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1、(10)授权公告号 CN 102077823 B (45)授权公告日 2013.06.26 CN 102077823 B *CN102077823B* (21)申请号 201010546568.5 (22)申请日 2010.11.16 A01N 1/02(2006.01) A61D 19/02(2006.01) A01K 61/00(2006.01) (73)专利权人 生生农业集团股份有限公司 地址 528300 广东省佛山市顺德区大良街道 金榜居委会凤山西路 11 号 专利权人 中山大学 (72)发明人 李桂峰 何建国 洪锡标 王小林 孙际佳 王海芳 罗渡 (74)专利代理机构 广州粤高专利。
2、商标代理有限 公司 44102 代理人 谢敏楠 CN 101711522 A,2010.05.26, 全文 . CN 1596670 A,2005.03.23, 权利要求 1. CN 101874483 A,2010.11.03, 全文 . 于过才等 . 鲈鱼胚胎程序化冷冻保存的研 究 .海洋水产研究 .2004, 第 25 卷 ( 第 1 期 ), 第 1-8 页 . 闫文罡等 . 日本黄姑鱼精子生理特性及超低 温冷冻保存研究 . 海洋渔业 .2008, 第 30 卷 ( 第 2 期 ), 第 145-151 页 . (54) 发明名称 一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法 (57) 摘要。
3、 本发明属于鱼类繁殖技术领域， 涉及斑鳜鱼 精液超低温冷冻保存及杂交人工授精方法， 可广 泛应用于家庭、 集体鳜鱼养殖， 特别是规模化养殖 繁育。本发明包括精液采集、 稀释液配制、 精液稀 释、 精液冷冻、 精液解冻、 人工授精等步骤， 人工授 精时， 通过不同的精卵比实验确定10000001为 最佳冻精与鲜卵比。本发明设备要求低， 操作易 于实现， 可用于一般的鱼类繁殖场地， 能实现对斑 鳜资源的储存， 解决了鳜杂交育种中鳜和斑鳜性 腺发育不同步的问题并提高斑鳜精子利用率的方 法， 在繁殖过程中可以根据育种需求、 生产需要和 亲鱼资源量进行精卵比的灵活调整。 (51)Int.Cl. (56)。
4、对比文件 审查员 周伟 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102077823 B CN 102077823 B *CN102077823B* 1/1 页 2 1. 一种斑鳜鱼人工授精的方法， 其特征包括以下步骤 ： (1) 精液采集 ： 采集成熟度好的斑鳜亲鱼精液， 存放于 4洁净的环境下备用 ； (2) 稀释液配制 ： 配制含 NaCl0.85、 KCl0.05、 葡萄糖 1.5的溶液， 上述百分比为 g/100ml， 调节 pH 值为 6.5 ； (3)精。
5、液稀释 ： 将上述精液和稀释液以14稀释比例混合稀释后， 添加抗冻剂DMSO至 终浓度为 9， 并放于 4条件下平衡 25 分钟 ； (4) 精液冷冻 ： 上述稀释平衡后的精液置于液氮液面上方 5 厘米处平衡 10 分钟， 然后 在液氮面上方 1 厘米处平衡 5 分钟后投入液氮保存备用 ； (5) 精液解冻 ： 将冷冻精液进行解冻， 即将上述精液从液氮中缓慢提起并在接近液氮 罐口液氮蒸气中静置 6 分钟后再浸入 40的温水中摇晃解冻 60 秒， 解冻后在 26室温环 境下保存十分钟 ； (6) 人工授精 ： 选取处于催产效应期的雌亲鱼， 人工挤卵于干净无水的容器中， 添加上 述适量解冻精液后，。
6、 以 0.4 NaCl 溶液激活受精。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述精液采集步骤后进行质量检查 ： 肉眼观察正常精液为乳白色， 用普通显微镜， 在 1040 倍下， 以清水激活， 对平均活率大于 70的精液保存备用， 否则， 弃之。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述人工授精精卵数量配比为 1000000 1。 4. 根据权利要求 1、 2 或 3 所述的斑鳜鱼人工授精的方法， 其特征在于 ： 所述雌亲鱼为 翘嘴鳜。 权 利 要 求 书 CN 102077823 B 2 1/3 页 3 一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法 所属技术领域 。
7、0001 本发明涉及鱼类繁殖技术， 属于水产养殖技术领域， 具体涉及斑鳜鱼精液的超低 温冷冻保存方法， 以及用冷冻斑鳜鱼精液人工授精的方法， 可广泛应用于家庭、 集体鳜鱼养 殖， 特别是规模化养殖繁育。 背景技术 0002 当前， 针对鳜鱼的遗传改良工作在各地广泛进行。我国的鳜鱼资源鱼分布相对广 泛， 但是资源量在逐步减少， 生物多样性丢失问题严重 ； 由于分布的广泛性， 性腺成熟的时 间差大的可以达到两个月， 而繁殖盛期为 20 天左右， 杂交工作对性腺成熟度的要求更高， 过熟或者未完全成熟都将严重影响杂交育种繁殖受精率。 0003 为解决鱼类繁殖中人工授精以及孵化的技术问题， 人们进行了广。
8、泛研究和实验。 0004 专利权人 ： 杨欣， 2008 年 1 月 28 日申请的名称 “银鱼人工授精及受精卵孵化工 艺” 的专利 ( 专利号 ： CN200810018840.5)， 公开 ( 公告 ) 日 ： 2008.07.16， 公开 ( 公告 ) 号 ： CN101218899)， 该发明涉及一种鱼类繁殖技术领域， 尤其是一种银鱼人工授精及受精卵孵 化工艺， 具有 1. 人工授精过程 ： 将精液和卵粒挤入容器， 加 4 8的生理盐水， 搅拌并静 置2-3分钟 ； 2.受精卵孵化过程， 前期孵化 ： 受精卵在孵化室内， 用48的生理盐水消毒 后倒入孵化盘内， 加净水进行孵化， 孵化室。
9、温度 16 20、 避风、 采光、 避免阳光直射， 并且 换水和控制水温 ； 后期管理 ： 受精卵开始出苗后， 停止换水和消毒， 添加净水， 48 至 72 小时 后， 将开始平游的鱼苗投放进养殖池。该发明工艺采用合理、 科学的方法， 大幅度提高了鱼 苗产量和质量。 0005 诸如此类的涉及鱼类人工授精和受精卵孵化工艺的发明创造， 相关技术还有很 多， 就不一一列举， 在鱼类养殖繁殖技术领域， 这些技术方案无疑是成功可行的， 0006 鱼类精液的超低温冷冻保存方法已经基本成熟， 但是种属差异明显存在 ； 斑鳜精 液在室温条件下保存的时间很短， 并且随着时间推移活力会大幅下降 ； 相对于鳜鱼， 。
10、斑鳜资 源量少， 而且体型小， 每一尾鱼可以提供的精液量通常不足 1 毫升， 而且在繁殖过程中的应 激性大， 怎样高效的利用斑鳜精液是一个关键的问题。 在一般的繁殖过程中， 往往没有注意 精卵比， 或者不能根据精液量或者卵的量来灵活调整精卵比， 以提高受精率的同时减少不 必要的资源浪费。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种实用于解决斑鳜和翘嘴鳜杂交育种中性腺发育不同步， 在保证受精率的同时提高斑鳜精子利用率的方法。 0008 本发明是这样实现的 ： 一种斑鳜鱼精液冷冻保存方法， 包括以下的步骤 ： 0009 (1) 精液采集 ： 采集成熟度好的斑鳜亲鱼精液， 存放于 4洁净的环境下备用。
11、 ； 0010 (2) 稀释液配制 ： 配制含 NaCl 0.85 ( 重量比 )、 KCl 0.05、 葡萄糖 1.5的溶 液， 调节 pH 值为 6.5， 备用 ； 说 明 书 CN 102077823 B 3 2/3 页 4 0011 (3) 精液稀释 ： 将上述稀释平衡后的精液和稀释液以 1 4 稀释比例混合稀释后， 添加抗冻剂 DMSO 至终浓度为 9， 并放于 4条件下平衡 25 分钟 ； 0012 (4) 精液冷冻 ： 上述稀释精液置于液氮液面上方 5 厘米处平衡 10 分钟， 再在液氮 面上方 1 厘米处平衡 5 分钟后投入液氮保存备用。 0013 该方法进一步包括 ： 所述精。
12、液采集步骤后进行质量检查 ： 肉眼观察正常精液为乳 白色， 用普通显微镜， 在 1040 倍下， 以清水激活， 对平均活率大于 70的精液保存备用， 否则， 弃之。 0014 本发明还包括一种斑鳜鱼人工授精的方法， 其特征在于包括以下的步骤 ： 0015 (1) 精液解冻 ： 将权利要求 1 或 2 所述方法制备的冷冻精液进行解冻， 即将上述精 液从液氮中缓慢提起并在接近液氮罐口液氮蒸气中静置 6 分钟后再浸入 40的温水中摇 晃解冻 60 秒， 解冻后的精液放于室温避光保存待用 ； 0016 (2) 人工授精 ： 选取催产效应期的雌亲鱼， 人工挤卵于干净无水的容器中， 添加上 述适量解冻后精。
13、液以 0.4 NaCl 溶液激活受精。 0017 该方法进一步包括 ： 所述精液解冻后在 26室温环境下保存十分钟， 再人工授 精， 即精卵充分混合后用 0.4 NaCl 溶液激活受精。 0018 所述人工授精精卵数量配比为 1000000 1 时效果和成本更佳。 0019 本发明的一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法具有如下有益效果 ： 0020 1. 采用精液冷冻保存方法， 解决不同类鳜鱼性腺成熟的时间差大自然条件无法得 到不同类鳜鱼杂交取优的问题， 促进品种多元化和优化组合， 适合规模化养殖繁育。 0021 2. 斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法杂交工作克服对性腺成熟度的要求更 高，。
14、 过熟或者未完全成熟都将严重影响杂交繁殖受精率的问题， 提高杂交繁殖受精率， 即解 决鳜杂交育种中鳜和斑鳜性腺发育不同步的问题并提高斑鳜精子利用率的方法。 0022 3. 本发明设备要求低， 操作易于实现， 可用于一般的鱼类繁殖场地 ； 能实现对斑 鳜资源的储存， 解决杂交中斑鳜鱼和鳜鱼性腺发育不同步的问题 ； 在繁殖过程中可以根据 育种需求和亲鱼资源量进行精卵比的灵活调整。 附图说明 0023 下面结合附图对本发明一种斑鳜鱼精液冷冻保存及人工授精的方法， 实施例进行 详细说明。所述实施例是以非限定性示例的方式给出 ： 0024 图 1 ： 不同精卵比条件下鲜精和冻精的受精率对比 具体实施方式。
15、 0025 实施例一 0026 下面以冷冻保存两尾斑鳜的约 2 毫升精液为例， 说明具体操作过程 ： 0027 (1) 精液采集 ： 选取成熟度好的斑鳜亲鱼两尾 ； 用毛巾擦干鱼体腹部 ； 轻轻挤压腹 部， 挤出少量精液后用干毛巾或者卫生纸擦去并擦干净生殖孔 ； 再轻轻挤压腹部挤出无尿 液和粪便污染的精液并用两支2毫升离心管收集， 分别编号B-1和B-2。 采集的精液放于冰 面上暂时保存。 0028 (2) 精液质量检查 ： 肉眼观察正常精液为乳白色 ； 载玻片上滴一滴清水， 并准备 说 明 书 CN 102077823 B 4 3/3 页 5 好盖玻片， 以牙签挑取少许浸入事先准备好的清水中。
16、激活， 立即盖片后用普通显微镜， 在 1040 倍下观察， 重复两次， 平均活率大于 70的用于后续冷冻保存。 0029 (3) 稀释液配制 ： 分别称取 0.85 克 NaCl、 0.05 克 KCl、 1.5 克葡萄糖溶解于水中， 加水定容至 100 毫升， 调节 PH 值为 6.5， 配制好后放入 4冰箱备用。 0030 (4) 精液稀释及分装 ： 分别于 10 支 2 毫升的冻存管中分装 0.8 毫升稀释液和 0.1 毫升4保存的DMSO后摇匀， 再分别取精液0.2毫升加入冻存管中并吹打均匀， 两毫升分装 于10支冻存管中， 然后放于冰面上避光平衡25分钟。 抗冻剂DMSO即二甲基亚砜。
17、(Dimethyl sulfoxide 或 DMSO)， 是分子式为 (CH3)2SO 的化学物质， 其为一无色液体， 本实施例为抗冻 剂。 0031 (5) 精液冷冻 ： 平衡后的冻存管在液氮罐的液氮液面上方 5 厘米处平衡 10 分钟， 液氮面上方 1 厘米处平衡 5 分钟后投入液氮保存。 0032 实施例二 0033 下面以解冻一管冷冻保存精液用于授精为例， 说明具体操作过程 ： 0034 (1) 精液解冻 ： 解冻时将一支冻存管从从液氮中缓慢提起并在接近液氮罐口液氮 蒸气中缓冲 6 分钟后再浸入事先准备好的 40的温水中摇晃解冻 60 秒。解冻后的精液放 于室温 (26 ) 避光保存待。
18、用。 0035 (2) 授精 ： 选取催产后效应期到了的雌亲鱼一尾， 人工挤卵于干净无水的碗中， 取 卵 10 毫升添加 1 毫升已解冻 10 分钟的冻精， 混合均匀并搅拌 1 分钟后， 添加 10 毫升 0.4 Nacl 溶液激活受精 ； 加水充气孵化， 原肠中期统计受精率可达 40。 0036 实施例三 0037 下面以 0.5 毫升冷冻保存精液， 在低精卵比条件下用于授精为例， 说明具体操作 过程 ： 0038 选取催产后效应期到了的雌亲鱼一尾， 人工挤卵于干净无水的碗中， 取卵 50 毫 升， 添加0.5毫升已解冻10分钟的冻精， 混合均匀并搅拌1分钟后， 添加50毫升0.4 Nacl。
19、 溶液激活受精 ； 加水充气孵化， 可孵出鱼苗 3000 尾。 0039 参见说明书附图 1， 不同精卵比条件下鲜精和冻精的受精率对比， 人工授精时， 用 冻精授精， 精卵比为10000001时可以获得近似鲜精授精时精卵比2000001的受精率。 当鲜精精卵比大于 200000 1， 冻精精卵比大于 1000000 1 时， 受精率只有小幅度的提 高。 0040 当然， 本发明不限于上述及附图示出的实施例， 凡依本创造之精神所作的修改及 等效变换， 或在此基础上采用多种变形， 都属于本发明保护范围内。 说 明 书 CN 102077823 B 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102077823 B 6 。