本申请是2003年3月20日提交的，申请号为03809155.0，发明题目 为“具有渗压剂和二价微量元素的胆碱硅酸络合物”的分案申请。
本专利申请描述了使用Ca2+和/或渗压剂(osmolytes)的用于植物、 动物和人类的特殊胆碱-(原)硅酸络合物的用途和制备。胆碱以非常低 的pH抑制高浓度的原硅酸(OSA)和低聚物的胶凝作用，以便能够制备 即用的稳定溶液，所述溶液对人类、植物和动物是可生物利用的。OSA 的聚合物是大分子(也称为高分子)，由数百或数千个称作单体(OSA) 的单元中形成，然而低聚物是中等尺寸的分子-比单体大得多，但是小于 高分子(Brinker CJ et al，Sol-Gel Science，The physics and Chemistry of Sol-Gel processing，Academic Press，Boston，p.5)。胆碱在人类和动物的 脂肪代谢中起重要的作用，并且是以磷脂酰胆碱的形式，我们细胞膜的一 种重要的磷脂作为各种活细胞的一部分。人类从甘氨酸中合成胆碱，但是 这种合成对长期良好的健康状况似乎是不够的。它也作为乙酰胆碱，一种 重要的神经递质存在。它作为维生素B4也是公知的。而且，胆碱是渗压 剂和另一种重要的渗压剂，甜菜碱的前体。在如下条件下，即酒精中毒、 Alzheimer病、心绞痛、动脉硬化、哮喘、肝硬化、胱氨酸尿症、抑郁症、 糖尿病、湿疹、脂肪肝、头发和指甲问题、肝炎、高胆固醇、高血压、肝 肾损坏、MS等，它也可以作为食品增补剂。它也与叶酸盐的作用有关。 虽然大多数人通过他们的食物摄取足够的营养(卵磷脂)，但是还有极大 多数人缺乏胆碱的报道。叶酸盐的低的摄取量可能是身体内缺乏胆碱的原 因。近年来对大鼠的初步研究显示了胆碱可能与成骨和骨的重塑有关 (Gugulielmottic et al.，IADR 80 th General Session，2002)。胆碱的日摄 取量估计在200-1000mg/天。在研究表明以缺乏胆碱的膳食为食物的自愿 者不能够产生足够的胆碱之后，国家科学院于1998年将胆碱分类为必需 营养素(Institute of Medicine，Food and Nutrition Board，Dietary reference Intake，1998，390-422)。能够观察到，缺乏胆碱能够引起软骨的组织病理 学变化，即骨、关节处和软骨的发展缓慢，这些变化类似于在缺乏锰的小 鸡中发现的变化。最近对胆碱、蛋氨酸和甜菜碱之间的相互关系以及它们 的差异进行了评论(Workel et al.，1998，World Poultry，14，1998)。胆碱单 独成为用于磷酯、骨的软骨基质的正常熟化以及防止雏鸡的骨短粗病的必 要成分。
植物、动物和人类中的硅的作用得到了很好的证明。已知原硅酸是生 物活性分子；并且还已知食物和饮用水中的硅必须转化为可以吸收和在生 物体内可以进行输送的原硅酸。原硅酸是一种非常弱的酸，在pH低于9.5 的情况下根本不稳定，并且迅速沉淀或形成溶胶或凝胶，所述溶胶或凝胶 对生物体来说是不可利用的。因此，很难制备高浓度(＞0.5％硅)的原硅 酸和低聚物的溶液，所述溶液对不同的生物体来说便于作为储备溶液。在 早期专利申请(WO95/21124)中的方法描述了制备在不同的温度下及时 稳定的高浓度溶液。这些储备溶液极大多数是非常强的酸(pH＜1)，以 防止凝胶和溶胶的形成。与其它硅化合物(硅酸盐，粘土，二氧化硅，马 尾状矿脉(horsetail)，沸石等等)相比，它们的生物利用率是相当高的， 但是这些制剂在稀释之后变得不稳定。
已经研发了标准制剂，以获得浓缩的生物可用的胆碱-硅酸(SA)- 渗压剂溶液的长期溶液。所有渗压剂中仅测试了与胆碱、甜菜碱、肌醇、 乙醇胺、甘氨酸、牛磺酸和如甘露醇和山梨糖醇这样的单糖结合的产生酸 稳定溶液的配方。因为甜菜碱在保持健壮的骨、软骨、毛发、指甲和各种 GAG系统中起很大的作用，所以可为优选。
还不知道这些硅酸稀释液能够用在植物(如在植物的叶子上进行喷 洒)或广泛分布的动物(如猪、家禽、马)的饮用水中。因此，在水中具 有胆碱-硅酸络合物的特殊溶液已经被测试，并且为特定用途而适当地制 备，以及对生物利用率和生理效应进行比较。以下描述用于植物、动物和 人类的特殊制剂和使用本发明的这些制剂所产生的出人意料的效果。
植物和动物中的钙的益处在文献(Poovaiah et al.，1988，Hortscience， 23，267-71；Dell et al.，1987，Handbook of Nutritionally Essential Mineral Elements，Marcel dekker，NY)中得到很好的证明。还不知道在胆碱存在的 情况下，钙对于OSA是完全惰性的，并且不影响高浓度SA的沉淀或胶 凝作用。文献中已披露了盐的加入加速了凝胶的形成，特别是已知钙离子 对硅的聚合是非常有效的(Heald et al.，1955，J Appl Chem London， 5，425)。在测试Ca2+和OSA的不同组合之后，出人意料地发现Ca2+在 pH＜0.7时对高浓度SA不产生任何影响。pH值达到7.5的稀释溶液在硅 浓度低于0.07％时完全稳定，其便于用作植物营养液、动物饮用水或动物 食品喷雾使用。因此，在碱化步骤中，CaCO3中钙的引入在我们的制剂 中是合适的。其它的微量元素，如Mn2+、Sr2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+的二价离子可在碱化步骤期间或之后结合CaCO3的同时添加。氯化物的 形成和它们的溶解度是限制因素。Zn2+的加入在动物应用中是很有益的， 因为在高浓度OSA的吸收期间，Zn迅速从身体中除去，从而在OSA补 给和不足的Zn的补给(低Zn膳食)期间，足够的Zn是血清中减少的唯 一元素。这种观察是新颖的，并且显示了在不足的Zn的补给量期间结合 Zn和OSA的重要性。有趣地是，在植物中不会获得这些结果。通过在叶 子上喷洒增加浓度的OSA之后，植物中Zn的浓度不会受到影响。SA- 络合物储备溶液稀释1000倍，并且在夏季(7月和8月)期间作为胡萝 卜植物的喷雾使用。分析胡萝卜中的Si、Zn、Cu、Mg、Ca和Fe。在叶 子上一周一次进行喷洒之后，除了Si的浓度变成两倍之外，其它的金属 没有很大的差异。
在碱化步骤期间，在SA-胆碱络合物的制剂中加入CaCO3以形成稳 定的溶液(在低pH时)，并且具有高的生物可用性。加入其它的碱(NaOH， KOH等等)，使pH达到0.5，在1周至3个月之后，会产生胶凝。相反， 加入CaCO3，可以有2年的稳定期。我们也使用另外的化合物，如甜菜 碱，一种渗压剂来代替CaCO3，以用于碱化。钙和渗压剂的结合以及甜 菜碱和其它的渗压剂的结合也是可以的。
本发明涉及一种生物制剂，其制备方法，以及它们在失调和疾病的处 理过程中作为营养素和药剂的用途。
本发明还涉及一种作为植物营养素和/或真菌感染抵抗剂的生物制剂 的用途，如减少庄稼中的杀虫剂和毒性化合物的浓度。
配方
所有的配方都含有胆碱。
含有钙的配方1
氯化胆碱在真空下干燥，并且用干盐酸处理。在保持温度低于40℃ 条件下，将四氯化硅(IV)加至形成的酸性胆碱溶液中(SiCl4与氯化胆 碱的比值是每3至5mol为1mol)。
对于水解来说，当冷却时，水(冰/冰水)加至溶液中，其中温度保 持在-10℃至-30℃范围内。在水中70-75％的氯化胆碱溶液以1∶1的比 值加至水解溶液中。所得到的溶液通过加入每升50g的CaCO3浓度的无 水碳酸钙来进行碱化。
使用29Si-NMR的结构表征在-30至-70ppm之间不显示任何信号，其 是用于碳化硅(Si)的光谱区。光谱显示了大约-72，-82，-92，-102和-112 的共振，并且分别是用于Q0，Q1，Q2和Q4种类的特征。
含有钙和锌的配方2
制备在配方1中描述的制剂。在碱化之后以100mg Zn/ml的终浓度 加入ZnCl2。
含有甜菜碱的配方3
氯化胆碱在真空下干燥，并且用干盐酸处理。在保持温度低于40℃ 的条件下，将四氯化硅(IV)加至形成的酸性胆碱溶液(SiCl4与氯化胆 碱的比值是每3至5mol为1mol)。
溶液A：对于水解来说，当冷却时，水(冰/冰水)加至溶液中，其 中温度保持在-10℃至-30℃。
溶液B：通过向1升蒸馏水中加入重量为1至1.5kg的甜菜碱来制备 甜菜碱溶液。
1.8升70-75％的含水氯化胆碱溶液加到2升溶液A中。所得到的溶 液通过加入0.2升的溶液B进行碱化。
含有钙和甜菜碱的配方4
氯化胆碱在真空下干燥，并且用干盐酸处理。四氯化硅(IV)加至温 度保持在低于40℃的条件下，将四氯化硅(IV)加至形成的酸性胆碱溶 液(SiCl4与氯化胆碱的比值是每3至5mol为1mol)。
溶液A：对于水解来说，当冷却时，水(冰/冰水)加至溶液中，其 中温度保持在-10℃至-30℃。
溶液B：通过向体积为1升的蒸馏水中加入重量为1至1.5kg的甜菜 碱来制备甜菜碱溶液。
1.8升70-75％的含水氯化胆碱溶液加至2升溶液A中。
所得到的溶液通过加入0.1升的溶液B和无水碳酸钙(每升25g CaCO3)来进行碱化。
含有钙和牛磺酸(100mg/ml)的配方5
制备在配方1中描述的制剂。在碱化之后以每升100mg的终浓度加 入牛磺酸。
含有甜菜碱和山梨糖醇(300mg/ml)的配方6
氯化胆碱在真空下干燥，并且用干盐酸处理。温度保持在低于40℃ 的条例下，将四氯化硅(IV)加至形成的酸性胆碱溶液(SiCl4与氯化胆 碱的比值是每3至5mol为1mol)。
对于水解来说，当冷却时，水(冰/冰水)加至溶液中，其中温度保 持在-10℃至-30℃。通过向体积为1升的蒸馏水中加入重量为1至1.5kg 的甜菜碱来制备甜菜碱溶液。
溶液A：对于水解来说，当冷却时，水(冰/冰水)加至溶液中，其 中温度保持在-10℃至-30℃。
溶液B：通过向体积为1升的蒸馏水中加入重量为1至1.5kg的甜菜 碱来制备甜菜碱溶液。
1.8升70-75％的含水氯化胆碱溶液加至2升溶液A中。
所得到的溶液通过加入0.2升的溶液B来进行碱化。在碱化之后以每 毫升300mg的山梨糖醇的终浓度加入山梨糖醇。
所有的制剂也可以与其它的二价离子结合。
实施例
实施例1：增加植物的保水力
甜菜碱-胆碱-SA制剂(0.9％的硅)稀释500倍，并且每周一次喷洒 在莴苣作物上。具有同种作物和保持相同耕种条件的土地同时用对照物 (水)和草本硅提取物(herbal silica extrct)(Equisletum arvense)进 行喷洒。调查所收获作物的几种产品参数，以研究产品质量，如穗稳固性、 可商用土地(marketable field)、总鲜重和失重(表1)。用甜菜碱-胆碱 -SA进行处理形成最高的鲜重和可商用土地。在用甜菜碱-胆碱-SA进行处 理之后，由于在保存期间失重较低，和穗稳固性增加，因此与对照或草本 硅处理相比，所收获的作物的质量也更高。这些结果表示了甜菜碱-胆碱 -SA的使用增加了植物中水的保持力。
表1：在莴苣作物上使用甜菜碱-胆碱-SA的结果
对照 甜菜碱-胆碱-SA 草本硅 平均值 等级(1) 平均值 等级(1) 平均值 等级(1) 穗形成： (1-9)*穗稳固性： (1-9)*溶解量： (Cut quality) 可商用土地 kg/m2： 地中的残留量kg/m2(Left on field)： 总鲜重kg/m2： 5天之后的失重： 于冷藏 (4℃)： 于室温： 7天之后的失重： 于冷藏 (4℃)： 于室温： 总等级 7 5.375 56.73 2.27 2.34 4.61 4.4 22.79 7.55 28.57 24 1 2 3 2 2 2 2 3 2 3 7 5.5 59.93 2.58 2.19 4.77 3.48 21.28 5.38 25.84 15 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 6.375 4.75 58.22 2.21 2.37 4.59 5.35 22.19 8.18 26.69 26 3 3 2 3 1 3 3 2 3 2
(1)等级：1＝最好的处理；2＝次好的处理；3＝最坏的处理
实施例2：
测定补充甜菜碱-胆碱-SA在小鸡中增加的骨密度。在童子鸡正常的 膳食(1.4mg Si/g)中用甜菜碱-胆碱-SA(B-ch-SA)补充，以调查硅对血 清钙浓度的作用和股骨内的骨无机盐含量(BMC)密度(BMD)。
一组42,500只小鸡连续6周在它们的饮水中给予B-ch-SA(13.5mg Si/100kg体重/2天)，其增加整个饮食中的Si的摄取量不足0.5％。对照 组相同鸡龄的42,600只小鸡同时开始同样的饲喂，但是不补充B-ch-SA。 在6周时从每组中随机选择30只小鸡样品以分析血清钙浓度和股骨。股 骨的BMC和BMD通过双能X射线吸收测量仪进行分析。记录整个股骨 和股骨中5目标个区域的扫描结果。平均值之间的差异采用one-tailed Student t-test进行评价。
与对照组小鸡(69.47±15.99mg/ml，n＝60)相比，在所补充的小鸡 中血清钙浓度(74.85±13.82mg/ml，n＝60)明显增高(p＜0.05)。
与对照组小鸡相比，对于所补充的小鸡来说，在股骨的所有扫描区域 中BMC明显增高。与对照组小鸡相比，对于所补充的小鸡来说，总BMC 也是明显增高(+8.4％，p＝0.016)。
与对照组小鸡相比，对于所补充的小鸡来说，在中间段(+4.25％， p＝0.0209)、远端的干骨后端(+4.88％，p＝0.0102)以及臀部区(+5.6 ％，p＝0.014)BMD明显增高。
以B-ch-SA的形式，以小于0.5％的量来增加童子鸡的整个膳食摄取 将导致明显增高的血清钙浓度、较高的骨质量和在股骨的皮质层和小梁骨 内的密度。
实施例3：减少胡萝卜中的白霉菌感染。
胡萝卜中常见的真菌感染是叶子上的白霉菌感染(Eryphe heraclei) 其目视为白色斑点。通常使用杀真菌剂，但是这往往带来以下缺陷：由于 被作物吸收，因而对食用者造成中毒或过敏反应。
甜菜碱-胆碱-SA的稀释物在播种之后第3个月开始在3种不同种类 的胡萝卜(Nerac，Tyne，Napa)上进行每周一次地喷洒。具有同种作物 和保持在相同耕种条件下的田地用杀真菌剂进行喷洒。在处理之后的一 周，与未处理的对照组的作物相比，用甜菜碱-胆碱-SA处理的作物和用 杀真菌剂处理的作物的叶子上具有明显减少的白色斑点。可以观察到受到 影响的叶子上的差异，一直到作物收获(见表2)。
表2：在使用甜菜碱-胆碱-SA之后作物的产量
作物 产量 Kg/公亩 白霉菌感染 程度(1) 未处理 甜菜碱-胆碱-SA 杀真菌剂 654 751 775 2 6.5 7
(1)感染评分：1＝严重感染，9＝未感染
与未处理的作物相比，用甜菜碱-ch-SA处理之后的作物发现其产量 明显增高，并且与用杀真菌剂处理的作物的产量相类似。
实施例4：甜椒中的硅的转移。
甜椒生长在营养液(hydraculture)中。甜菜碱-胆碱-SA在营养液中 稀释500倍。同种作物和保持在相同耕种条件下的其它植物不进行补充。 叶子和根部上的硅的浓度通过原子吸收光谱测定法在6周补充之后进行 测定。与未补充的对照叶子相比，用甜菜碱-胆碱-SA补充的植物叶子上 的硅的浓度大于十倍以上。这些实验清楚地显示了来自甜菜碱-胆碱-SA 的硅从根部转移到叶子上。
实施例5：减少植物中的毒性化合物水平。
杀虫剂通常用在作物的栽培中，以防止或处理真菌感染。由于对人类、 动物和环境的毒性，因此预防剂的使用必须保持最小量。严格地调节收获 的作物上的残余毒剂的上限，并且使其尽可能低，以保证作物的质量。发 现使用钙-胆碱-SA(见配方1)稀释液有如下优点：
i)使作物更能抵抗真菌感染，其允许使用更低剂量的杀真菌剂。
ii)减少收获作物中的残余毒剂浓度。
a)莴苣
钙-胆碱-SA制剂以3ml/10L浓度加至杀虫剂溶液中。对照植物仅 仅用杀虫剂进行处理(见表A)。
在播种之后的三天进行栽培，叶处理开始，并且重复4次。处理之 间的周期为每4天一次。作物在最后处理之后的三周收获，并且分析残余 物(异丙脲，二硫代氨基甲酸酯(dithiocarbamates))的浓度。
表A：杀虫剂处理
叶处理 杀虫剂(剂量)
第一次处理 80％福美双(30g/L)
第二次 48％代森锰锌，10％甲霜灵(25g/L)
第三次 50％异丙脲(15g/10L)
第四次 80％福美双(40g/L)，50％primicarb(5g/10L)
第五次 200g/L氰胺(15ml/10L)
当作物用钙-胆碱-SA制剂处理后，残余毒剂浓度明显降低：二硫代 氨基甲酸酯和异丙脲分别发现减少超过64％和30％(见表B)。没有发 现任何作物受到真菌感染。
表B：用钙-胆碱-SA进行处理后在莴苣中的残余杀虫剂。
二硫代氨基甲酸酯 (mg/kg) 异丙脲 (mg/kg) 对照：杀虫剂 杀虫剂+钙-胆碱-SA制剂 14.6 5.15 2.45 1.7
在用钙-胆碱-SA制剂(102μg Si/g干重)处理的莴苣中，其中的硅浓 度高约45％。
当钙-胆碱-SA制剂与低剂量的常用杀真菌剂歇利防霉剂(fungicide Shirlan)(fluazinam，500g/L)结合时，对Phytophthora感染的发病率 进行评价。Shirlan的最小推荐剂量每公顷为0.4升，以防止作物受到 Phytophthora感染。当杀真菌剂的剂量减少到50％，并且与每公顷为0.5L 钙-胆碱-SA制剂结合时，作物没有受Phytophthora感染的痕迹，仍然保 持良好，然而不进行处理的栽培植物的地区受到严重感染。
从上面的实施例中很清楚地得知：尤其与钙和诸如甜菜碱这样的渗压 剂结合的新型胆碱-SA制剂对植物和动物有非常高的生物可利用性。这些 制剂可以作为营养素和药剂使用，所述药剂可以对植物加强防卫并且抵抗 不同的不良条件(干旱条件，来自微生物和昆虫感染的应力状态(stress condition))。这些制剂能够用作动物的正常膳食(富含硅)。这意味着 这些制剂(胆碱-SA-渗压剂的混合物)是真正具有活性的。因此，对于某 种生理情况，它们的使用具有很好的效果。