化合物ICG‑001在制备治疗高血压的药物中的用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610355411.1 (22)申请日 2014.06.13 (62)分案原申请数据 201410262364.7 2014.06.13 (71)申请人 南方医科大学南方医院 地址 510515 广东省广州市白云区广州大 道北1838号 (72)发明人 刘友华 周丽丽 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 刘宇峰 (51)Int.Cl. A61K 31/519(2006.01) A61P 9/12(2006.01) (54)发明名称 化合物IC。

2、G-001在制备治疗高血压的药物中 的用途 (57)摘要 本发明涉及小分子化合物ICG-001(一种 Wnt/-catenin信号通路拮抗剂)的新用途， 具 体涉及化合物ICG-001在制备治疗高血压的药物 中的用途。 本发明提供了ICG-001在治疗高血压 中的应用， 其疗效显著， 且未见明显毒副作用。 因 此， 本发明所述的ICG-001可制备成用于治疗高 血压的药物制剂。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 106038568 A 2016.10.26 CN 106038568 A 1.化合物ICG-001在制备治疗高血压的药物中的用途。 2.根据权利要求1所述的用途， 其特征在。

3、于， 所述的药物包括： 治疗上有效剂量的化合 物ICG-001， 以及药学上可接受的辅料。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106038568 A 2 化合物ICG-001在制备治疗高血压的药物中的用途 0001 本申请是申请号为201410262364.7、 申请日为2014年6月13日、 发明名称为 “化合 物ICG-001在制备治疗慢性肾脏病的药物中的用途” 的发明专利申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明涉及小分子化合物ICG-001(一种Wnt/ -catenin信号通路拮抗剂)的新用 途， 具体涉及化合物ICG-001在制备治疗高血压的药物中的用途。 背景技术 00。

4、03 慢性肾脏病(CKD)正成为一种 “公众健康问题” ， 严重危害人类健康并消耗大量卫 生资源。 然而， 目前临床上尚缺乏有效延缓CKD进展的药物。 针对CKD的发病机制， 寻找有效 地抑制或延缓CKD进展的药物无疑是当前肾脏病学界的当务之急， 成为亟待攻克的战略重 点之一。 高血压也是慢性肾脏病(CKD)最常见的病因， 是促进CKD进展到尿毒症的独立危险 因素。 大多数CKD患者伴随高血压。 0004 大量的研究表明， Wnt/ -catenin信号通路在多种CKD发生发展中占有重要地位(J Am SocNephrol,2009,20:1997-2008； J Am SocNephrol,。

5、2011,22:1642-1653)， -catenin 作为一种转录调节因子， 介导并促进纤维化的发生发展(J Am SocNephrol,2011,22:90- 103 ； J BiolChem ,2010 ,285:24665-24675 )。 ICG-001是一个小分子化合物 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2004,101:12682-12687)， 能够特异地阻断 -catenin下游靶基 因的转录， 从而抑制Wnt/ -catenin信号通路。 本发明涉及利用ICG-001作为一种新颖的、 有 效性的Wnt/ -catenin信号活化的拮抗剂， 阻断体内关键的促纤。

6、维化信号通路， 从而抑制 CKD进展过程中肾组织损伤和肾脏纤维化、 延缓或/和逆转CKD的病程。 0005 单侧输尿管结扎(UUO)、 阿霉素肾病(ADR)、 5/6肾切除(5/6NX)是经典的CKD动物模 型， UUO模型的特点是可以快速完整地展示梗阻侧肾小管间质纤维化的不同病理阶段和特 征 ， 包括炎细胞浸润、 小管细胞的 增殖和凋亡、 肌成纤维细胞的活化、 纤连蛋白 (Fibronectin)和I型胶原(Collagen I)的沉积； ADR肾病是目前常用的模拟人类肾小球疾 病的模型， 其特点是大量蛋白尿、 肾小管内管型、 肾小管塌陷、 进行性局灶节段硬化(FSGS) 和球性硬化、 严重。

7、肾间质纤维化和炎症形成； 5/6NX模型的特点是动脉高压、 蛋白尿、 肾小球 硬化， 该模型与临床CKD相似， 是研究CKD及并发高血压的理想模型。 0006 在病理上， 通常采用Masson染色， 来观察组织细胞外胶原蛋白沉积情况。 而更具体 的组织纤维化则常常应用肌成纤维细胞的标志蛋白平滑肌肌动蛋白 ( -SMA)、 纤连蛋白和 I型胶原的免疫染色和免疫印迹方法(Western blotting)来定性、 定量观察和评估。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供小分子化合物ICG-001(一种Wnt/ -catenin信号通路拮抗 剂)的新用途。 0008 本发明所述的用途是小分子化合物。

8、ICG-001在制备治疗高血压的药物中的用途， 说 明 书 1/5 页 3 CN 106038568 A 3 可以有效抑制和延缓慢性肾脏病(CKD)及并发高血压的进展。 0009 根据本发明所述的用途的进一步特征， 所制备的药物包括： 治疗上有效剂量的化 合物ICG-001， 以及药学上可接受的辅料。 0010 本发明的实验证明， 小分子化合物ICG-001在小鼠动物实验中无明显毒副作用。 发 明人对ICG-001进行UUO、 ADR肾病、 5/6NX模型实验。 结果表明： 与UUO、 ADR、 5/6NX模型组比 较， 腹腔注射ICG-001组肾脏间质胶原沉积显著减少， -SMA、 纤连蛋白。

9、及I型胶原均显著降 低， Wnt/ -catenin下游靶基因表达明显下调， 表明ICG-001能有效抑制UUO、 ADR肾脏和5/ 6NX肾脏组织纤维化， 拮抗Wnt/ -catenin信号通路； 并且， 在5/6NX模型中观察到ICG-001对 于血压的有效抑制作用， 提示抑制纤维化同时还具有抗高血压作用。 0011 综上所述， ICG-001具有显著抑制肾脏组织纤维化和降低高血压的作用， 且无明显 毒副作用， 因此可用于制备有效治疗高血压的药物。 附图说明 0012 图1是UUO模型各组小鼠肾脏Masson染色图。 该图中， 从左到右， 1： 假手术组 (Sham)； 2： UUO模型组。

10、(UUO+PBS)； 3： UUO+ICG-001 2mg/kg/d组； 4： UUO+ICG-001 5mg/kg/d 组。 0013 图2是检测UUO模型各组小鼠肾脏纤维化指标纤维连接蛋白(Fibronectin)与I型 胶原(Collagen I)的免疫染色图。 该图中， Sham： 假手术组； UUO： 模型对照组； UUO+ICG-001： 用药组。 0014 图3检测ADR模型各组小鼠肾脏PAS染色图。 该图中， 从左到右， 1： 生理盐水组； 2： ADR模型组； 3： ADR+ICG-001中期治疗组； 4： ADR+ICG-001晚期治疗组。 0015 图4检测ADR模型各组。

11、小鼠肾脏MASSON染色图。 该图中， 从左到右， 1： 生理盐水组； 2： ADR模型组； 3： ADR+ICG-001中期治疗组； 4： ADR+ICG-001晚期治疗组。 0016 图5是Western blotting法检测各组小鼠肾脏 -catenin及其下游靶基因蛋白水 平的代表图。 该图中， 左图为免疫印迹检测的代表性结果， 分为： 生理盐水组； ADR:ADR模型 组； ICG-w:ADR+ICG-001中期治疗组； ICG-t： ADR+ICG-001晚期治疗组； 右图为所有结果的统 计图， 分为： 生理盐水组； ADR:ADR模型组； ICG-w:ADR+ICG-001中期。

12、治疗组； ICG-t： ADR+ICG- 001晚期治疗组。 图中， Col I： I型胶原； Col III： III型胶原； -SMA： 平滑肌肌动蛋白。 0017 图6检测5/6NX模型各组大鼠肾脏MTS(Masson)和PAS染色图。 该图中， 左： 假手术 组； 中： 5/6NX模型组； 右： 5/6NX+ICG-001治疗组。 0018 图7是Western blotting法检测各组大鼠肾脏 -catenin的下游靶基因蛋白水平 的代表图。 该图中， 左图为免疫印迹检测的代表性结果， 右图为所有结果的统计图； 分为： 假 手术组； 5/6NX模型组； 5/6NX+ICG-001治。

13、疗组。 0019 图8是各组大鼠尿蛋白和血压检测图。 该图中， 左图为尿蛋白检测的结果， 右图为 血压的检测结果图； 分为： 假手术组； 5/6NX模型组； 5/6NX+ICG-001治疗组。 具体实施方式 0020 下面仅以实施例的方式结合附图对本发明做进一步的说明。 0021 实施例一： ICG-001对UUO小鼠肾脏纤维化的抑制 说 明 书 2/5 页 4 CN 106038568 A 4 0022 1、 实验动物： CD-1小鼠， 雄性， 体重20-22g， SPF级。 先将动物称重、 编号， 选择健康、 体重在20-22g的小鼠15只， 随机分为3组， 每组5只。 包括假手术组、 模。

14、型对照组及用药组。 0023 ICG-001购于上海佰世凯化学科技有限公司。 0024 2、 各组处理 0025 1)假手术组： 室温， 3戊巴比妥钠以1ml/公斤体重麻醉小鼠后， 选择左背侧肋缘 下1-2cm为切口； 局部消毒后， 逐层切开皮肤、 皮下、 肌层及腹膜， 发现左侧输尿管后随即逐 层缝合。 局部消毒后， 核实标记， 置于相应鼠笼。 0026 2)模型对照组： 同上麻醉、 消毒。 逐层切开皮肤、 皮下、 肌层及腹膜， 找到左侧输尿 管后， 于输尿管上1/3段结扎， 逐层缝合。 局部消毒后， 核实标记， 置于相应鼠笼。 0027 3)用药组： 同上麻醉、 消毒。 逐层切开皮肤、 皮下。

15、、 肌层及腹膜， 找到左侧输尿管后， 于输尿管上1/3段结扎， 逐层缝合。 局部消毒后， 核实标记， 置于相应鼠笼。 0028 3、 实验过程 0029 ICG-001用生理盐水稀释。 各组分笼饲养。 假手术组仅观察。 模型对照组仅给予生 理盐水腹腔注射。 用药组予以含有2mg/kg和5mg/kg体重的ICG-001的生理盐水腹腔注射。 饲 养7天后杀死各组小鼠， 均取左侧肾脏， 分别予以10中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组 织。 甲醛固定组织在经脱水、 包埋、 切片、 制片后， 分别予以Masson染色及 -SMA、 纤连蛋白及 I型胶原免疫染色。 冰冻组织匀浆后提取蛋白， 用免疫印迹法(We。

16、stern Blot)检测 - catenin及其靶基因表达水平。 0030 4、 实验结果 0031 (1)Masson染色检测肾脏组织纤维化程度 0032 I、 ICG-001减少UUO小鼠肾间质胶原沉积 0033 实验结果如图1所示， 用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。 0034 II、 ICG-001减少UUO小鼠肾间质纤维化 0035 实验结果如图2所示， 与模型对照组比较， 用药组小鼠肾间质纤连蛋白、 I型胶原水 平明显降低。 0036 实施例二： ICG-001对ADR小鼠肾脏纤维化的抑制 0037 1、 实验动物： BABL/c小鼠， 雄性， 体重20-22g， SP。

17、F级。 先将动物称重、 编号， 选择健 康、 体重在20-22g的小鼠24只， 随机分为4组， 每组6只。 包括生理盐水组、 模型对照组、 中期 治疗组、 晚期治疗组。 0038 ICG-001购于上海佰世凯化学科技有限公司。 0039 2、 各组处理 0040 1)生理盐水组： 室温， 尾静脉注射生理盐水2ml。 0041 2)模型对照组： 阿霉素溶解于生理盐水， 10mg/kg体重尾静脉一次注射。 0042 3)用药组： 于阿霉素注射后1周或3周注射含有5mg/kg体重的ICG-001的生理盐水 每日腹腔注射， 持续注射两周。 0043 3、 实验过程 0044 各组分笼饲养。 每周留取尿。

18、液标本并称量体重。 饲养5周后杀死各组小鼠， 均取左 侧肾脏， 分别予以10中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组织。 甲醛固定组织在经脱水、 包 埋、 切片、 制片后， 分别予以Masson染色及 -SMA、 纤连蛋白及I型胶原免疫染色。 冰冻组织匀 说 明 书 3/5 页 5 CN 106038568 A 5 浆后提取蛋白， 用免疫印迹法(Western Blot)检测 -catenin及其靶基因表达水平。 0045 4、 实验结果 0046 (1)Masson染色检测肾脏组织纤维化程度 0047 I、 ICG-001减轻ADR小鼠肾组织形态改变 0048 实验结果如图3所示， 用药组小鼠肾组织形。

19、态趋于正常， 未见大量肾小球硬化， 肾 小管管型及肾小管塌陷等病理改变。 0049 II、 ICG-001减少ADR小鼠肾间质胶原沉积 0050 实验结果如图4所示， 用药组小鼠肾间质胶原沉积明显低于模型对照组。 0051 III、 ICG-001减少ADR小鼠肾间质纤维化 0052 实验结果如图5所示， 与模型对照组比较， 用药组小鼠肾组织纤连蛋白、 I型胶原、 III型胶原和 -SMA水平明显降低。 0053 实施例三： ICG-001对5/6NX大鼠肾脏纤维化和高血压的抑制 0054 1、 实验动物： SD大鼠， 雄性， 体重200-220g， SPF级。 先将动物称重、 编号， 选择健。

20、康、 体重在200-220g的大鼠18只， 随机分为3组， 每组6只。 包括假手术组、 模型对照组及用药组。 0055 ICG-001购于上海佰世凯化学科技有限公司。 0056 2、 各组处理 0057 1)假手术组： 室温， 3戊巴比妥钠30mg/公斤体重麻醉大鼠后， 局部消毒后， 选择 左背侧肋缘下1-2cm为切口， 逐层切开皮肤、 皮下、 肌层及腹膜后即缝合， 核实标记， 置于相 应鼠笼。 0058 2)模型对照组： 同上麻醉、 消毒。 逐层切开皮肤、 皮下、 肌层及腹膜局部消毒后， 逐 层切开皮肤、 皮下、 肌层及腹膜， 发现左侧肾脏后切除上下极， 一周后(记0周)进行右侧肾脏 全切，。

21、 于第6周开始每日注射生理盐水。 局部消毒后， 核实标记， 置于相应鼠笼。 0059 3)用药组： 同上麻醉、 消毒。 逐层切开皮肤、 皮下、 肌层及腹膜， 发现左侧肾脏后切 除上下极， 一周后(记0周)进行右侧肾脏全切， 于第6周开始注射5mg/kg的ICG-001药物(每 周三次)。 局部消毒后， 核实标记， 置于相应鼠笼。 0060 3、 实验过程 0061 各组分笼饲养。 每周留取尿液标本并称量体重。 饲养12周后以大鼠尾动脉脉搏测 压法检测血压， 后杀死各组大鼠， 留取血液和尿液标本分别检测血清肌酐和尿蛋白； 均取左 侧肾脏， 分别予以10中性缓冲甲醛固定及液氮冷冰冻组织。 甲醛固定。

22、组织在经脱水、 包 埋、 切片、 制片后， 分别予以Masson、 PAS染色， 用免疫印迹法(Western Blot)检测 -catenin 其靶基因纤连蛋白及I型胶原表达水平。 0062 4、 实验结果 0063 (1)ICG-001减轻5/6NX大鼠肾间质纤维化和肾组织形态改变 0064 实验结果如图6所示， 用药组大鼠肾组织形态改变明显减轻， 未见明显肾间质纤维 化(Masson染色)， 肾小球硬化等改变(PAS染色)。 0065 (2)ICG-001抑制5/6NX大鼠的肾纤维化基因表达 0066 实验结果如图7所示， 与模型对照组比较， 用药组大鼠肾组织纤连蛋白和I型胶原 水平明显。

23、降低。 左图为纤连蛋白和I型胶原的免疫印迹代表性结果， 右图为所有结果的统计 图。 说 明 书 4/5 页 6 CN 106038568 A 6 0067 (3)ICG-001抑制5/6NX大鼠的尿蛋白和血压增高 0068 实验结果如图8所示， 与模型对照组比较， 用药组大鼠肾尿蛋白及血压明显降低。 0069 综上所述， ICG-001可以明显减少UUO、 ADR小鼠和5/6NX大鼠肾间质胶原蛋白沉积， 显著降低UUO、 ADR小鼠和5/6NX大鼠肾组织纤连蛋白、 I型胶原、 III型胶原、 -SMA表达水平， 并可以明显抑制CKD模型中的异常活化的 -catenin信号通路及血压增高。 因此， ICG-001可 以能成为有效抑制CKD进展、 抑制高血压的新药。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106038568 A 7 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/3 页 8 CN 106038568 A 8 图4 图5 图6 说 明 书 附 图 2/3 页 9 CN 106038568 A 9 图7 图8 说 明 书 附 图 3/3 页 10 CN 106038568 A 10 。