细胞毒性组合物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102036683 A (43)申请公布日 2011.04.27 CN 102036683 A *CN102036683A* (21)申请号 200980118594.3 (22)申请日 2009.05.19 131596/08 2008.05.20 JP A61K 39/395(2006.01) A01K 67/027(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/06(2006.01) C07K 16/02(2006.01) C12N 15/09(2006.01) (71)申请人 株式会社钟化 地址 日本大阪府 (72)发明人 山下敬 。

2、(74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 张平元 (54) 发明名称 细胞毒性组合物 (57) 摘要 本发明涉及一种细胞毒性组合物， 其以从转 基因鸟类产出的卵中得到的抗体为有效成分， 所 述转基因鸟类导入有编码IgG抗体的基因。 该IgG 抗体的蛋白质一级结构未发生改变， 其呈现出比 CHO 细胞来源的 IgG 抗体更高的 CDC 活性， 可望具 有高抗肿瘤效果且副作用少。 此外， 本发明提供含 有该细胞毒性组合物的癌症改善或治疗剂， 或者 抗自体免疫疾病的治疗剂。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2010.11.22 (86)PCT申请的申请数据。

3、 PCT/JP2009/059161 2009.05.19 (87)PCT申请的公布数据 WO2009/142186 JA 2009.11.26 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 1 页 CN 102036686 A1/1 页 2 1. 一种细胞毒性组合物， 其以从转基因鸟类产出的卵中得到的抗体为有效成分， 所述 转基因鸟类导入有编码 IgG 抗体的基因。 2. 根据权利要求 1 中所述的细胞毒性组合物， 其以从卵清得到的抗体为有效成分。 3. 根据权利要求 1 或 2 中所述的细胞毒性组合物， 其中，。

4、 IgG 抗体的恒定区是人源 IgG 类。 4.根据权利要求13中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， 转基因鸟类是转基因 家禽鸟类。 5. 根据权利要求 1 4 中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， 抗体的 N- 糖苷键复 合物糖链中的岩藻糖含量为 CHO 细胞来源抗体的五分之一以下。 6.根据权利要求15中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， 抗体的CDC活性是用 CHO 细胞产生的抗体的五倍以上。 7. 根据权利要求 1 6 中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， IgG 抗体是识别在癌 细胞中特异性表达的抗原的抗体。 8. 一种癌症疾病的改善或治疗剂， 其含有权利要求 1 7。

5、 中任意一项所述的细胞毒性 组合物。 9. 根据权利要求 1 6 中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， IgG 抗体是中和或抑 制与自体抗原发生反应的效应器细胞的抗体。 10.一种自体免疫疾病的改善或治疗剂， 其含有权利要求16或者9中任意一项所述 的细胞毒性组合物。 权 利 要 求 书 CN 102036683 A CN 102036686 A1/9 页 3 细胞毒性组合物 技术领域 0001 本发明涉及细胞毒性组合物， 其是以基因重组的 IgG 抗体为有效成分， 所述本发 明IgG抗体比天然来源抗体或者从CHO培养细胞制得的抗体具有更高的补体依赖性细胞毒 (CDC) 活性。 背景技术 。

6、0002 抗体是被称作免疫球蛋白的糖蛋白， 在属于淋巴细胞的 B 细胞中产生。作为抗体 的特性， 可以识别特定的分子结构 ( 抗原 )， 且具有很高的结合能力， 从而将入侵生物组织 的细菌和病毒等非自体蛋白排除， 在对感染的防御中发挥重要作用 ( 非专利文献 1)。 0003 由来自单一抗体产生细胞的克隆制备得到具有均一的性质的抗体 ( 单克隆抗体 ) 成为了可能， 以作为癌细胞和免疫疾病产生原因的特定抗原为靶标的抗体药物得到了实用 化。 制备单克隆抗体时， 通常采用的方法是从小鼠细胞获得针对抗原的抗体， 但对于人体给 药， 为了防止排斥反应， 有必要将恒定区等变为人抗体的氨基酸序列。 000。

7、4 抗体药物由于具有很高的特异性， 可以成为癌症和自体免疫疾病的有效药物 ( 非 专利文献 2)， 但是其缺点在于制造成本高， 导致医疗费用增高。所以期待对其制造方法进 行改善， 转基因 ( 基因重组 ) 鸡等动物工厂是研究低成本生产抗体的一个方案 ( 专利文献 1)。 0005 此外， 伴随着实用化的抗体药品临床知识日渐丰富， 发现其效果并非充分， 有必要 研制出效果更好的抗体。 为了提高抗体的药效而研究增强其活性， 不仅有利于提高药效， 而 且可以降低给药量， 从而有助于降低成本。 0006 为了制造具有更高活性的抗体， 通过基因重组技术改变抗体的糖链和氨基酸， 从 而对提高抗体依赖性细胞。

8、毒 (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity ： ADCC) 活性和补体依赖性细胞毒 (complement-dependent cytotoxicity ： CDC) 活性的方法进行 研究 ( 专利文献 2)。已经知道， 通过除去结合于抗体 Fc 区域的 N- 糖苷键复合物糖链中的 岩藻糖， 可提高 ADCC 活性的效果。此外还知道， 在转基因鸡的卵清中产生的抗体， 通过导 入基因的表达， 其 N- 糖苷键复合物糖链中的岩藻糖含量低， 所以 ADCC 活性高 ( 非专利文献 3)。 0007 按照这样的方法， 通过人工改变糖链， 可以提高A。

9、DCC活性， 但是提高CDC活性的实 用的方法还未知。如上所述， 如果抗体 Fc 区域的 N- 糖苷键复合物糖链中不含有岩藻糖， 可 以预测其 ADCC 活性高， 但是在这种情况下， 其 CDC 活性未必高。IgG 抗体中存在子类， 作为 抗体药品， 多采用药效高， 且可选择性地与蛋白质A结合从而容易被纯化的IgG1。 但是IgG3 抗体的 CDC 活性较高， 公知可以通过将 IgG1 抗体的一部分 Fc 区域替换为 IgG3 抗体的氨基 酸， 人工制造出 CDC 活性提高的抗体药物。但是这种在 IgG 子类间变换结构的嵌合抗体在 天然中并不存在， 可能会出现预期不到的副作用(抗原性)， 所以。

10、期望在不改变抗体Fc区域 蛋白质一级结构的条件下提高 CDC 活性的技术。 0008 CDC 活性对于高效率地排除靶细胞发挥重大作用， 所以该活性高的 IgG 抗体， 期待 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A2/9 页 4 在抗癌或者被用作改善过敏反应以及特异反应性等自体免疫疾病的抗体药品时具有良好 效果。CDC 活性在非霍奇金淋巴瘤治疗用抗体利妥昔单抗 (rituximab) 的抗癌作用机制中 发挥着很大的作用 ( 非专利文献 4)， 因此， 在不改变天然氨基酸结构的前提下以更低成本 制造具有高 CDC 活性的 IgG 抗体技术， 对于现代生活中高罹患率的。

11、癌症患者和自体免疫疾 病患者而言是一个福音。 0009 现有技术文献 0010 专利文献 0011 专利文献 1 ： WO2004/016081 0012 专利文献 2 ： WO2007/011041 0013 非专利文献 0014 非专利文献 1 ： Monoclonal Antibodies ： Principles and Applications， Wiley-Liss， Inc.(1995) 0015 非专利文献 2 ： Nature Reviews Cancer， 1， 119(2001) 0016 非专利文献 3 ： Nature Biotechnology， 28， 1038(。

12、2005) 0017 非专利文献 4 ： Biochemi.Soc.Trans， 25 ： 705(1997) 发明内容 0018 发明要解决的问题 0019 有必要提供在不改变天然蛋白质的一级结构的条件下， CDC 活性和 ADCC 活性等与 治疗效果有关机能提高的抗体组合物及其低成本制造方法。 0020 解决问题的方法 0021 本发明者发现， 导入了编码 IgG 抗体基因的转基因鸟类产生的卵中蓄积的 IgG 抗 体， 比 CHO 细胞来源的 IgG 抗体具有更高的 CDC 活性， 从而完成了本发明。 0022 换言之， 本发明是基于上述发现完成的， 其包含以下发明。 0023 (1). 。

13、一种细胞毒性组合物， 其以抗体为有效成分， 所述抗体是从导入了编码 IgG 抗体的基因的转基因鸟类产出的卵中得到的。 0024 (2). 上述 (1) 中所述的细胞毒性组合物， 其以从卵清得到的抗体为有效成分。 0025 (3). 上述 (1) 或 (2) 中所述的细胞毒性组合物， 其中， IgG 抗体的恒定区是人源 IgG 类。 0026 (4).上述(1)(3)中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， 转基因鸟类是转基 因家禽鸟类。 0027 (5). 上述 (1) (4) 中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， 抗体的 N- 糖苷键 复合物糖链中的岩藻糖含量为 CHO 细胞来源抗体的五。

14、分之一以下。 0028 (6).上述(1)(5)中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， 抗体的CDC活性是 用 CHO 细胞产生的抗体的五倍以上。 0029 (7). 上述 (1) (6) 中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， IgG 抗体是识别在 癌细胞中特异性表达的抗原的抗体。 0030 (8). 一种癌症疾病的改善或治疗剂， 其含有上述 (1) (7) 中任意一项所述的细 胞毒性组合物。 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A3/9 页 5 0031 (9). 上述 (1) (6) 中任意一项所述的细胞毒性组合物， 其中， IgG 抗体是中和或 抑制。

15、与自体抗原发生反应的效应器细胞的抗体。 0032 (10).一种自体免疫疾病的改善或治疗剂， 其含有上述(1)(6)或者(9)中任意 一项所述的细胞毒性组合物。 0033 发明效果 0034 本发明的细胞毒性组合物以从导入了编码 IgG 抗体的基因的转基因鸟类产出的 卵中所产生的抗体为有效成分。该 IgG 抗体的 CDC 活性比 CHO 细胞来源的 IgG 抗体的 CDC 活性更高， 而且蛋白质一级结构相对于天然型未发生改变， 可提供副作用少、 疗效高的抗体 药物。另外， 公知在转基因鸡的卵清中产生的抗体 N- 糖苷键复合物糖链中的岩藻糖含量较 少， 由此也期待其ADCC活性高。 CDC活性和。

16、ADCC活性两者都高， 可以将靶细胞有效地破坏、 杀死或者失活。 0035 进一步地， 通过使用转基因鸟类， 在其卵中制造该 IgG 抗体， 所以低成本制造该抗 体成为可能。 0036 附图简要说明 0037 图 1 所示是关于本发明实施例 9 中， 转基因鸡来源和 CHO 细胞来源的完全人源 抗 TNF 抗体对于表达 TNF 抗原的 T 细胞的致死活性 (CDC 活性 ) 的示意图。TG 卵清抗体是 指由转基因鸡生产的卵清中纯化得到的完全人源抗 TNF 抗体。CHO 抗体是指在 CHO 细胞中 制造的完全人源抗 TNF 抗体。纵轴表示 FACS 测定的靶细胞的死亡率。 0038 发明的具体实。

17、施方式 0039 本发明的细胞毒性组合物， 是以从导入了编码 IgG 抗体的基因的转基因鸟类产出 的卵中得到的抗体为有效成分， 通过该抗体的 CDC 活性、 或者 CDC 活性和 ADCC 活性两种活 性， 可以对涉及某种疾病、 疾患等的细胞加以破坏、 杀死或者灭活的组合物。 0040 关于用于制造转基因鸟类的基因导入法， 并无特殊限定， 可以列举病毒载体法、 精 子载体法和使用 PGC( 原始生殖细胞 ) 的方法。 0041 考虑到安全性， 本发明使用的逆转录病毒载体优选缺失复制能力。作为复制能力 的缺失方法， 优选的是通过使编码序列或者表达必需序列的至少一部分或者全部缺失， 或 者通过引入。

18、取代、 嵌入变异而导致不能表达， 使得病毒粒子复制所必需的内核中包含的蛋 白质(群特异性抗原， gag)、 逆转录酶(聚合酶， pol)和包膜糖蛋白(包膜(envelope)， env) 中的任意一个或者其组合不被表达。 0042 就逆转录病毒载体而言， 由于每个病毒可以嵌入的基因长度有限， 所以优选缺失 变异， 从安全性和增加嵌入片段长度的观点来看， 优选缺失gag、 pol和env中的两个或更多 个。 逆转录病毒载体优选在病毒粒子中含有作为包装标记发挥作用的病毒组装信号(phi)。 gag 区域的一部分有时作为病毒的包装信号发挥作用， 所以从提高病毒效价的观点来看， 病 毒载体优选含有至少。

19、一部分不能被表达的 gag 区域。(J.Virol.， 1987， 61(5)， 1639-46)。 0043 作为逆转录病毒， 并无特殊限定， 可以列举莫罗尼小鼠白血病病毒、 莫罗尼小鼠肉 瘤病毒以及鸟白血病病毒(ALV)、 人类免疫缺陷病毒(HIV)来源的病毒等。 为了感染鸟类胚 胎， 优选使用小鼠肝细胞病毒 (MSCV) 和小鼠胚性肝细胞病毒 (MESV) 等对胚细胞和肝细胞 感染性较高的病毒。为了让该病毒载体高效率地感染鸟类细胞， 优选人为地将包膜蛋白变 为牛水疱口炎病毒来源的 VSV-G 包膜蛋白质， 但是并不限于该病毒的类型。 说 明 书 CN 102036683 A CN 102。

20、036686 A4/9 页 6 0044 标记基因是指编码下述蛋白质的基因， 该蛋白质用作鉴定和分离正确导入了基因 的细胞的标记。逆转录病毒载体中也可以含有标记基因。作为标记基因， 并无特殊限定， 可 以列举绿色荧光蛋白 (GFP) 和青色荧光蛋白 (CFP)、 荧光素酶等荧光蛋白质基因， 新霉素抗 性 (Neor)、 潮霉素抗性 (Hygr)、 嘌呤霉素抗性 (Puror) 等抗药性基因， 其他还有胸苷激酶、 二 氢叶酸还原酶、 氨基糖苷磷酸转移酶、 氯霉素乙酰基转移酶、 - 内酰胺酶、 - 半乳糖苷酶 等的基因。标记基因优选带有启动子基因和表达必需的要素。 0045 外源性基因含有抗体蛋白。

21、质的编码序列， 编码序列的边界由 5 末端起始密码子以 及起始密码子对应的 3 末端终止密码子决定。5 末端起始密码子近傍优选含有 Kozak 的 共有序列。编码序列的上游优选存在核糖体结合部位。为了在鸟类细胞内表达， 外源性基 因优选含有至少一部分或者全部适当的启动子基因。所述启动子基因， 是指 DNA 或者 RNA 上这样的区域， 其决定基因的转录起始部位， 并直接调节转录的频度。 0046 抗体分子包含根据抗原结构相应变化的结合区和变化较少的恒定区， 根据恒定区 结构不同， 可以分为几个种类(类别)。 哺乳动物根据恒定区结构差异有IgG、 IgE、 IgA、 IgM、 IgD 五个种类，。

22、 其生理活性也各不相同。IgA， IgG 可以进一步分为亚类。 0047 就抗体药物而言， 使用血中寿命长且效果好的 IgG1 类抗体， 因此本发明中向转基 因鸟类中导入的抗体基因优选为 IgG1 类抗体的结构基因。此外， 从在转基因鸟类产出卵 中的蓄积效率的观点来看， IgG1 类抗体也是优异的。另外， 由于在卵中的蓄积良好， 具有人 IgG 类恒定区的抗体的基因、 具有人 IgG1、 鹌鹑 IgG2、 鸡 IgG2 或小鼠 IgG2 亚类恒定区的抗 体的基因等外源性抗体结构基因是优选的。 0048 作为其他优选的抗体结构基因， 可以列举种间嵌合抗体的结构基因。在此所述种 间嵌合抗体， 是指。

23、由2种以上不同生物物种的遗传性状构成的同一IgG亚类间的杂合抗体。 现有的通过小鼠杂交瘤细胞制造的医疗用抗体， 由于是小鼠来源， 所以存在给予人体内时 导致免疫系统排斥反应的问题。为了消除这个缺点， 例如通过重组方法将小鼠 ( 啮齿目 ) 抗体 Fc 部分等人源化， 从而可以大幅度降低排斥反应的风险。 0049 作为上述种间嵌合抗体， 可以列举抗人 CD2 抗体、 抗 CD20 受体抗体、 抗 TNF 抗体 等， 还有已经作为药品上市者。 近年来， 所有的氨基酸序列均来源于人抗体的完全人源抗体 作为药品已经实用化， 这些完全人源抗体可以优选作为本发明制造的抗体。 0050 作为本发明的细胞毒性。

24、组合物的使用领域， 考虑将其用作药品。作为抗肿瘤剂和 癌症疾患的改善或者治疗剂， 优选含有可以识别在癌细胞中特异性表达的抗原， 用于破坏 癌细胞的抗癌用途的抗体作为有效成分。癌细胞与正常细胞的结构差异很少， 所以难以特 异地除去， 但是已经发现其细胞表面存在特异性表达的抗原蛋白质， 所以通过抗体识别进 行诊断和治疗已成为可能。 0051 此外， 作为本发明的细胞毒性组合物的有效成分， 优选治疗自体免疫疾患的抗体， 该抗体中和或抑制与自体抗原反应的效应器细胞。在这种情况下， 本发明的细胞毒性组合 物可以用作抗风湿药等自体免疫疾病的改善或治疗剂。 0052 这类抗体不仅需要能识别靶细胞， 还需要使。

25、靶细胞的机能失活， 此时发挥重要作 用的是上述的抗体依赖性细胞毒 (ADCC) 活性和补体依赖性细胞毒 (CDC) 活性。所述补体 依赖性细胞毒活性， 是指与靶细胞结合后的抗体将补体系统活化， 通过补体所具有的酶， 有 效地溶解靶细胞的作用。根据近年来对抗体药品的研究， 已知补体依赖性细胞毒活性在抗 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A5/9 页 7 癌作用的呈现中发挥了重大功效。 0053 比 CHO 细胞中制造的 IgG 抗体等具有更高的补体依赖性细胞毒活性的单克隆抗 体， 可以有效地破坏作为靶细胞的癌细胞， 从而使给药量降低， 减小副作用， 并提高患者的。

26、 QOL 成为可能， 此外， 由于抑制了制造成本， 所以可以减轻患者的负担。当抗体组合物的 CDC 活性与 CHO 细胞中产生的抗体组合物相比是后者的 5 倍以上时， 适用于本申请发明的细胞 毒性组合物。此外， 抗体组合物的 CDC 活性与 CHO 细胞中产生的抗体组合物相比是其 10 倍 以上时， 更加适用于本发明的细胞毒性组合物。 0054 抗体组合物的 N- 糖苷键复合物糖链的岩藻糖含量是 CHO 细胞来源抗体的五分之 一以下时适合使用， 在十分之一以下时更加适合使用。 0055 为了控制导入的结构基因的表达， 使用组织特异性启动子基因等。所述组织特异 性启动子基因， 是指在鸟类的特定组。

27、织或细胞中具有特别强活性的启动子基因。通过使用 组织特异性启动子基因， 具有可以减少或者排除靶蛋白的表达对鸟类的发育和生存产生不 良影响的可能性的优点。 作为组织特异性启动子基因， 并无特殊限定， 可以使用输卵管特异 性启动子基因。输卵管组织在性成熟后较为活跃， 所以多在性成熟后对其进行强烈诱导。 0056 作为输卵管特异性启动子基因， 可以列举鸟类来源的卵清蛋白、 卵运铁蛋白、 卵类 粘蛋白、 卵粘蛋白、 溶菌酶、 G2 球蛋白、 G3 球蛋白、 卵 ( 类粘蛋白 ) 抑制剂、 卵糖蛋白、 卵黄素 蛋白、 卵巨球蛋白、 半胱氨酸蛋白酶抑制剂、 抗生物素蛋白的启动子基因等。使用这些输卵 管特异。

28、性启动子基因时， 靶蛋白能够在卵清中高表达是特别优选的。 0057 其他的启动子有组织非特异性启动子。 组织非特异性启动子基因指不是组织特异 性启动子基因的启动子基因。组织非特异性启动子基因并无特殊限定， 是指在鸟类的几乎 全部体细胞中均具有活性的启动子基因。 这种情况下， 靶蛋白在血中也有表达， 所以具有在 雏鸟阶段可以检出是否表达靶蛋白的优点。组织非特异性启动子基因并无特殊限定， 可以 列举 肌动蛋白启动子基因、 EF1 启动子基因、 胸苷激酶启动子基因和猿病毒 40(SV40) 启动子基因、 巨细胞病毒 (CMV) 启动子基因、 呼吸道合胞病毒 (RSV) 启动子基因等。另外， 也可以使。

29、用四环素诱导型启动子基因等组织非特异性诱导型启动子基因。 0058 外源性基因也可以含有转录增强子和 / 或调节元件。转录增强子是 DNA 或者 RNA 上的区域， 其为促进从启动子基因转录的序列， 但不能单独地引起转录。 转录增强子与不同 于固有机能启动子的启动子基因相连时大多也能发挥机能， 所以并不限定其与启动子基因 的组合。作为转录增强子， 并无特殊限定， 可以列举 SV40、 CMV、 胸苷激酶增强子、 类固醇应 答元件和溶菌酶增强子等。调节元件是有助于转录调节以及转录后的 RNA 稳定化， 而单独 不会引起转录的 DNA 或者 RNA 上的区域。作为调节元件并无特殊限定， 可以列举 。

30、WPRE( 土 拨鼠肝炎病毒来源的调节元件、 美国专利 6136597 号公报 ) 等。 0059 此外， 外源性基因可以含有上述以外的非翻译区域。 0060 利用包装细胞或者辅助病毒等制备的假型病毒载体， 按照通常的显微注射法 (Bosselman， R.A 等、 Science 243， 533(1989)， 导入至初期胚胎、 血管内及心脏内。除此之 外， 还可以考虑脂质体转染法和电穿孔法等基因导入法， 但考虑到操作性和高导入效率， 优 选显微注射法。 0061 外源性基因并无特殊限定， 不但可以是鸟类以外的基因， 也可以包括鸟类基因。 即 使是制造转基因所用的个体具有的序列， 但由于是在。

31、个体本来所具有的全部基因的基础上 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A6/9 页 8 另外引入基因， 所以称作外源性基因。 0062 复制能力缺失型逆转录病毒载体所感染的胚胎优选是从孵化开始经过 24 小时以 上的胚胎。更优选从孵化开始 32 小时以后且 72 小时以前的胚胎。更优选 48 小时以后且 64小时以前的胚胎。 感染部位即导入病毒液的部位优选心脏内或者血管内。 在制造基因导 入效率高的G0转基因嵌合体鸟类时， 优选在可以观察到心脏跳动的初期阶段(从心脏开始 跳动起 6 小时以内 ) 导入基因。这是出于下面两点考虑 ： 基因随血流运至全身， 而且细胞。

32、数 目不多。 0063 显微注射是在显微镜下使用前端细小的微小玻璃管等向特定部位直接导入病毒 液的方法。在本研究中向心脏或血管等特定部位导入病毒液， 所以其优于脂质体转染法和 电穿孔法等其他基因导入法。 0064 作为本发明中所使用的鸟类并无特殊限定， 优选可以作为家养动物利用的家禽鸟 类。作为家禽鸟类， 可以列举鸡、 火鸡、 野鸭、 鸵鸟、 鹌鹑、 鸭子等。其中鸡较为容易得到， 作 为产卵禽的产量高， 卵大， 且大量饲养方法已经确立， 因此是特别优选的。 0065 将生殖细胞中保有外源性基因的G0转基因嵌合体鸟类与野生型鸟类或者G0转基 因嵌合体鸟类或者其后代交配， 可以通过筛选孵化后的雏鸟。

33、， 得到 G1 转基因鸟类。就 G0 转 基因嵌合体鸟类而言， 其全部细胞均导入外源性基因的效率较低， 在大多数情况下均为导 入了外源性基因的细胞与野生型细胞这两种不同基因型的细胞共存的嵌合体状态。 另一方 面， 对于 G1 转基因鸟类而言， 优选所有的体细胞均一地保有导入的基因。体细胞或生殖细 胞中基因的导入， 可以使用 PCR 法等对血液、 体细胞、 精子或卵子来源的 DNA 或 RNA 进行检 测来加以确认。此外， 也可以依据靶蛋白的表达来判断。可以通过 ELISA 法、 电泳法、 靶蛋 白的活性测定等考察靶蛋白的表达。 0066 G2 代以后的转基因鸟类可以通过使 G1 转基因鸟类交配。

34、得到。交配型可以通过 G1 转基因雄性和野生型雌性、 G1 转基因雌性和野生型雄性、 G1 转基因雄性和雌性等得到， 也 可以将后代与其亲代进行回交。其中， 对于 G1 雄性和野生型雌性的交配型， 1 只 G1 雄性可 以与多个野生型雌性交配， 所以从效率上说是优选的。 0067 本发明的靶蛋白生产方法以从上述的转基因鸟类中回收靶蛋白为特征。具体而 言， 其特征在于从制得的转基因鸟类的血液和 / 或卵中提取并纯化因子。 0068 纯化的特征在于， 使用纯水或者平衡盐类溶液将转基因鸟类的卵特别是卵清成分 稀释， 将所得的溶液通过柱法或过滤法进行纯化。 稀释可以降低卵清的粘度， 为了使柱法能 够顺。

35、利进行， 期望高倍稀释从而降低粘度， 但另一方面体积增加导致回收困难， 因此优选稀 释 2 倍至 10 倍， 更优选 5 倍至 6 倍。 0069 为了从卵清溶液中回收目标抗体组合物， 可以通过单独使用或者组合使用蛋白 A 柱法、 盐析法、 吸附柱色谱法、 离子交换柱色谱法、 凝胶过滤柱色谱法、 抗体柱法纯化， 但并 不仅限定于上述方法。作为吸附柱色谱法， 有 Blue Sepharose 色谱法、 肝素色谱法等， 作为 离子交换柱法， 有阴离子交换色谱法等。 0070 实施例 0071 以下， 以抗 TNF 抗体为例， 演示与 CHO 细胞来源的 IgG 抗体相比， 由转基因鸟类卵 中制得的。

36、 IgG 抗体具有很高的 CDC 活性。但是， 本发明并不限定于所述实施例。 0072 关于基因操作， 若无特殊说明， 按照代表性方法进行 (J.Samnrook， E.F.Fritsch， 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A7/9 页 9 T.Maniatis ； Molecular Cloning， A Laboratry Manual， 2nd Ed， Cold Spring Harbor Laboratory)。关于细胞培养， 若无特殊说明， 按照代表性方法进行。记载有商品名的情况 下， 若没有特殊记载， 按照附录的说明书指示进行。 0073 ( 实。

37、施例 1) 完全人源抗 TNF 抗体表达质粒 pMSCV/GALIH(HUMIRA(R) 的构建 0074 JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING， Vol.98， No.4， 298-303， 2004 中公 开了抗人 CD2 抗体 pMSCV/GALIH(CD2)。 0075 基 于 公 开 的 序 列 信 息， 化 学 合 成 了 完 全 人 源 抗 TNF 抗 体 ( 阿 达 木 单 抗 (Adalimumab) ； HUMIRA(R) 的全碱基序列。将其替换 pMSCV/GALIH(CD2) 的 CD2 序列， 得 到 pMSCV/GALIH。

38、(HUMIRA(R)。 0076 ( 实施例 2) 使用 pMSCV/GALIH(HUMIRA(R) 和 pVSV-G 制备逆转录病毒载体 0077 下文若无特殊说明， 培养基使用含有 10胎牛血清 (Fetal Bovine Serum， FBS)、 50 单位 /ml 的青霉素以及链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco s Modified Eagle Medium， DMEM)(Gibco 公司制造 )。在 37、 CO2 5条件下进行培养。在纯化逆转 录病毒载体使用的质粒 DNA 时， 选用 Endo Free Plasmid Maxi Kit(QIAGEN 公司制造 。

39、)。 0078 为了通过实施例 1 中构建的质粒 pMSCV/GALIH(HUMIRA(R) 制备逆转录病毒载 体， 将带有 gag、 pol 基因的包装细胞 GP293 接种在胶原包被的直径 100mm 的培养皿中， 使 其细胞数为 5106个 / 皿 (70铺满 )( 使得第二天达到 90铺满 )。次日， 除去培养基， 加入 7.2ml 培养基和 10l 的 25mM 的氯喹 (Sigma 公司制造 )， 继续培养 1 小时。将 56l 的 Lipofectamine2000 溶液 (Invitrogen 公司制造 ) 悬浮于 1.4ml 的 Opti-MEMI 培养基 (Gibco公司制。

40、造)中， 室温下静置5分钟。 将12g的pMSCV/GALIH(HUMIRA(R)和12g 的 pVSV-G 悬浮于 1.4ml 的 Opti-MEMI 培养基中。混合 Lipofectamine 2000 溶液和质粒 DNA 溶液， 室温下放置 20 分钟。将其全部加入至培养皿中， 培养 6 小时。6 小时后， 除去培 养基， 加入9ml的培养基和200l的1MHEPES Buffer Solution(Gibco公司制造)， 进一步 培养 24 小时。 0079 将培养上清液通过0.45m的醋酸纤维素滤膜(Advantec公司制造)， 收集至离心 管中。使用超速离心机 CS100GXL( 。

41、日立工机公司制造 )， 以 28,000rpm(50,000g) 离心分离 1.5 小时。除去上清液， 向沉淀中加入 20l 的 TNE 缓冲液 (50mM Tris-HCl(pH7.8)、 130mM NaCl、 1mM EDTA) 在 4条件下静置一晚， 充分悬浮后， 使用小型高速离心机， 以 12,000rpm 离心分离 1 分钟， 将上清液通过 0.45m 的 Durapore Ultrafree 滤膜 (Advantec 公司制 造 )， 以该滤液作为病毒液。 0080 ( 实施例 3) 病毒效价的测定 0081 病毒液效价是根据向 NIH3T3 细胞 (ATCC CRL-1658)。

42、 中添加病毒液后感染的细胞 数目来定义的。将 6 孔培养板的各孔 ( 底面积约为 9.4cm2) 中存在的 5104的 NIH3T3 细 胞中加入以 102至 106倍稀释率稀释的病毒溶液 1ml， 通过测定表达作为标记的 GFP(Green Fluorescent Proteins) 基因的细胞比例， 来测定病毒液的效价。稀释 106倍以后， 呈现 4 个集落时， 病毒效价为 4106cfu/ml。 0082 具体而言， 在开始测定效价的前一天， 向6孔培养板中接种5104个/孔的NIH3T3 细胞并培养。第二天， 用含有 9g/ml 聚凝胺 (polybrene) 的培养基以 900l/ 。

43、孔来更换 细胞培养基， 用培养基将病毒液稀释至 10-1 10-5， 然后分别添加 100l 至各孔进行感染 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A8/9 页 10 ( 聚凝胺的终浓度为 8l/ml)。培养 4 6 小时后， 再加入 1ml 培养基。次日， 更换培养基， 以后每 3 4 天更换一次培养基。感染约 1 周后， 测定表达 GFP 的集落数， 求出效价。 0083 ( 实施例 4) 完全人源抗 TNF 抗体表达稳定的包装细胞的选择 0084 在病毒感染的前一天， 向 24 孔培养板中接种 1.5104个 / 孔的 GP293 细胞并培 养。病毒感染当天。

44、， 更换为 1ml/ 孔的含有 10g/ml 聚凝胺的培养基。然后向其中感染上 文实施例 2 中制得的病毒液。然后， 将细胞按照有限稀释法克隆化。具体而言， 次日， 将细 胞稀释至 10 个 /ml。将稀释后的细胞以 100l 的接种量分别接种至 96 孔培养板中 (1 个 孔中 1 个细胞 )， 选择细胞增殖速度快、 与 GP293 细胞形态接近的细胞， 得到完全人源抗 TNF 抗体表达稳定的包装细胞的克隆。 0085 ( 实施例 5) 使用完全人源抗 TNF 抗体表达稳定的包装细胞和 pVSV-G 的逆转录病 毒载体的制备 0086 向直径为 100mm 的胶原包被的培养皿中接种完全人源抗。

45、 TNF 抗体表达稳定的包 装细胞 5106个 (70铺满 )( 使得第二天达到 90铺满 )。第二天， 除去培养基， 加入 7.2ml 培养基和 10l 的 25mM 的氯喹 (Gigma 公司制造 )， 继续培养 1 小时。将 56l 的 Lipofectamine 2000 溶液悬浮于 1.4ml 的 Opti-MEMI 培养基中， 室温下静置 5 分钟。将 12g 的 pVSV-G 悬浮于 1.4ml 的 Opti-MEMI 培养基中。混合 Lipofectamine 2000 溶液和 质粒 DNA 溶液， 室温下放置 20 分钟。将其全部加入至培养皿中， 培养 6 小时。6 小时后，。

46、 除 去培养基， 加入 9ml 的培养基和 200l 的 1M HEPES Buffer Solution(Gibco 公司制造 )， 培养 24 小时。 0087 将培养上清液通过 0.45m 的醋酸纤维素滤膜， 将滤液收集至离心管中。使用超 速离心机， 以 28,000rpm(50,000g) 离心分离 1.5 小时。除去上清液， 向沉淀中加入 20l 的 TNF 缓冲液， 在 4条件下静置过夜， 充分悬浮后， 使用小型高速离心机， 以 12,000rpm 离 心分离1分钟， 将上清液通过0.45m的Durapore Ultrafree滤膜(Advantec公司制造)， 将该滤液作为病毒液。

47、。按照上述方法， 可以得到效价为 108cfu/ml 以上的病毒液。 0088 ( 实施例 6) 通过向鸡胚中显微注射逆转录病毒载体和人工孵化从而制备产生完 全人源抗 TNF 抗体的转基因鸡 0089 显微注射和人工孵化在无菌条件下进行。 使用消毒液(SHOWA FURANKI公司制造) 和乙醇对鸡受精卵(城山种鸡场)的外侧进行除菌。 将P-008(B)型孵化机(SHOWA FURANKI 公司制造 ) 设置为 38、 湿度 50 60的环境， 将接通电源的时刻作为孵化开始时刻 (0 小时 )， 以后每 15 分钟将卵转动 90进行孵化。 0090 从孵化开始经过约 55 小时后， 孵化机的转。

48、卵改为每 30 分钟转卵 30。将卵 从孵化机取出， 使用带有钻石刀 ( 刀尖径 20mm、 轴径 2.35mm) 的小型车床 (minirouter) (PROXXON 公司制造 ) 以直径为 3.5cm 的圆形切取其尖端部。以直径为 4.5cm 的圆形切取 鸡双黄卵(城山种鸡场)的尖端部， 将受精卵内容物移至舍去内容物的卵壳中， 使用注射器 的内筒使胚胎向上移动。在立体显微镜系统 SZX12( 奥林巴斯公司制造 ) 下， 向 femto 芯片 II(Eppendorf公司制造)中注入病毒液， 使用FemtoJet(Eppendorf公司制造)显微注射约 2l 的病毒溶液。将卵清制成糊， 使。

49、用切割成约 88cm2的保鲜膜 (Saran wrap)( 旭化成 公司制造 ) 将该穴塞住， 重新放入孵化机中继续孵化。从孵化开始至第 20 天， 使用 20G 的 注射针在保鲜膜上打开 20 个左右的孔穴， 并以 60cc/min 的速度向孵化机中供氧。一旦雏 说 明 书 CN 102036683 A CN 102036686 A9/9 页 11 鸟开始破卵， 即将卵壳割碎， 使其孵出。该人工孵化的孵化率是 7 30。 0091 ( 实施例 7) 从转基因鸡卵中获取 IgG 抗体 0092 饲养诞生的雏鸡使其成长。作为饲料， 使用幼雏 S X Safety 和 neoSafety17( 丰 桥饲料公司制造 )。从该转基因鸡。