《甲氨喋呤和ABC抑制剂在制备治疗银屑病药物中的用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《甲氨喋呤和ABC抑制剂在制备治疗银屑病药物中的用途.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101926996 B (45)授权公告日 2013.02.13 CN 101926996 B *CN101926996B* (21)申请号 201010253221.1 (22)申请日 2010.08.13 A61K 45/00(2006.01) A61K 31/519(2006.01) A61P 17/06(2006.01) (73)专利权人 中南大学 地址 410083 湖南省长沙市麓山南路 932 号 (72)发明人 陈翔 丁劲松 匡叶红 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 卢宏 CN 101378760 A,2009.。
2、03.04, Warren Richard B. 等 .genetic variation in efflux transporters influences outcome to mehtotrexate therapy in patients with psoriasis.JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY .2008, 第 128 卷 ( 第 8 期 ),1925-1929. (54) 发明名称 甲氨喋呤和 ABC 抑制剂在制备治疗银屑病药 物中的用途 (57) 摘要 本发明涉及联合甲氨喋呤、 ABC抑制剂在治疗 银屑病中的应用。更具体的， 在治疗银。
3、屑病时， 联 合甲氨喋呤、 ABC 抑制剂以局部外用的形式施用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 艾欣 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.甲氨喋呤和ABC抑制剂在制备治疗银屑病药物中的用途 ； 所述ABC抑制剂为MRP5抑 制剂和小分子酪氨酸酶抑制剂， 其中 MRP5 抑制剂选自他达那非、 西地那非、 扎普司特、 曲喹 辛和伐地那非 ； 小分子酪氨酸酶抑制剂选自伊马替尼、 尼罗替尼、 吉非替尼、 厄洛替尼、 拉帕 替尼、 达沙替尼、 舒。
4、尼替尼和 Bosutinib。 2. 按照权利要求 1 的用途， 其中所述的药物是局部外用的药物。 3. 按照权利要求 1 的用途， 其中 MRP5 抑制剂为扎普司特。 4. 按照权利要求 1 的用途， 其中所述小分子酪氨酸酶抑制剂为拉帕替尼。 5. 按照权利要求 1-4 之一的用途， 其中所述的制剂中甲氨蝶呤的浓度为 0.1%-10%wt/ wt， ABC 抑制剂的浓度为 0.05%-10%。 6. 按照权利要求 1-4 之一的用途， MTX 每次施用量为 5-15mg， ABC 抑制剂的施用量为 1-20mg。 权 利 要 求 书 CN 101926996 B 2 1/6 页 3 甲氨喋呤。
5、和 ABC 抑制剂在制备治疗银屑病药物中的用途 技术领域 0001 本发明涉及治疗银屑病药物的药用途径 ： 具体的， 本发明涉及联合应用甲氨喋呤、 ABC 抑制剂用于治疗银屑病的外用用途。 背景技术 0002 银屑病是一种多基因遗传背景下的免疫异常疾病， 因其具有发病率较高和主要累 及青壮年等特点而在皮肤科临床和科研领域倍受重视。角质形成细胞 (KC) 过度增生、 炎症 细胞浸润、 新生血管形成为其组织病理三要素， 尽管三者之间存在非常复杂的相互作用和 因果关系， 但一般认为， 真皮内聚集并活化的 T 淋巴细胞是银屑病皮损发生的始动因素， 活 化的 T 细胞可产生 TNF- 和 IL-2 等细。
6、胞 / 趋化因子， 从而导致表皮角质形成细胞增殖和 分化状态的异常并诱导中性粒细胞向表皮内趋化和聚集。另外， 银屑病皮损处的真皮乳头 层微血管扩张迂曲， 通透性增高， 血管数量增多。 血管的分布和形成的改变被认为是银屑病 中最先发生的病理改变， 血管内皮生长因子 (VEGF) 及血管细胞粘附分子 -1(VCAM-1) 等通 过刺激内皮细胞上的受体或其他方式， 使内皮细胞增生、 血管通透性增加。 在银屑病发生发 展过程中， 血管生成相关因子与炎症介质， KC， 炎症细胞等相互作用， 最终导致了银屑病主 要病理改变。目前银屑病的药物治疗手段较多， 药物包括维 A 酸类药物， 蒽林， 糖皮质激素 以。
7、及新型免疫抑制剂等， 但由于以上药物治疗手段各自不同的副作用和作用靶环节的相对 单一性， 其治疗效果及运用前景尚不能完全令人满意。 0003 甲氨蝶呤 (methotrexate， MTX) 是一种抗代谢药物， 常用于肿瘤的治疗， 可明显的 抑制细胞增殖。1971 年美国 FDA 批准甲氨蝶呤可用于银屑病， 是最早用于治疗银屑病的 细胞毒药物 (Steigleder GK.Ambulant treatment of psoriasis with methotrexate. Hautarzt.1971， 22(9) ： 419)。甲氨喋呤对于各型银屑病均有效， 其治疗银屑病的机理尚不 清楚， 过。
8、去认为甲氨喋呤通过对二氢叶酸还原酶的抑制而达到阻碍细胞 DNA 的合成， 使银 屑病过度增殖的表皮细胞受到抑制 (Weinstein GD， Goldfaden G， Frost P Methotrexate. Mechanism of actionon DNA synthesis in psoriasis.Arch Dermatol.1971， 104(3) ： 236-43)。但近几年研究发现， 银屑病患者体内异常增殖活化的淋巴细胞是甲氨喋呤治疗 银屑病的主要靶细胞。在每周低剂量甲氨喋呤治疗银屑病的体外试验中发现， 甲氨喋呤 明显抑制增殖的淋巴样细胞， 特别是激活的 T 淋巴细胞。甲氨喋呤。
9、药物浓度在 110-7 510-7mmol/L 时与淋巴样细胞接触 24 小时后， 淋巴样细胞被杀伤达 95以上。但即使甲 氨喋呤浓度在 10-5mmol/L 时， 正常人 KC 被杀伤低于 10， 其对甲氨喋呤毒性作用的耐受性 比淋巴样细胞高 1000 倍， 因此认为在体内增殖的被激活的淋巴样细胞是甲氨喋呤治疗银 屑病的主要靶细胞 (EW 3rd， McCullough JL， Pittelkow MR， McCormick A， Almanzor J， Liu G， Dang M， Voss K， Voss J， Schlotzhauer A， et al.Methotrexate the。
10、rapy of psoriasis ： differential sensitivity of proliferating lymphoid and epithelialcells to the cytotoxic and growth-inhibitory effects of methotrexate.Jeffes.J Invest Dermatol.1995， 104(2) ： 183-8)。 研究发现甲氨喋呤可以抑制T细胞分泌TNF-和IL-2等 说 明 书 CN 101926996 B 3 2/6 页 4 多种细胞 / 趋化因子而达到治疗作用。近年来， Yamasaki E 等发现小。
11、剂量的甲氨喋呤可有 效抑制血管细胞粘附分子 -1(VCAM-1) 的表达从而抑制血管新生 (Johnston A， Gudjonsson JE， Sigmundsdottir H.Ludviksson BR.Valdimarsson H.The anti-inflammatory action ofmethotrexate is not mediated by lymphocyte apoptosis， but by the suppression of activation andadhesion molecules.Clin Immunol.2005， 114(2) ： 154-63)， 。
12、掀起 MTX 在血管内皮细胞的作用和机制的研究热潮， 认为甲氨喋呤抑制银屑病皮损内血管新生是该 药物起效的又一个重要机制。甲氨喋呤在银屑病中的疗效肯定， 系统使用可以在短时间内 缓解病情， 但是甲氨喋呤的副作用较大， 一般认为与该药物进入体内后在肝肾组织的富集 和长期积累相关， 因此， 甲氨喋呤的系统应用在银屑病治疗中一般不做为首选。 探寻增加其 在靶细胞如角质形成细胞， T 细胞和血管内皮细胞中的浓度的联合制剂成为银屑病治疗的 新靶向。英国和加拿大相关专利 (GB19830016763 和 CA19870538541) 公开了甲氨蝶呤软膏 和外用制剂在治疗银屑病中的应用。日本专利 (JP19。
13、920214465) 公开了甲氨蝶呤衍生物在 治疗银屑病中的作用。 0004 甲氨喋呤在进入组织细胞后可以被 ABC(ATP-binding cassette) 转运蛋白超家 族成员泵出细胞外， 这在肿瘤细胞的化疗过程中极为常见， 甲氨喋呤的细胞外排机制直接 导致了肿瘤细胞对其不敏感 (Banerjee D， Mayer Kuckuk P， Capiaux G， Budak-Alpdogan T， GorlickR， Bertino J R.Novel aspects of resistance to drugs targeted to dihydrofolate reductase andt。
14、hymidilate synthase.Biochim Biophys Acta.2002， 1587(2-3) ： 164-173)。ABC 转运蛋白超家族是一组跨膜蛋白， 目前已知有 49 个成员， 分 为 7 个亚家族 ABCA-ABCG， 该家族在跨膜区组成通道， 转运许多结构不同的药物由通道穿 过细胞膜， 2 个 ATP 连接区位于细胞浆内面， 水解 ATP 完成底物转运。该家族成员在人体 绝大多数组织中都存在低表达， 但在皮肤组织和内皮细胞以及某些肿瘤细胞中过度表达。 其主要成员 ABCB、 ABCC( 又名多药耐药相关蛋白 ： multidrug resistance prote。
15、in， MRP)、 ABCG(又名乳腺癌耐药蛋白 ： breast cancerresistance protein， BCRP)亚家族与肿瘤多药 耐药相关， 参与介导广谱的化疗药物包括生物碱类， 抗癌抗生素， 烷化剂， 葡萄糖醛酸结合 物和一些新型的基因靶点药物外排。Masuda 和他的同事在 1997 年发现甲氨喋呤在 ABCC2 基因敲除鼠的胆汁排泄受阻， 提出 ABCC2 参与介导甲氨喋呤的细胞外转运过程 (Masuda H， I izuka M， Yamazaki Y， Nishigaki M， Kato R， Ni inuma Y， Suzuki K， Sugiyama Y.Met。
16、hotrexate is excreted into the bile by canalicular multispecific organic anion transporter in rats.Cancer Res.1997， 57 ： 3506-351)。 后续试验证实ABCC1-5一 起构成了能量依赖的甲氨喋呤转出系统， 在细胞对甲氨喋呤的耐药中起重要作用 (Zeng H， Chen ZS， Belinsky MG， Rea PA， Kruh GD.Transport of methotrexate(MTX)andfolates by multi-drug resistance pro。
17、tein(MRP)3 and MRP1 ： effect of poly-glutamylation onMTX transport.Cancer Res.2001， 61 ： 7225-7232)。Volk 等于 2000 年首次发现乳腺癌 耐米托嗯醌细胞株 MCF/MX 存在 ABCG2 的高表达， 这种耐药细胞株同时存在对甲氨喋呤的 交叉耐药， 认为 ABCG2 也参与介导甲氨喋呤的外排 (Volk EL， Rohde K， Rhee M， McGuire JJ， DoyleLA.Ross DD.Schneider E.Methotrexate cross-resistance in a。
18、 mitoxantron e-selectedmultidrug-resistant MCF7 breast cancer cell line is attributable to enhanced energy-dependentdrug efflux.Cancer Res.2000， 60 ： 3514-3521)。 陆续有研究 说 明 书 CN 101926996 B 4 3/6 页 5 证实运用 ABCG2 的抑制剂可有效阻断 HEK293/ABCG2 转染细胞膜泡的甲氨喋呤输送。从而 使人们对甲氨喋呤流出细胞途径有了新的认识。如何利用 ABC 转运泵抑制剂阻断甲氨喋呤 由细胞内外排将。
19、有效提高甲氨喋呤的治疗效果， 有良好的临床应用前景。有关甲氨蝶呤与 其他药物联用治疗银屑病， 美国专利 (US2000602949) 公开了白细胞介素 -10(Interleukin 10) 与甲氨蝶呤联用抑制 T 细胞增殖治疗银屑病。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一类治疗银屑病的外用药物。 0006 进一步地， 本发明的目的是提供一种新的用于治疗银屑病的药物组合物， 联合甲 氨喋呤及 ABC 抑制剂的外用药物。 0007 将甲氨蝶呤及 ABC 抑制剂合用用于治疗银屑病， 实验结果表明联合应用 ABC 抑制 剂与甲氨蝶呤与单用甲氨蝶呤相比， 可以抑制甲氨蝶呤从胞内排出， 增加其胞内浓。
20、度， 从而 增加其疗效。其中以 MRP5 的 Zaprinast 与 ABCG2 的 Lapatinib 与甲氨蝶呤组合最优。 0008 联合甲氨蝶呤及 ABC 抑制剂皮肤局部试用时， 所采用的制剂可以是本领域常规的 外用制剂， 包括软膏、 凝胶、 贴剂等。药物可以柔性纳米脂质体、 固体脂质纳米粒、 微乳等形 式存在于软膏、 凝胶、 贴剂基质中。 0009 将复方甲氨喋呤、 ABC抑制剂软膏局部试用时， MTX的浓度应当在0.1-10(wt/ wt)， ABC 抑制剂的浓度为 0.05 -10， MTX 每次施用量相当于 5-15mg， ABC 抑制剂的施用 量为 1-20mg。 0010 尽。
21、管专利 (US200060249、 CA19870538541、 JP199202214465) 公开了甲氨蝶呤及其 衍生物与其他药物(如白细胞介素-10)联用的各种外用制剂用于治疗银屑病， 未见甲氨蝶 呤与 ABC 抑制剂联用用于治疗银屑病的相关报道。本申请发明人多年致力于研究银屑病的 作用及机制研究， 有丰富的银屑病病理标本和成熟的银屑病移植鼠模型， 对肿瘤耐药及其 逆转机制也有一定的研究。联合应用甲氨蝶呤和 ABC 抑制剂用于治疗银屑病， 抑制甲氨蝶 呤的外排， 可以最大限度的发挥甲氨喋呤的治疗作用， 避免其导致的严重不良反应。 附图说明 0011 图 1 是各 MRP-5 抑制剂对 M。
22、RP-5 介导的 MTX 摄取抑制作用的比较。 实施例 0012 下面通过具体实施方案进一步说明本发明。 所述实施例仅用于说明或解释本发明 的实施方案， 而不能限制本发明的保护范围。 0013 实施例 1MRP-5 抑制剂对 MTX 外排抑制作用的研究 0014 本实验将 MRP-5 抑制剂与 MTX 合用研究 MRP-5 抑制剂阻断 MRP-5 介导的 MTX 的 膜泡输送。本实验用到的 MRP-5 抑制剂有丙磺舒、 MK571、 曲喹新、 西地那非、 扎普司特 (Zaprinast)、 吲哚美辛、 Sulfinpyrazone、 双嘧达莫、 培美曲塞、 5-FdUMP。 0015 ABC转。
23、运泵依赖ATP摄取MTX可以通过膜泡输送实验进行评价， 本实验需要的膜泡 可以从 MRP-5 转染的 HEK293 细胞中得到。 0016 膜泡是在低温条件下利用物理破碎细胞获得， 20g 膜泡与各抑制剂在冰上孵 说 明 书 CN 101926996 B 5 4/6 页 6 育 1h， 在含有 20mM MgCl2， 4mM ATP 或 4mM AMP-PNP， 磷酸肌酸和肌酸激酶 ATP 缓冲液系统 中。加入 100M3H-MTX 在 37孵育 10min。加入 3ml 终止液 (0.25M 蔗糖， 100mMNaCl 和 10mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐， PH7.5) 停止反应。洗涤， 。
24、膜泡内 3H-MTX 用液体闪烁计数 (Packard Instrument Company， Inc.) 进行测定。测得结果如下。 0017 本实验可以得出以下结论， MRP-5 抑制剂与 MTX 联合应用组与单独给予 MTX 对照 组相比， 膜泡摄取3H-MTX明显减少， 即MRP-5抑制剂对MRP-5介导的MTX的膜泡输送有抑 制作用。MRP-5 抑制剂中磷酸二酯酶 5 抑制剂 (PDE5inhibitor) 扎普司特 (Zaprinast) 的 抑制作用最强。 0018 实施例 2ABCG2 抑制剂对 MTX 外排抑制作用的研究 0019 实验将 ABCG2 抑制剂与 MTX 合用研究。
25、 ABCG2 抑制剂阻断 ABCG2 介导的 MTX 的膜泡 输送。 0020 ABCG2 抑制剂中酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs) 的抑制作用尤为突出， 本实验重点考察 酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs) 中 Nilotinib、 Lapatinib、 Erlotinib、 Sunitinib， 以 FTC 为阳性 对照。 0021 本实验中3H-MTX的膜泡输送实验用实施例1方法进行测定。 膜泡与各浓度的抑 制剂在冰上孵育 1h。加入 100M3H-MTX 在 37孵育 10min。加入 3ml 终止液 (0.25M 蔗 糖， 100mMNaCl 和 10mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐， PH7.。
26、5) 停止反应。洗涤， 膜泡内 3H-MTX 用液体闪烁计数 (Packard Instrument Company， Inc.) 进行测定。测得结果如下。 0022 酪氨酸激酶抑制剂 (TKIs) 阻断 ABCG2 介导的 MTX 的膜泡输送 0023 0024 本实验可以得出以下结论， ABCG2 抑制剂与 MTX 联合应用组和单独给予 MTX 对照 组相比， 膜泡的摄取明显减少， 即 ABCG2 抑制剂对对 ABCG2 介导的 MTX 的膜泡输送有抑制作 用。其中拉帕替尼 (Lapatinib) 抑制作用最强。 0025 实施例 3 甲氨蝶呤凝胶 0026 处方组成 0027 成分 用量。
27、 0028 甲氨蝶呤 500mg 0029 卡泊姆 1.0g 说 明 书 CN 101926996 B 6 5/6 页 7 0030 三乙醇胺 1.5g 0031 DMSO 2ml 0032 蒸馏水 加至 100g 0033 制备方法 0034 取卡泊姆用水浸泡， 使其充分溶胀， 加入甘油， 滴加三乙醇胺成透明凝胶。 MTX用适 量 DMSO 混匀后加至凝胶中， 加水至足量， 研匀。 0035 实施例 4 复方甲氨蝶呤、 拉帕替尼凝胶 0036 处方组成 0037 成分 用量 0038 甲氨蝶呤 500mg 0039 拉帕替尼 1.0mg 0040 卡泊姆 1.0g 0041 三乙醇胺 1.5。
28、g 0042 DMSO 2ml 0043 蒸馏水 加至 100g 0044 制备方法 0045 取卡泊姆用水浸泡， 使其充分溶胀， 加入甘油， 滴加三乙醇胺成透明凝胶。 MTX与拉 帕替尼用适量 DMSO 混匀后加至凝胶中， 加水至足量， 研匀。 0046 实施例 5 复方甲氨喋呤、 ABC 抑制剂凝胶治疗银屑病的动物模型实验 0047 取体重 20 30g 的 ICR 小鼠 36 只， 雌雄各半， 随机分为空白组、 MTX 组和复方 ABC 抑制剂与 MTX 组 3 组， 每组 12 只。各组每日涂抹小鼠尾部 2 次 (0.2g只 -1d-1)。连续用 药 14d 后处死小鼠， 取距尾根约 。
29、1.8cm 处的背部表皮， 进行常规组织切片， HE 染色。光镜下 观察， 凡两个毛囊口之间的鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞层者， 称为有颗粒层形成的鳞 片。计数每 100 个鳞片中有颗粒层的鳞片数， 比较各组数据。 0048 复方 MTX、 拉帕替尼凝胶对小鼠尾部鳞片表皮颗粒层形成的影响 0049 0050 注 ： 与空白组相比， *P 0.01 与 MTX 凝胶组相比， #P 0.05 0051 结果显示， 与空白凝胶基质对照组比较， MTX 凝胶组与复方 MTX、 拉帕替尼凝胶组 对鼠尾鳞片表皮颗粒层形成有明显的促进作用， 有颗粒层的鳞片数显著增多， 与空白对照 组相比(均为P0.01)其。
30、中以复方MTX、 拉帕替尼凝胶组作用最明显， 与MTX凝胶组， 两组 间有显著性差异 (P 0.05)。 0052 实施例 6 复方甲氨喋呤、 ABC 抑制剂凝胶治疗银屑病志愿者的效果 0053 病例选择 ： 72例寻常性斑块状银屑病(已做病理确诊)志愿者， 临床表现典型。 随 机分为 3 组。MTX 凝胶组 24 例， 年龄 22 58 岁， 平均 35.110.2 岁， 男 14 例， 女 10 例， 病 说 明 书 CN 101926996 B 7 6/6 页 8 程 5 个月 15 年 ； 复方 MTX、 拉帕替尼凝胶组 24 例， 年龄 18 56 岁， 平均 37.212.2 岁，。
31、 男 11 例， 女 13 例， 病程 5 个月至 15 年 ； 外用激素 ( 地塞米松软膏 ) 组 24 例， 年龄 20 54 岁， 平均 36.410.1 岁， 男 12 例， 女 12 例， 病程 5 个月至 15 年。三组的年龄、 性别、 病情、 病程差异无统计学意义 (P 0.05)。三组患者均无其他系统疾患。 0054 治疗方法 ： MTX 凝胶组采用 MTX 凝胶涂于局部皮损处， 一天两次， 复方 MTX、 拉帕替 尼凝胶组与外用激素组用同样的给药方法。连续给药 6 周。 0055 疗效判定标准 ： 临床痊愈或基本痊愈 ： 红斑、 鳞屑等皮损消退 90以上或完全 消退 ； 显效。
32、 ： 红斑、 鳞屑等皮损消退 60 ； 好转 ： 红斑、 鳞屑等皮损消退 30 ； 无 效 ： 红斑、 鳞屑等皮损消退 30。采用银屑病皮损面积 - 严重性指数 (PASI 评分 ) 对治 疗前后的银屑病患者进行评分， 分析其变化。 0056 结果 ： 0057 3 组斑块状银屑病患者治疗第 3 周和第 6 周的情况 0058 0059 注 ： 复方 MTX、 拉帕替尼凝胶组与 MTX 凝胶组相比 P 0.05 与地塞米松组相比 P 0.05 0060 结果显示， 复方 MTX、 拉帕替尼凝胶组第 3 周和第 6 周治愈率与总有效率均比地塞 米松组和 MTX 凝胶组大， 且第 6 周复方 MTX、 拉帕替尼凝胶组与 MTX 凝胶组相 P 0.05， 与 地塞米松组相比 P 0.05。 说 明 书 CN 101926996 B 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 101926996 B 9 。