0039 五、 131I-SAP 作为诊断淀粉样变的药物的准确率验证 0040 1、 建立动物模型 0041 按照步骤二的预实验方法建立 30 只 6-8 周雌性 KM 小鼠 (20-25g) 动物模型， 并设 置相同数量、 种系、 性别、 周龄昆明。
16、小鼠， 同步背部注射0.5ml生理盐水连续21天作为对照。 0042 2、 放射性摄取分布及准确率 0043 生物分布 ： 所有 60 只小鼠分为 1h、 3h、 6h、 24h、 48h 及 72h 的实验和对照组， 分别 经尾静脉注入200l上述稀释 131I-SAP， 剩余131I-SAP取10l用PBS稀释至1ml混匀后抽 取 100l 留作标准源。分别于 1h、 3h、 6h、 24h、 48h 及 72h 断颈处死各组小鼠， 抽取 100l 新鲜不凝血液连同吸头放入试管、 密封， 解剖分别取其心、 肝、 脾、 肺、 肾、 胃、 肠、 膀胱、 长骨、 肌肉、 主动脉、 脑用统一大小、。
17、 重量称量纸包裹并装入玻璃管， 放置于放射专用冰箱 2 周后 用井型测量仪测量放射性记数。 0044 体内分布 ： 实验组和对照组小鼠在静脉注射 131I-SAP后1h、 3h、 6h时的生物分布无 明显差异， 静脉注射后 24h、 48h 及 72h 实验组肝、 脾、 肾中的放射性摄取高于对照组。 0045 用 SPSS 13.0 软件进行单因素独立样本 t 检验得出 24h 每克肝、 脾、 肾组织放射 性计数实验组与对照组的 P 值分别为 0.001(t 10.747)、 0.001(t 11.626)、 0.001(t 15.135)， 48h 每克肝、 脾、 肾组织放射性计数实验组与对。
18、照组的 P 值分别为 0.002(t 15.128)、 0.002(t 4.558)、 0.003(t 16.96)， 72h 每克肝、 脾、 肾组织放射性计数实验组 与对照组的 P 值分别为 0.004(t 7.801)、 0.057(t 3.022)、 0.008(t 6.442)。可见， 肝、 肾摄取的差异有显着性统计学意义。 0046 北京大学第一医院肾内科在肾脏疾病的诊治方面处于国内领先水平， 在收治的肾 脏病人中， 淀粉样变病例并不少见， 非常需要无创性的核医学显像方法进行明确诊断及疗 效的监测， 这是本研究的原动力。 0047 在放射性核素选择方面， 99mTc 是核医学显像常用。
19、的优良放射性核素， 但99mTc 标记 的 SAP 在体内与靶组织亲和力下降， 易脱标， 99mTc-SAP 降解产物不能完全从体内清除， 增加 了本底。而碘标记 SAP， 其体内稳定性及显像效果大大优于 99mTc 标记 SAP。 说 明 书 CN 101985045 A4/4 页 6 0048 综上所述， 本研究采用碘 131 标记的 SAP 进行完整的动物体内试验及临床前试验 研究， 建立有效的核医学诊断方法， 从而填补国内淀粉样变诊断的核医学技术的空白， 同国 外应用 123I( 加速器生产的放射性核素， 目前国内空白 ) 标记 SAP 相比具有价格低廉、 简便 易得的优点， 符合我国国情、 利于普及， 能满足临床早期发现并及早干预淀粉样变性发展改 善预后并便于随访的需要。 说 明 书 。