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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410739914.X (22)申请日 2014.12.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104756863 A (43)申请公布日 2015.07.08 (73)专利权人 广西壮族自治区药用植物园 地址 530023 广西壮族自治区南宁市长岗 路189号 (72)发明人 张占江 缪剑华 赵以民 李翠 郭晓云 刘凡 吕惠珍 韦莹 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) 审查员 吴涛 (54)发明名称 一种华南半蒴苣苔的离体保存方法 。
2、(57)摘要 本发明公开了一种华南半蒴苣苔的离体保 存方法， 包括华南半蒴苣苔的组培快繁， 再利用 组培快繁得到的具有46片叶的试管苗， 接种到 保存培养基进行离体保存， 本发明保存培养基为 1/2MS+CCC1.1mg/l+AC0.45+蔗糖3+琼脂 0.45。 培养基温度为181， 光照强度1600 1800lx， 光照时间为810小时/天。 利用本发明 的方法可以使种质资源得到长期的保存， 并且得 到的种苗健壮、 成活率高， 可在短期内提供大量 华南半蒴苣苔的优质种苗， 有效解决了华南半蒴 苣苔种质资源保存及规模化育苗问题。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 104756863。
3、 B 2016.11.23 CN 104756863 B 1.一种华南半蒴苣苔的离体保存方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)外植体诱导培养： 取野外采集的华南半蒴苣苔的顶芽作为外植体， 在70乙醇中浸 泡3045s， 无菌水冲洗23次， 投入添加2吐温-20的0.1升汞4min， 再用无菌水冲洗2 3次， 再次投入添加2吐温-20的0.1升汞4min， 最后用无菌水冲洗23次后切割为0.5 1.0cm长接种在接种培养基上， 培养1014天， 顶芽分化形成嫩黄绿色丛生芽； 所述接种 培养基为： MS+6-BA1.5mg/l+NAA0.3mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖3+琼脂0.45；。
4、 所述接种培养 基的pH值为5.7， 培养温度为2428， 光照强度26002800lx， 光照时间为1012小时/ 天； (2)丛生芽壮苗生根培养： 经2535天， 丛生芽长至23cm， 转入壮苗生根培养基培养1 个月后， 长成具根和46片叶的试管苗； 所述的壮苗生根培养基为： 1/2MS+IAA0.8mg/l+ AC1.0+蔗糖3+琼脂0.45； 所述壮苗生根培养基的pH值为5.7， 温度为2225， 光照 强度16002000lx， 光照时间为1012小时/天； (3)试管苗离体保存： 将由丛生芽分化产生的具有46片叶的试管苗， 接种到保存培养 基进行离体保存， 所述的保存培养基为1/2。
5、MS+CCC1 .1mg/l+AC0.45+蔗糖3+琼脂 0.45； 所述保存培养基的pH值为5.9， 温度为181， 光照强度16001800lx， 光照时间 为810小时/天。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 104756863 B 2 一种华南半蒴苣苔的离体保存方法 技术领域 0001 本发明属于组织培养技术领域， 具体地， 涉及华南半蒴苣苔的离体保存方法。 背景技术 0002 华南半蒴苣苔是苦苣苔科半蒴苣苔属植物， 产于广东北部、 广西和贵州。 生于海拔 240-1500米林下阴湿石上或沟边石缝中， 生长环境恶劣， 华南半蒴苣苔全草可以药用， 治咳 嗽、 肺炎、 跌打损伤和骨。
6、折等， 具有较高的药用价值， 但是其存量少， 繁殖率低， 加上其种子 细小， 繁殖比较困难， 在引种栽培时较难成活， 给种质保存与利用带来较大的困难。 因此找 出一种种质资源保护的有效新途径， 对华南半蒴苣苔资源的修复和再生， 防止流失、 退化和 灭绝， 保障资源的可持续利用具有重要意义。 0003 目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题， 而组织培养为离 体种质保存提供了最便捷、 稳定的手段。 0004 组织培养的关键技术是培养基及其培养条件， 同一属不同种的植物其培养条件也 不尽相同， 因此， 对同一个属的不同种的植物组织培养条件的研究也十分必要。 0005 目前对于华南半。
7、蒴苣苔离体保存的研究还比较少， 授权公告号为CN 103141390B 的中国发明专利 “红苞半蒴苣苔的繁殖方法” 一文中公开了一种人工快速繁殖红苞半蒴苣 苔的方法， 为进一步保护和利用该物种奠定了良好的基础， 本文只是为保存该物种打下基 础， 并没有公开如何保存。 申请人在公开号为CN 104041412 A的中国发明专利 “一种贵州半 蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法” 中也公开了利用组织培养技术快速繁殖贵州半蒴苣苔的 方法， 但是同样也并没有公开贵州半蒴苣苔是如何进行保存的， 另外申请人还在公开号为 CN103651127A的中国发明专利 “一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法” 一文中公开了对弄。
8、岗 唇柱苣苔的离体保存时将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养 基上保存300d， 但是并没有公开此最佳保存培养基的具体配比， 而对于离体保存来说， 其保 存培养基的配比是其保存能否成功的一个重要条件， 因此， 对其保存培养基的研究和公开 具有十分重要的意义。 发明内容 0006 针对目前存在的问题， 本发明提供一种华南半蒴苣苔的离体保存方法， 利用组织 培养技术对其进行离体繁殖， 通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存， 不仅可以有 效挽救濒危的华南半蒴苣苔物种， 使之成为可再生资源， 还可以为华南半蒴苣苔种植提供 优良一致种苗的技术和室内离体保存提供技术支持。 0007。
9、 为了实现上述目的， 本发明提供了如下技术方案： 0008 一种华南半蒴苣苔的离体保存方法， 包括如下步骤： 0009 (1)外植体诱导培养： 取野外采集的华南半蒴苣苔的顶芽作为外植体， 在70乙醇 中浸泡3045s， 无菌水冲洗23次， 投入添加2吐温-20的0.1升汞4min， 再用无菌水冲 洗23次， 再次投入添加2吐温-20的0.1升汞4min， 最后用无菌水冲洗23次后切割为 说 明 书 1/5 页 3 CN 104756863 B 3 0.51.0cm长接种在接种培养基上， 培养1014天， 顶芽和侧芽分化形成嫩黄绿色丛生芽； 所述培养基的pH值为5.9， 培养温度为2428， 光。
10、照强度16002000lx， 光照时间为10 12小时/天； 0010 (2)丛生芽壮苗生根培养： 经2535天， 丛生芽长至23cm， 转入生根培养基培养1 个月后， 长成具根和46片叶的试管苗； 所述培养基的pH值为5.7， 温度为2225， 光照强 度26002800lx， 光照时间为1012小时/天； 0011 (3)试管苗离体保存： 将由丛生芽分化产生的具有46片叶的试管苗， 接种到保存 培养基进行离体保存， 所述的保存培养基为1/2MS+CCC1.1mg/l+AC0.45+蔗糖3+琼脂 0.45； 所述培养基的pH值为5.7， 温度为181， 光照强度16001800lx， 光照时。
11、间为8 10小时/天。 0012 前述华南半蒴苣苔的离体保存方法中， 步骤(1)中所述的接种培养基为： MS+6- BA1.5mg/l+NAA0.3mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖3+琼脂0.45。 0013 前述华南半蒴苣苔的离体保存方法中， 步骤(2)中所述的壮苗生根培养基为： 1/ 2MS+IAA0.8mg/l+AC1.0+蔗糖3+琼脂0.45。 0014 本发明的有益效果： 0015 本发明打破了对华南半蒴苣苔离体保存研究的空白， 利用本发明的方法可以使种 质资源得到长期的保存， 并且得到的种苗健壮、 成活率高， 可在短期内提供大量华南半蒴苣 苔的优质种苗， 有效解决了华南半蒴苣苔属。
12、种质资源保存及规模化育苗问题。 0016 本发明通过摸索一系列合理的培养基配方和培养条件， 实现了使华南半蒴苣苔有 效繁殖的目的， 另外， 对其保存培养进行了一系列的研究， 通过筛选合适的保存培养基达到 本发明的目的， 实现了华南半蒴苣苔的离体保存。 使华南半蒴苣苔的规模化工业生产成为 可能， 具有广泛的应用前景。 附图说明 0017 图1表示本发明光强对华南半蒴苣苔离体保存的影响。 0018 其中， 横坐标表示光照强度(lx)， 纵坐标表示保存天数(d)。 具体实施方式 0019 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0020 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特。
13、殊说明， 均可从商业途径得到。 0021 一种华南半蒴苣苔属离体保存方法， 通过以下方法实现： 0022 一、 华南半蒴苣苔经快速繁殖得培养物： 0023 1、 供试材料 0024 华南半蒴苣苔Hemiboea follicularis Clarke顶芽。 0025 2、 外植体的消毒处理 0026 将选择的顶芽， 在70乙醇中浸泡3045s， 无菌水冲洗23次， 投入添加2吐 温-20的0.1升汞4min， 再用无菌水冲洗23次， 再次投入添加2吐温-20的0.1升汞 4min， 最后用无菌水冲洗23次。 0027 3、 外植体诱导 说 明 书 2/5 页 4 CN 104756863 B 。
14、4 0028 将采集到的华南半蒴苣苔顶芽灭菌后切割为0.51.0cm长的小段， 接种在培养基 (MS+6-BA1.5mg/l+NAA0.3mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖3+琼脂0.45)上， 培养814天， 顶芽分 化形成丛生芽， 丛生芽可切割重复培养。 在此培养基上， 长成完整试管苗， 供移栽。 所述培养 基的pH值为5.9， 培养温度为2428， 光照强度16002000lx， 光照时间为1012小时/ 天； 0029 4、 丛生芽壮苗生根 0030 上一步骤中华南半蒴苣苔顶芽培养天16天左右， 可得到大量丛生芽(70以上)， 又经过2030天的培养可以得到高约23cm芽体， 转入壮苗。
15、生根培养基(壮苗生根培养基 为： 1/2MS+IAA0.8mg/l+AC1.0+蔗糖3+琼脂0.45)， 所述培养基的pH值为5.7， 温度为 2225， 光照强度26002800lx， 光照时间为1012小时/天； 培养1个月后加强光 (3000Lx及以上)， 培养一个月左右， 试管苗可达到移苗标准。 整个周期为23个月。 0031 5、 试管苗移栽 0032 当试管苗至少具有46片伸展叶， 根系正常， 健康， 高度为6cm左右时， 即可出瓶移 栽， 先要经室内炼苗， 出瓶时不能折伤叶片和根尖， 清除根系上的培养基， 分株种植， 种植基 质为石灰岩 珍珠岩 泥沙4 2 4， 基质需经过高温高。
16、压灭菌， 盖上透光率50的黑色遮阴 网以保持较低光强， 2天浇水1次以保持湿润。 栽后放在大棚内， 隐蔽度为70， 棚内温度控 制在2028， 注意保湿。 715天用1/8MS液， 喷施一次， 促进幼苗生长。 约20天试管苗长 出新根， 揭开遮阴网， 单株移栽入盆。 盆底垫小鹅卵石， 上覆盆土(河沙 草炭土2 3)。 试管 苗移栽不宜太深， 移栽的成活率可达96。 0033 二、 取上述所得华南半蒴苣苔试管苗进行离体保存 0034 选择上述具有46片叶华南半蒴苣苔试管苗为试验材料进行离体保存。 0035 下面对其进行培养基类型、 温度、 光强、 生长抑制剂的筛选， 保存天数均以试管苗 存活率为。
17、60进行统计。 0036 1、 培养基对华南半蒴苣苔离体保存的影响 0037 将试验材料接种到试验设计MS、 1/2MS、 1/4MS三种培养基上， 接种10瓶， 每瓶5株单 芽； 培养基中含有30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.9， 培养温度251， 光强 2000lx， 光照9h/d； 结果表明华南半蒴苣苔在1/2MS培养基上保存时间最长， 为299天， 具体 结果见表1。 0038 表1培养基对华南半蒴苣苔离体保存时间的影响 0039 0040 2、 温度对华南半蒴苣苔离体保存的影响 0041 将接入1/2MS培养基上的华南半蒴苣苔分别放置于温度15， 18， 21。
18、、 24的 光照培养箱培养， 接种10瓶， 每瓶5株单芽； 培养基中含有30g/L蔗糖和4.85g/L的琼脂， 培养 说 明 书 3/5 页 5 CN 104756863 B 5 基的pH值为5.9， 光强2000lx， 光照9h/d， 结果表明华南半蒴苣苔在温度为18的培养箱中 保存时间最长， 为301天； 具体见表3。 0042 表2温度对华南半蒴苣苔离体保存时间的影响 0043 0044 3、 光强对华南半蒴苣苔离体保存的影响 0045 将试验材料接种到1/2MS培养基上， 设计0、 1400lx， 1600lx、 1800lx、 2000lx五种光 照强度， 每种光强接种10瓶， 每瓶。
19、5株单芽； 培养基中含有30g/L蔗糖和4.5g/L的琼脂， 培养 基的pH值为5.9， 培养温度181， 光照9h/d； 结果表明， 华南半蒴苣苔在光强为1800lx左 右保存天数最长， 为329天， 具体比较结果见图1。 0046 4、 生长抑制剂对华南半蒴苣苔离体保存的影响 0047 将试验材料接种到添加不同浓度CCC、 PPP333的1/2MS培养基上， 接种10瓶， 每瓶5株 单芽； 培养基中含有30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂， 培养基的pH值为5.9， 培养温度181， 光照9h/d； 结果如表3， CCC浓度为1.1mg/l时保存时间最长， 为329天； 0048 表3激素。
20、对华南半蒴苣苔保存时间的影响 0049 0050 说 明 书 4/5 页 6 CN 104756863 B 6 0051 通过上述实验， 确定华南半蒴苣苔最佳离体保存培养基为1/2MS+CCC1.1mg/l+ AC0.45+蔗糖3+琼脂0.45； 培养基温度为181， 光照强度16001800lx， 光照时间 为810h/d， 保存天数为346天。 0052 5、 生长状况考察 0053 离体保存的华南半蒴苣苔试管苗的生长恢复情况考察： 将生长健壮的华南半蒴苣 苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后， 存活的半蒴苣苔试管苗接种到MS +6-BA1.5mg/l+NAA0.3mg/l。
21、+KT0.3mg/l， 添加AC0.1， 添加3的蔗糖和0.45的琼脂培养 基上， 每30d继代1次， 继代3次后， 以株高、 生长率、 繁殖倍数、 单株生根率为指标考察华南半 蒴苣苔试管苗的恢复情况， 见表4。 从对比中可以看出， 经过300d离体保存后的试管苗恢复 情况良好。 0054 表4离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较 0055 0056 本发明中所用的物质分别注释为6-BA(6-苄氨基嘌呤)， NAA(萘乙酸)， KT(激动 素)， IAA(吲哚乙酸)， AC(活性炭)， CCC(矮壮素)， PPP333(多效唑)。 说 明 书 5/5 页 7 CN 104756863 B 7 图1 说 明 书 附 图 1/1 页 8 CN 104756863 B 8 。