技术领域
本发明涉及的是板蓝根新的医药用途，具体来说板蓝根在制备防 治内毒素血症药物中的应用。
背景技术
细菌内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌生长时释放或死亡时裂解出 来的细胞壁脂多糖成分(lipopolysaccharide，LPS)，进入机体后与宿主 细胞相互作用表现出广泛的生物活性，是介导机体免疫和炎症反应的 关键致病因子。内毒素血症是由于内源性及外源性内毒素过量进入血 循环，激发机体免疫细胞大量释放多种细胞因子，破坏机体炎症反应 平衡，导致微循环障碍和组织损伤，进一步造成脓毒性休克、多脏器 功能衰竭等高危性疾病。
目前，研究发现内毒素血症并非仅存在于各种感染性疾病，包括 严重创伤、烧伤、休克、大手术和癌症放、化疗等都是内毒素血症的 主要诱因。因此，针对内毒素血症及其所致多脏器功能衰竭的抗内毒 素药物治疗方法是当今国内外学者研究的重大课题之一，但一直未见 突破性成果。西药方面，多粘菌素B的肾毒性太大；乳果糖、丽珠肠 乐及双歧三联活菌制剂等只适于减少肠道ET吸收；美国FDA批准 上市的单克隆抗体Centoxin在减少晚期脓毒性休克患者死亡率方面 十分有效，但治疗价格极其昂贵；现仍处于研究阶段的多粘菌素B 九肽等抗内毒素蛋白对内毒素性疾病治疗具有美好的前景，但因这类 抗体专一性太强、交叉保护作用差或对内毒素的亲和力不强，而且削 弱了机体抵抗力和免疫力，其远期有效性和安全性还有待进一步观察 和评价，临床尚未广泛推广应用，加之投入过高，现已将目标转向中 药、天然药物的开发研究，尤以清热解毒中药为主。
而板蓝根颗粒剂作为一种传统清热解毒的典型代表，其用量巨 大，患者口碑良好，堪称中成药之冠。目前，国内外学者对其原药材 进行了大量研究，表明其具有抗病原微生物(细菌、病毒等)、抗炎、 解热以及免疫调节等多重药理作用。根据传统中医理论，中医“毒” 的含义甚广，清热解毒中药所称之“毒”为火热壅盛所致的“热毒” 或“火毒”。传统清热解毒方药具有清泄热毒或火毒的作用，主要用 于温热病及热毒炽盛症。
发明内容
本发明的目的在于提供一种板蓝根的新用途，即板蓝根在制备防 治内毒素血症药物中的应用。
本发明采用如下技术方案：一种板蓝根在制备防治内毒素血症药 物中的应用。
本发明还提供了一种板蓝根颗粒在制备防治内毒素血症药物中 的应用。
由于板蓝根通常为栽培，而不同的栽培方式得到的板蓝根原药材 品质不同，因此，比较优选的是，上述的板蓝根是采用如下方法栽培 得到：
(1)选地与整地：选择三年或以上未种植过板蓝根的沙壤地， 深翻25～35厘米，每亩施用腐熟的堆肥或厩肥1500～2000千克，或 每亩施入腐植酸生物有机肥100～120千克，然后耙细、整平，做成畦。
(2)育苗：先将菘蓝种子用40℃～50℃质量浓度为2～4％的高 锰酸钾浸种11～13小时，捞出晒干后拌细沙或草木灰撒播，撒播后 覆盖3～5cm的土。
(3)田间管理：在苗高6～10cm时进行间苗和补苗，同时进行 中耕除草，封行后禁止除草；干旱及时浇水，雨季应注意清沟排水， 防止畦间积水烂根和感染病害；生长过程中施药防治病虫害；生长期 追施有机肥1～3次。
(4)、采收与加工：
在菘蓝种植当年的11月份采收大青叶，在采收大青叶后7～14 天挖根，去净芦头和泥土，进行晒干。
实验表明，板蓝根具有广泛的体内外抗内毒素活性作用——它能 够直接中和、降解内毒素，可降低内毒素的总量，在体内可显著拮抗 内毒素导致的DIC生物效应，降低重要器官组织的血栓形成率。同 时，在对板蓝根颗粒剂作用机制研究方面，结果表明其可以抑制内毒 素刺激小鼠各重要组织膜结构伸展刺突蛋白(moesin)mRNA的表达， 减轻内毒素诱导鼠体p38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)活性升高 的程度。因此，相对于直接抗病原体、抗炎作用，板蓝根抗内毒素活 性才是其清热解毒的重要途径。
具体实施方式
下面结合具体实验例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明 的内容。
在下面实验中，所用板蓝根颗粒按药典2005版第一部记载的方 法制备，其中板蓝根颗粒剂A批所用的广州白云山和记黄埔中药有 限公司GAP药材产品，是指按下述方法栽培得到的板蓝根原生药材：
(1)选地与整地：选择三年或以上未种植过板蓝根的沙壤地， 深翻25～35厘米，每亩施用腐熟的堆肥或厩肥1500～2000千克，或 每亩施入腐植酸生物有机肥100～120千克，然后耙细、整平，做成畦。
(2)育苗：先将菘蓝种子用40℃～50℃质量浓度为2～4％的高 锰酸钾浸种11～13小时，捞出晒干后拌细沙或草木灰撒播，撒播后 覆盖3～5cm的土。
(3)田间管理：在苗高6～10cm时进行间苗和补苗，同时进行 中耕除草，封行后禁止除草；干旱及时浇水，雨季应注意清沟排水， 防止畦间积水烂根和感染病害；生长过程中施药防治病虫害；生长期 追施有机肥1～3次。
(4)、采收与加工：
在菘蓝种植当年的11月份采收大青叶，在采收大青叶后7～14 天挖根，去净芦头和泥土，进行晒干。
板蓝根颗粒剂B批为广州白云山和记黄埔中药有限公司提供的 非GAP药材产品，是按照一般的栽培方法生产的原生药材，按常规 板蓝根颗粒剂生产工艺制备。其栽培方法与GAP栽培方法主要体现 在非GAP方法未用高锰酸钾浸种，且菘蓝根是与大青叶同时采收。
为了更好地理解本发明技术，以下采用板蓝根颗粒剂的抗内毒素 活性评价实验，说明其在制药领域中的新用途。
(一)板蓝根颗粒剂的体外抗内毒素活性评价
1.材料与仪器
1.1药物
板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号 20060415，为GAP药品)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏 水中，必要时过滤残渣，依次配制成浓度为1、0.5、0.25g·mL-1的水 溶液，热压灭菌后贮存于4℃冰箱中备用。
1.2试剂
细菌内毒素工作标准品(20EU/支，中国药品生物制品检定所， 批号：010203)；
动态比浊法鲎试剂(KTA鲎试剂，灵敏度0.06EU·mL-1，厦门鲎 试剂厂，批号：001123)；
细菌内毒素检查用水(BET水，5mL/支，湛江安度斯生物有限 公司，批号：001222)；
稀释液(II)(4mL/支，湛江安度斯生物有限公司，批号： 010430)；
Tris缓冲液(pH 7.2，500mL/瓶，批号：001112)；
小牛血清(10mL/瓶，批号：010210)；
脂多糖(LPS，5mg/支，69H4022)，以上产品均购于美国Sigma 公司，其余试剂均为分析纯。
1.3仪器
EDS-98细菌内毒素测定仪(北京金山川科技发展有限公司)； RE-10E-100型旋转蒸发仪(日本SIBATA公司)；XW-80A型旋涡混 合器(上海医科大学仪器厂)；硼硅酸盐反应试管(湛江安度斯生物有 限公司)；H-600型透射电镜(日本日立公司)；可调微量移液管； CS10C型电热恒温干燥箱。
2.方法与结果
2.1动态浊度法测定板蓝根颗粒剂的体外抗内毒素作用
2.1.1标准曲线的绘制
以内毒素浓度(C)的对数值为横坐标，临界时间(Ta)均值的对 数为纵坐标，作标准曲线，回归分析得方程：logTa＝2.7116-0.3048logC， r＝-0.9986。结果表明，内毒素浓度在0.1～10.0EU·mL-1范围内其对 数值与临界时间对数呈线性关系。
2.1.2板蓝根颗粒剂抗内毒素作用的定量测定
分别取供试药液各0.1mL，并以不含板蓝根的空白颗粒剂的无菌 水溶液为对照，均采用稀释液(II)作40倍稀释；取稀释后各组溶 液0.4mL，加入0.1mL内毒素标准溶液(20EU·mL-1)于37℃下孵 育1h，使药液与内毒素充分作用；吸取孵育后的混合液0.1mL于反 应试管中，加入0.1mL KTA鲎试剂，迅速插入内毒素仪检测孔内测 定临界时间，每组供试品平行作6管，将药物组与空白对照组作t检 验比较，并以临界时间均值参照标准曲线计算内毒素经作用后的浓度 及相应的降解率，结果见表1。
表1经板蓝根颗粒剂作用后的内毒素含量测定结果(n＝6)
组别 临界时间均值 (s) 孵育后内毒素浓度 (EU·mL-1) 内毒素 降解率 板蓝根颗粒剂0.25g·mL-1 板蓝根颗粒剂0.50g·mL-1 板蓝根颗粒剂1.00g·mL-1 空白对照 549±74* 592±61** 679±49** 429±62 0.80 0.63 0.41 1.80 55％ 67％ 77％ ---
注：与空白对照组比较 *P＜0.05，**P＜0.01
结果表明，与空白对照组比较，内毒素经不同剂量板蓝根颗粒剂 供试药液孵育作用后有了不同程度的中和降解，其中板蓝根颗粒剂高 剂量组对于内毒素的降解率最大，与空白对照组比较具有显著性差异 (P＜0.05)，显示其体外直接抗内毒素作用活性最强；并且抗内毒素 活性与药物剂量之间呈剂量依赖性。
(二)板蓝根颗粒剂的体内抗内毒素活性评价
1.材料与仪器
1.1药物 板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，为GAP 药品，批号20060415)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水 中，依次配制成浓度为2、1、0.5g·mL-1的水溶液，热压灭菌后贮存 于4℃冰箱中备用。
1.2动物 KM小鼠，雄性，体重18～22g；日本大耳白兔，雌雄各 半，体重2～2.5kg，以上由华中科技大学同济医学院实验动物中心 提供。
1.3试剂 放线菌素D(ACTD，0.2mg/支，上海新亚药业有限公司， 000402)；D-氨基半乳糖[D(+)-galactosamine，D-GalN，Sigma公司， 023K0703]；脂多糖(LPS，5mg/支，Sigma公司，69H4022)；阿司 匹林肠溶片：河北神威药业有限公司，批号0504121；其余试剂均为 分析纯。
1.4仪器 RE-10E-100型旋转蒸发仪(日本SIBATA公司)；CS10C 型电热恒温干燥箱。
2.方法与结果
2.1对放线菌素D敏化小鼠内毒素致死攻击的影响
昆明小鼠60只，按表2随机分成5组，每组12只。药物组按10 g·mL-1ig给药，2h后重复一次；空白对照组给予相同体积的板蓝根 颗粒剂阴性对照溶液；阳性对照组按10mg·kg-1剂量给予地塞米松； 1h后按2mg·kg-1剂量腹腔注射ACTD致敏；2h后按1mg·kg-1剂量 尾静脉注射LPS，3d内观察动物死亡情况，计算动物死亡率，计算 死亡率，并与空白对照组比较，作χ2检验。结果见表2。
表2板蓝根颗粒剂对放线菌素D敏化小鼠内毒素致死攻击的影响
组别 动物数(只) 动物死亡数(只) 死亡率 空白对照组 板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1 板蓝根颗粒剂1.0g·mL-1 板蓝根颗粒剂0.5g·mL-1 地塞米松 12 12 12 12 12 11 4 7 8 4 92％ 33％* 58％ 67％ 33％*
注：与生理盐水组比较 *P＜0.05
结果表明，板蓝根颗粒剂高剂量组和地塞米松(传统糖皮质激素 药)的抗内毒素活性相对于生理盐水组具有显著性差异(P＜0.05)。 其能够显著降低ACTD敏化小鼠的死亡率，并延长其生存时间，使 之免受内毒素的致死攻击；结果表明板蓝根颗粒剂在动物体内也具有 拮抗内毒素生物效应的活性，其不同剂量呈量效正相关性。
2.2对D-氨基半乳糖敏化小鼠内毒素致死攻击的影响
昆明种小鼠60只，按表3随机分成5组，每组12只。药物组按 10g·mL-1ig给药，2h后重复一次；空白对照组给予相同体积的板蓝 根颗粒剂阴性对照溶液；阳性对照组按10mg·kg-1剂量ig给予地塞米 松；给药1h后按600mg·kg-1剂量ip D-GalN致敏；2h后按0.5mg·kg-1剂量ip LPS，3d内观察动物死亡情况，计算动物死亡率，并与空白 对照组比较，作χ2检验。结果见表3。
表3对D-氨基半乳糖敏化小鼠内毒素致死攻击的影响
组别 动物数/只 动物死亡数/只 死亡率 P值 空白对照组 板蓝根颗粒剂2.0 g·mL-1 板蓝根颗粒剂1.0 g·mL-1 板蓝根颗粒剂0.5 g·mL-1 地塞米松 12 12 12 12 12 10 4 7 5 3 83％ 33％ 58％ 42％ 25％ P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05
结果表明，相对于生理盐水组，板蓝根颗粒剂高、低剂量组能够 显著降低D-GalN敏化小鼠的死亡率，有效地保护小鼠免受内毒素的 致死攻击；结果表明板蓝根颗粒剂在动物体内也具有拮抗内毒素毒害 生物效应的活性，但其活性与作用强度不呈显著依赖性。
2.3板蓝根颗粒剂对内毒素诱导家兔发热的抑制作用
选择健康家兔，每日测肛温2次，连续3d，使其逐步适应；体 温范围应在38.0～39.6℃内，且体温波动不超过0.3℃。根据动物体 温预测定结果，筛选出体温合格家兔54只，随机分成9组，每组6 只。板蓝根颗粒剂(A批为广州白云山和记黄埔中药有限公司GAP 药材产品，B批为广州白云山和记黄埔中药有限公司提供的非GAP 药材产品、C批为非广州白云山和记黄埔中药有限公司产品)高、中、 低剂量组分别按6.0、3.0、1.5g·kg-1灌胃给予药物，模型组给予同体 积蒸馏水，阳性对照组以200mg·kg-1灌服阿司匹林。除阳性对照组 外，其余各组每日给药1次，连续5d。末次给药后1.5h，测定家兔 基础体温，共3次，取其均值。1h后，耳缘静脉注射LPS 200ng·kg-1， 于内毒素攻击后0.5、1、2、3、6h测定家兔体温，观察其变化情况， 并与基础体温相比较，计算出最大温差(AT)、时间体温反应指数 (TRI4，以梯形法求得温度时间曲线下面积)，以TRI4为依据计算发 热抑制百分率。将药物组与模型组进行t检验比较，结果见表4。
表4对内毒素诱导家兔发热效应的影响
组别 剂量 (g/kg) 动物数 ΔT(℃) TRI4 抑制率 模型组 阿司匹林组 板蓝根A高剂量 板蓝根A中剂量 板蓝根A低剂量 板蓝根B高剂量 板蓝根B中剂量 板蓝根B低剂量 板蓝根C中剂量 0.2 6.0 3.0 1.5 6.0 3.0 1.5 3.0 6 6 6 6 6 6 6 6 6 1.14±0.30 1.07±0.36 1.02±0.33 1.06±0.42 0.87±0.34 1.05±0.23 1.13±0.47 1.28±0.27 1.05±0.39 3.67±1.20 2.51±1.44 1.06±0.84** 2.55±1.42 1.88±1.57* 2.85±1.56 3.39±1.12 4.21±0.93 3.12±1.05 / 31.64％ 71.06％ 30.58％ 48.90％ 22.31％ 7.65％ -14.72％ 15.06％
注：与模型组比较 *P＜0.05 **P＜0.01
由表4结果，与模型组比较，板蓝根颗粒剂A批高、低剂量组 能够显著抑制时间体温反应指数TRI4的急剧升高，降低内毒素致热 效应的程度(P＜0.05或P＜0.01)。但是，各组对最大温差AT的降低程 度与模型组比较未见显著性差异，表明其对内毒素诱导的家兔发热效 应的强度无显著性影响。从发热抑制率而言，板蓝根颗粒剂B批呈现 剂量依赖性抑制内毒素发热效应，而板蓝根颗粒剂A批无显著相关 性，抑制活性强度为板蓝根颗粒剂A批＞板蓝根颗粒剂C批＞板蓝根 颗粒剂B批。
结论：(1)板蓝根颗粒剂A批能够显著抑制内毒素诱导的家兔发 热效应，其活性强度相对较高；(2)板蓝根颗粒剂对于内毒素诱导家 兔发热效应的程度(TRI4)具有一定拮抗效应，但对于其发热强度 (ΔT)控制能力稍弱；(3)从抗内毒素效应分析，白云山板蓝根不同 批次产品间存在一定差异，但其优质产品(板蓝根颗粒剂A批)效 应强度显著高于市场同类产品，说明不同栽培方法得到的板蓝根原生 药及由其制备的颗粒剂抗内毒素效应强度存在差异。
2.4板蓝根颗粒剂对内毒素性DIC家兔肾小球微血栓形成的影响
健康家兔50只，按表5随机分为5组。药物组按10g·mL-1ig给 药，每天2次，连续灌服5d。模型组灌服相同体积板蓝根颗粒剂阴 性对照溶液。阳性对照组按10mg·kg-1剂量给予地塞米松，于实验第 3d开始给药，连续3d，每天2次。第4d除正常对照组外，各组动物 均间隔24h静脉注射内毒素两次，剂量分别为15μg·kg-1、35μg·kg-1， 复制DIC模型。第二次注射内毒素后12h，处死动物，取右肾固定 于100mL·L-1福尔马林溶液中。将固定好的肾组织切片，作Mallary 纤维素染色，行光镜检查，按Latour氏法，每只动物观察50个肾小 球，统计含微血栓肾小球数；同时将每个肾小球分为8个象限，计算 含微血栓密度。计算结果用t检验处理，结果见表5。
表5对内毒素性DIC家兔肾小球微血栓形成的影响
组别 DIC 发生率 含微血栓肾小球 的形成百分率 肾小球含微 血栓的密度 模型组 板蓝根颗粒剂0.5g·mL-1 板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1 地塞米松 正常对照组 80.0％ 60.0％ 50.0％ 25.0％ 0％ 75.8±7.8 66.9±5.1* 63.9±9.1* 42.2±6.5** 0 71.4±15.6 67±11.5 67.5±14.3 48±6.2 0
注：与模型组比较 *P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，板蓝根颗粒剂能有效降低内毒素性DIC家兔肾小球 微血栓形成百分率，与模型组比较具有统计学差异，且具有一定量效 依赖性，但其效果尚不如阳性对照药地塞米松，故对于所形成肾小球 微血栓的密度无实质性改变。
(三)板蓝根颗粒剂抗内毒素活性部位的作用机制研究
1.材料和仪器
1.1药材 板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，为 GAP药品，批号20060415)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸 馏水中，依次配制成浓度为2、1、0.5g·mL-1的水溶液，封存于安瓿 中，流通蒸汽灭菌0.5h，作为供试品溶液。
1.2试剂 脂多糖(LPS，E.Coli O26B6，5mg/支，批号69H4022，Sigma 公司)；卡介苗(BCG，50mg/支，上海生物制品研究所，批号990901， 使用前用注射用水稀释成5mL)；moesin mRNA原位杂交试剂盒(武 汉博士德生物公司)，多聚甲醛(天津科密欧化学试剂有限公司)。小 牛血清(上海浦东开发区兽医站)；γ-32P-ATP(Dupont公司)；P38 丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)多克隆抗体(Sigma公司)；髓磷 脂碱性蛋白(MBP，Sigma公司)；其他试剂为分析纯。
1.3动物：KM小鼠18～20g，♀♂各半，由华中科技大学同济医学 院实验动物中心提供。BALB/C小鼠，♀，14-19g，由华中科技大学 同济医学院器官移植研究所提供。
1.4仪器：MK3型酶联免疫检测仪(Labsystern Dragon公司)；1815TC 型CO2培养箱(Shel-Lab公司)；液体闪烁仪(Labsystern Dragon公司)
2.方法与结果
2.1板蓝根颗粒剂对内毒素刺激鼠组织moesin mRNA表达的影响
2.1.1组织标本制备
18只小鼠，♀♂各半，随机分为3组，每组6只。实验前一周 以100mg/kg剂量腹腔注射卡介苗，实验前12h禁食不禁水，药物组 分别按5g/kg剂量ig给予板蓝根颗粒供试品溶液，正常组和模型组给 予等体积的生理氯化钠溶液。30min后，药物组、模型组的小鼠均按 40μg/kg剂量尾静脉注射内毒素，9h后乙醚麻醉，处死后取其肝、脾、 肾组织，立即用4％多聚甲醛固定，备用。按常规操作，作moesin mRNA原位杂交，用苏木素复染，充分水洗。以酒精脱水，二甲苯透 明，封片。镜下观察胞浆着色呈棕黄色者为阳性。
2.1.2统计学分析
图像分析采用北航医学图像处理系统给予原位杂交显色强度计 分。计量资料用t检验，计数资料用χ2检验，结果见表6。
表6对内毒素刺激小鼠肝、脾、肾内moesin mRNA表达的影响
组别 肝 肾 脾 平均值(分) 抑制率(％) 正常组 模型组 药物组 18.5±0.5 128.2±10.1 25.1±22.7* 9.7±3.3 123.9±25.4 23.8±10.0* 5.4±0.7 88.5±12.1 16.4±10.2* 11.3±4.0 113.6±30.4 22.4±12.4* 91.6
注：与模型组相比，*P＜0.05
结果表明，与内毒素模型组比较，5g/kg剂量的板蓝根颗粒剂可 抑制LPS刺激小鼠各重要组织的moesin mRNA表达，具有统计学差 异，且对于不同组织的抑制程度有所差异。
2.2板蓝根颗粒剂对内毒素诱导P38MAPK活性的影响
(1)单核细胞液的制备
取卡介苗粉针(BCG50mg)，加入无菌生理盐水5mL溶解，使 之浓度为10mg/mL，按100mg/kg剂量腹腔注射卡介苗，饲养7d后， 将30只经BCG敏化的BALB/C小鼠，随机分为5组，每组6只，用 乙醚麻醉后，取出腹腔液，1500rpm离心，弃去上清，用Hank’s液 充分洗涤3次，每次5min，弃去上清液，用DMEM细胞培养液调单 核细胞浓度为5×106个/mL，转移至60孔培养板中，每份样品平行作 2孔，各孔中体积相同，于CO2培养箱中培养2h。向培养板40个单 核细胞液孔中分别加入不同浓度板蓝根颗粒剂供试品溶液作为药物 组，每组10孔，使其终浓度依次为20、10、5、2.5mg/mL，于CO2培养箱培养0.5h后，各孔分别加入等体积浓度为100μg/mL LPS溶液， 使其终浓度为100μg/mL；阳性对照组的10孔中直接加入LPS液，使 其终浓度同样为100μg/mL；阴性对照组10孔中直接加入板蓝根颗粒 剂供试品溶液，使其终浓度为20mg/mL。各组同时于CO2培养箱中 培养6h。培养后的单核细胞用磷酸盐缓冲液洗涤后进行P38MAPK 活性测定。P38MAPK活性以每分钟每毫克蛋白掺入32P的pmol数 (pmol·mg-1·min-1)表示，结果见表7。
表7对LPS诱导P38MAPK活性的抑制作用
组别 药液浓度 (mg/mL) LPS终浓度 (μg·mL-)) P38MAPK活性 (pmol·mg-1·min-1 ) 抑制率 (％) 药 物 组 阳性对照组 阴性对照组 20.0 10.0 5.0 2.5 / 20.0 100 100 100 100 100 / 2291.7±337.7** 3229.7±409.2** 4025.4±374.1* 4580.8±544.6* 5345.6±388.9 2169.1±311.1 95.77 64.79 39.60 20.55 / /
注：经t检验，与阳性组比*P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，阳性对照组即内毒素可显著诱导单核细胞P38丝裂原 活化蛋白激酶(P38MAPK)活性增加，而经不同浓度的板蓝根颗粒 剂供试品溶液预处理后的单核细胞，经内毒素诱导作用后，其 P38MAPK活性虽然相对阴性对照组有所增加，但与阳性对照组比较， 其活性降低程度具有显著性差异，并且P38MAPK活性的降低与板蓝 根颗粒剂供试药液浓度呈一定的依赖性。
(四)针对炎性细胞因子、氧自由基等设计的药效学试验
1.材料和仪器
1.1药材 板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号 20060415，为GAP药品)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏 水中，配制成浓度为0.5g·mL-1的水溶液，封存于安瓿中，流通蒸汽 灭菌0.5h，作为供试品溶液，备用。
1.2细胞及动物 HL-60细胞株，由华中科技大学同济医学院分子生 物学开放实验室提供。KM小鼠18～20g，♀♂各半，由华中科技大 学同济医学院实验动物中心提供，合格证编号为(鄂)医动字第19 -024号。
1.3试剂 脂多糖(LPS，5mg/支，Sigma公司，批号：111K4078)； 新生小牛血清(NBS，华美生物工程公司，批号：030306)；噻唑蓝 (MTT，Duchefa公司，批号：021208A)；RPMI-1640细胞培养液 (Gibco公司，批号：021217)；TNF-α试剂盒(北京邦定泰克生物有 限公司)；IL-8试剂盒(Sigma公司，批号：022101-A)。卡介苗(BCG， 50mg/支，上海生物制品研究所，批号990901，使用前用注射用水稀 释成5mL)；N-1萘乙二胺盐酸盐(分析纯，天津化学试剂研究所)； NaNO2(西德，湖北大学化工厂分装)；对氨基苯磺胺(分析纯，北京芳 草医药化工研究公司)。
1.4仪器 Model 450酶标仪(Bio-Rad公司)；MCO-17AC型CO2培 养箱(三洋公司)；XW-80型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)； UV-265FW型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；LD4-2A型医用 离心机(北京医用离心机厂)；MK3型酶联免疫检测仪(Labsystern Dragon公司)；1815TC型CO2培养箱(Shel-Lab公司)；SF-542型低 温冰箱(德国西门子公司)。
2.方法与结果
2.1板蓝根颗粒剂对于炎性细胞因子的影响
2.1.1对内毒素致HL-60细胞释放TNF-α和IL-8的影响
取2×105cell·mL-1浓度的HL-60细胞溶液，1μg·mL-1浓度的LPS 溶液和8.00mg·mL-1浓度供试药液，按以下三种方式进行处理：①供 试液与LPS同时处理组(C组)：药液和LPS同时加入细胞溶液中； ②LPS预刺激组(D组)：LPS处理HL-60细胞1h后加入药液；③供 试液预刺激组(E组)：药液与细胞共育1h后加入LPS。另设只含细 胞溶液的空白对照组(A组)和仅用LPS处理的LPS刺激组(B组)， 每组设4个复孔。37℃5％CO2温育24h后收集上清，ELISA法检测 TNF-α、IL-8浓度，各药物组测定结果与细胞对照组作t检验比较， 结果见表8。
表8三种给药方式对LPS刺激HL-60细胞产生TNF-α、IL-8的影 响
组别 TNF-α浓度 pg·mL-1 抑制率 ％ IL-8浓度 pg·mL-1 抑制率 ％ A组 B组 C组 D组 E组 14.85±2.03 181.10±32.62 27.17±4.87** 78.29±13.44** 86.36±8.25** / / 85.00 56.77 52.31 46.91±5.62 213.50±31.18 70.05±9.33** 113.43±18.41** 130.03±22.75** / / 67.19 46.78 38.98
注：与B组比较 *P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：在三种情况下，板蓝根颗粒剂供试溶液均能显著抑制 LPS诱导HL-60细胞过度释放TNF-α、IL-8。其中，供试药液与LPS 同时处理(C组，共同作用)时，对HL-60细胞分泌TNF-α、IL-8 的抑制作用最强。
2.1.2对内毒素致小鼠血清中TNF-α和NO释放的影响
取30只小鼠，按100mg/kg剂量ip卡介苗0.2mL，按常规饲养 10d。实验前12h禁食不禁水，将小鼠随机分为3组，每组10只。 药物组分别按5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg剂量ig给予板蓝根颗粒剂 供试药液，正常组和模型组给予等体积的生理盐水。给药后0.5h， 药物组和模型组按40μg/kg剂量分别于小鼠尾静脉iv LPS，9h后将 小鼠乙醚麻醉，眼眶内取血，离心后取其血清，于低温冰箱内-20℃ 贮存，备用。TNF-α检测采用ELISA法，NO的含量测定采用Griess 试剂法。小鼠经不同剂量的板蓝根颗粒剂供试溶液处理后再给予同等 剂量LPS，其血清中TNF-α和NO浓度及抑制百分率见表9。
表9对LPS致小鼠血清TNF-α和NO的影响
组别 剂量 (g/kg) TNF-α (pg·mL-1) 抑制百分率 (％) NO (μg·mL-1) 抑制百分率(％) 正常组 药物组 模型组 - 5.0 2.5 1.25 - 42.8±21.9** 158.7±17.3** 268.3±13.6* 599.1±71.2 753.7±200.7 - 82.56 66.58 21.45 - 6.9±2.5** 8.1±1.7** 27.9±11.5* 61.9±8.9 78.1±27.2 - 95.43 72.56 21.32 -
注：与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，板蓝根颗粒剂对内毒素诱导小鼠体内释放TNF-α和 NO具有显著的抑制作用，并且其抑制率在1.25～5.0g/kg范围内呈 剂量依赖性。
2.2板蓝根颗粒剂对于氧自由基(LPO、SOD水平)的影响
家兔饲养3d适应后，按表11随机分成4组，每组5只。药物组 按20、10g·kg-1剂量ig给药，模型组及正常对照组给予相同体积的 板蓝根颗粒剂阴性对照溶液，每日2次，一共5d。于第4d起，除正 常对照组外，间隔24h分别于耳缘静脉注射内毒素16μg·kg-1，30μg·kg-1以复制DIC家兔模型；正常对照组则静注相同体积的无菌生理盐水， 各组于第二次静注后12h经耳中动脉采血3mL，凝固后以3000r·min-1离心20min，分离得血清，置4℃冰箱内待测。血清样本参照试剂盒 说明书进行处理后，LPO含量测定采用硫代巴比妥酸显色法(TBA显 色法)，以LPO之代谢终末产物——丙二醛(MDA)μmol·L-1血清表示。
SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法，以亚硝酸盐单位/升(1×103NU·L-1)血清表示。所得实验数据按t检验法统计处理，结果见表10。
表10内毒素性DIC家兔血清中MDA和SOD的水平
组别 MDA content /μmol·L-1 SOD activity /1×103NU·L-1 模型组 板蓝根颗粒剂1.0g·mL-1 板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1 正常对照组 5.57±0.59 4.07±0.64** 3.46±0.52** 3.09±0.45** 85.56±10.45 103.22±9.89* 93.65±7.98* 113.16±9.78**
注：与DIC组比较，**P＜0.01 *P＜0.05
结果表明，板蓝根颗粒剂高、低剂量组可以显著降低内毒素性 DIC家兔血清中MDA的含量，升高其血清SOD活力，与DIC组比 较有显著性差异。同时，两药物组的MDA和SOD水平与正常对照 组比较均无显著差别(P＞0.05)，表明其具有抑制内毒素大量释放氧自 由基作用，保护机体组织受损。
总之，上述研究实验显示板蓝根原生药及板蓝根颗粒具有广泛的 体内外抗内毒素活性——它能够直接中和、降解内毒素，在电镜下使 之网状结构解聚或碎裂崩解，破坏其正常结构；体外鲎试验表明可降 低内毒素的总量，使其与鲎试剂反应水平降低；在体内可显著拮抗内 毒素导致的DIC生物效应，降低重要器官组织的血栓形成率；抑制 内毒素所致家兔发热效应以及对ACTD、D-GalN敏化小鼠内毒素致 死攻击具有显著的保护作用。同时，在对板蓝根颗粒剂作用机制研究 方面，结果表明其可以抑制内毒素刺激小鼠各重要组织膜结构伸展刺 突蛋白(moesin)mRNA的表达，减轻内毒素诱导鼠体p38丝裂原活化 蛋白激酶(P38MAPK)活性升高的程度。因此，相对于直接抗病原体、 抗炎作用，板蓝根抗内毒素活性才是其清热解毒的重要途径。
另外，板蓝根颗粒剂可以抑制内毒素诱导的炎症介质(TNF-α、 IL-6、IL-8、NO等)合成与释放，阻滞其级联反应，有利于控制过度 的炎性反应，从而有效地控制病情，降低病死率。在拮抗氧自由基方 面，板蓝根颗粒剂通过降低内毒素性DIC家兔血清中过氧化脂质 (LPO)水平、升高超氧化物歧化酶(SOD)等氧自由基清除酶活性，提 高了机体对氧自由基的清除能力，减轻了机体遭受自由基攻击所致损 伤。
由此可见，板蓝根及板蓝根颗粒剂具有内毒素-炎症细胞因子-氧 自由基兼治的特色，将其应用于防治内毒素血症的临床实践，具备了 良好的应用基础和前景，有利于为内毒素所致感染性疾病的中医药防 治提供新型有力的武器。