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1、(10)申请公布号 CN 102580062 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102580062 A *CN102580062A* (21)申请号 201210060299.0 (22)申请日 2012.03.09 A61K 38/37(2006.01) A61K 47/16(2006.01) A61P 7/04(2006.01) A61K 38/36(2006.01) A61K 47/10(2006.01) (71)申请人 中国医学科学院输血研究所 地址 610052 四川省成都市东三环路二段龙 潭总部经济城华彩路 26 号 (72)发明人 张学俊 李长清 叶生亮 杜晞 。
2、曹海军 杨显福 喻洪跃 (54) 发明名称 人凝血因子与 vWF 复合物或人凝血因子 制剂的干热处理稳定剂 (57) 摘要 本发明公开了一种人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定 剂。本发明稳定剂是指 ： 组氨酸或其盐、 精氨酸 或其盐、 赖氨酸或其盐， 甘露醇、 海藻糖、 蔗糖， 还 可含有常用的甘氨酸、 蔗糖、 氯化钠、 氯化钙、 枸橼 酸钠、 肝素中的一种或几种。实验证明， 人凝血 因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 含 有 0.1-10组氨酸或其盐 ； 0.1-10精氨酸或 其盐 ； 0.1-10赖氨酸或其盐， 0.1-。
3、10甘氨酸， 0.1-10甘露醇， 0.1-10蔗糖和 0.1-10海藻 糖的一种或几种就能在 80-100干热环境下既 能有效灭活病毒， 又能有效保护人凝血因子 VIII 的活性， 并具有合格的冻干外观及复溶外观。 因此 本发明可用作人凝血因子VIII与vWF复合物或人 凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂。
4、的干热处理稳定剂， 包 括氨基酸和 / 或糖醇， 其特征在于， 所述的糖醇为甘露醇， 所述的氨基酸为组氨酸或其盐， 精氨酸或其盐， 赖氨酸或其盐， 糖醇含量为 0.1-10， 氨基酸或其盐含量 0.1-10。 2.根据权利要求1所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干 热处理稳定剂， 其特征在于， 所述组氨酸盐为一水组氨酸盐酸盐， 其含量 0.1-10。 3.根据权利要求1所述的人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干 热处理稳定剂， 其特征在于， 所述精氨酸盐为精氨酸盐酸盐， 其含量 0.1-10。 4.根据权利要求1所述的人凝血因子VIII与v。
5、WF复合物或人凝血因子VIII制剂的干 热处理稳定剂， 其特征在于， 所述赖氨酸盐为赖氨酸盐酸盐， 其含量 0.1-10。 5. 根据权利要求 1-4 任一项所述的人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂， 其特征在于， 还含有 0.1-10的甘氨酸。 6. 根据权利要求 1-4 任一项所述的人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂， 其特征在于， 还含有蔗糖、 海藻糖、 氯化钠、 氯化钙、 枸橼酸钠、 肝素 中的一种或几种。 7. 权利要求 1-4 任一项所述干热处理稳定剂在制备人凝血因子 VIII 与 。
6、vWF 复合物或 人凝血因子 VIII 制剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102580062 A 2 1/12 页 3 人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的 干热处理稳定剂 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 涉及一种可减少人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝 血因子 VIII 制剂在干热病毒灭活时人凝血因子 VIII 活性损失的稳定剂。具体而言， 人凝 血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 中不添加人白蛋白， 而是添加甘露醇或 / 和 氨基酸或其盐类， 在干热灭活(80或者100)病毒时能维护制剂中各类蛋白质理化性质。
7、 稳定， 防止蛋白变性析出 ； 降低凝血因子活性损失， 提高凝血因子 VIII 的回收率。 背景技术 0002 血浆来源的人凝血因子 VIII 制剂 (Plasma-derived Human coagulation factor VIII， pdFVIII)， 是经分离纯化的含有高纯度人凝血因子 VIII 的血液制品。一般包含血管 性血友病因子 (Von Willebrand Factor， vWF)、 纤维蛋白原 (Fibrinogen)、 纤维连接蛋白 (Fibronectin)、 维生素 K 依赖性的凝血因子 II、 VII、 IX、 X 及内 抑制蛋白 (inter alpha in。
8、hibitor proteins)、 凝血因子 V 和凝血因子 XIII 等等。制剂中含有的人凝血因子 VIII 可用于甲型血友病治疗， 制剂中含有的 vWF 因子， 可用于血管性血友病的治疗。冻干保护剂 不含人白蛋白成份， 而是添加甘露醇或 / 和氨基酸或其盐类， 可有效避免因人白蛋白添加 所导致的潜在病毒 / 病原体传播的风险。 0003 目前文献报道的无论是制备人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制 剂， 均以人血浆为原料， 因此不能排除传播乙型肝炎病毒 (HBV)、 丙型肝炎病毒 (HCV)、 艾滋 病病毒 (HIV) 或者其他病毒 / 病原体的可能性， 因。
9、此制备工艺流程中必须包含病毒灭活或 去除的方法。例如 ： 血浆蛋白的热稳定专利 USP4379085 中提到用巴氏灭活方法处理制品 ； Horowitz B 等 Lancet 1988 2(8604) ： 186-189 用磷酸三丁酯和胆酸钠进行有机溶剂和 去污剂 (S/D) 法病毒灭活， 灭活后的制品用于患者， 监测 1 年无任何肝炎和艾滋病病毒感 染案例报道。日本红十字会血浆分离中心 kenji F. 等 Vox sang 2006 91(2) ： 119-125 使用 20nm 纳米膜过滤方法去除人免疫球蛋白中的病毒， 制剂浓度和渗透率成反比， 过滤后 的产品有效去除小分子非脂包膜病毒，。
10、 产品无理化变化 ； 基立福 (Grifols)Santigao C 等 Biologicals 2010 38(4) ： 486-493 使用 20nm 纳米膜过滤方法去除人静注免疫球蛋白中 的病毒， 特别是相对颗粒较小的非脂包膜病毒。 0004 在以上各种病毒灭活 / 去除方法中， S/D 法的反应条件比较温和， 对易失活的凝 血因子类制品限制少， 但其作用原理只适用于脂包膜病毒的灭活， 对于非脂包膜类病毒， 例 如 ： HAV、 人B19没有作用。 纳米膜过滤法与制品的分子、 构型、 理化性质密切相关， 如果制品 分子量较大， 选用孔径较小的纳米膜则无法将病毒与制品分离， 孔径较大的膜又。
11、无法实现 小病毒颗粒的去除， 且成本相对较高， 其适用范围有一定的局限性。 因此目前能够同时灭活 脂包膜病毒和非脂包膜病毒的最可靠方法是加热法。湿热法， 如巴氏灭活法是运用最早的 病毒灭活方法， 可靠性强， 主用用于蛋白类制品的病毒灭活， 但许多活性蛋白及酶类无法经 受湿热条件下 60 10 小时的严酷条件， 往往需要加入大量、 高浓度的稳定剂可以减少制品 说 明 书 CN 102580062 A 3 2/12 页 4 生物活性的损失， 但灭活效果也会受到影响， 同时也增加了稳定剂去除等的生产步骤， 提高 了生产成本， 延长了生产周期。而干热法 (60-100 /10 分钟 -72 小时， 特。
12、别是 80 72 小 时或 100 30 分钟 ) 对脂包膜和非脂包膜病毒都有效 Vox Sang 1997 73(1) ： 16-23， 且 干热处理往往是生产的最终步骤， 其成本低， 可操作性和可控制性强， 因此越来越多的厂商 选用干热法对制品进行病毒灭活。 在干热灭活的制品中需要加入合适剂量的稳定剂用于冻 干和干热灭活过程中制品活性的保护。保护剂选择一般遵循 ： 结晶率低、 最大冻结浓缩液 和已干制品玻璃化温度高、 吸湿性低、 不含还原性基团且对人体无害， 性价比高且符合相关 法规要求的辅料 ； 另外从药品的安全性和有效性考虑， 干热后的制品外观、 复溶时间及可见 异物和活性保存率也是选。
13、择适合冻干保护剂时必须考察的关键性因素。常见的保护剂， 例 如 ： 氨基酸、 非还原性糖类、 多元醇、 表面活性剂 ( 吐温 -80)、 白蛋白以及各种无机盐或有机 盐， 如氯化钠或枸橼酸钠等发挥保护作用。 但实际使用中保护作用不够理想， 实际干热处理 前后的凝血因子活性回收率很难达到或超过 75， 难以满足大生产的需要。至今未见有关 将甘露醇或 / 和组氨酸、 精氨酸、 赖氨酸用于人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂制剂干热处理稳定剂的文献和专利报道。 发明内容 0005 本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足， 提供本发明提供一种不含白蛋 白的冷冻干燥人。
14、凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂。 0006 其技术方案为 ： 0007 一种人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂， 包括氨基酸和 / 或糖醇， 所述的糖醇为甘露醇， 所述的氨基酸为组氨酸或其盐， 精氨酸或其 盐， 赖氨酸或其盐， 糖醇含量为 0.1-10， 氨基酸或其盐含量 0.1-10。 0008 上述人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂， 所述组氨酸盐为一水组氨酸盐酸盐， 其含量 0.1-10。 0009 上述人凝血因子 VIII 与 vWF 。
15、复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂， 所述精氨酸盐为精氨酸盐酸盐， 其含量 0.1-10。 0010 上述人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理稳定剂， 其特征在于， 所述赖氨酸盐为赖氨酸盐酸盐， 其含量 0.1-10。 0011 本发明所述的人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处理 稳定剂， 其特征在于， 还含有 0.1-10的甘氨酸。 0012 本发明所述的人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的干热处 理稳定剂， 其特征在于， 还含有蔗糖、 海藻糖、 氯化钠、 氯化。
16、钙、 枸橼酸钠、 肝素中的一种或几 种。 0013 本发明所述干热处理稳定剂在制备人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂中的应用。 0014 本发明的有益效果 ： 本发明的技术方案使制剂在 80-100下干热处理过程中， 凝 血因子 VIII 活性损失少， 回收率达 75以上， 而且冻干外观以及复溶外观能够达到 中华 人民共和国药典 ( 第三部 2010 年版 ) 标准。在人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血 因子 VIII 制剂中加入 0.1-10甘露醇、 0.1-10组氨酸或其盐、 0.1-10精氨酸或其盐就 说 明 书 CN 102580062 。
17、A 4 3/12 页 5 能在 80-100干热下， 既能达到灭活病毒效果， 又能维护制剂中各类蛋白质理化性质稳定， 防止蛋白变性析出 ； 降低凝血因子活性损失， 提高凝血因子 VIII 的回收率。 附图说明 0015 图 1 是 1单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 活性回收比较 图 ； 0016 图 2 是 2单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 活性回收比较 图 ； 0017 图 3 是 4单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 活性回收比较 图。 具体实施方式 0018 下面结合具体附图和实施例对本发明的方法作进一步详细。
18、地说明。 0019 1. 人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂的制备 0020 按照常规方法， 冷沉淀用 4 倍体积水溶解， 并加入抗凝剂肝素钠， 在室温抽提 30 分钟后， 用适量 3 -6氢氧化铝胶进行吸附， 吸附后离心， 上清液过层析柱用阴离子树脂 DEAE 650 吸附， 洗涤杂蛋白后， 用 0.25M 氯化钠洗脱， 所得洗脱液进行超滤脱盐浓缩， 得到 人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂浓缩液半成品。 0021 2. 加入稳定剂， 制备人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂冻干 制剂 ( 直。
19、至干热处理 ) 0022 当组氨酸、 精氨酸、 赖氨酸， 甘露醇、 海藻糖、 蔗糖、 甘氨酸的浓度为 1、 2、 4 时， 组成的稳定剂， 分别加入上述制备的人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂浓缩液半成品， 除菌、 分装、 冻干后经80 72小时或100 30分钟干热病毒灭活即为 成品。冻干及干热后制品外观 ( 表 1、 表 2、 表 3) 0023 表 1 1单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 制品外观 0024 说 明 书 CN 102580062 A 5 4/12 页 6 0025 表 2 2单因素保护剂冻干后、 100干热和 8。
20、0干热后 FVIII 制品外观 0026 说 明 书 CN 102580062 A 6 5/12 页 7 0027 表 3 4单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 制品外观 0028 说 明 书 CN 102580062 A 7 6/12 页 8 0029 3. 观察复溶时间和复溶样品澄明度及 FVIII 的活性回收率 0030 将上述制品的制品在室温下用注射用水进行复溶， 以不加制品的单因素保护剂作 为阴性对照组， 以仅加甘氨酸作为稳定剂的人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人凝血因子 VIII 制剂也经同样的干热处理作为阳性对照， 观察复溶澄明度 ( 表 4、 。
21、表 5、 表 6)， 检测人凝 血因子 VIII 冻干后、 两种干热处理前后的效价， 计算 VIII 因子的活性回收率。( 表 7、 表 8、 表 9、 图 1、 图 2、 图 3) 0031 表 4 1单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 制品复溶情况 0032 说 明 书 CN 102580062 A 8 7/12 页 9 0033 表 5 2单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 制品复溶情况 0034 0035 表 6 4单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 制品复溶情况 0036 说 明 书 CN 102580062 A。
22、 9 8/12 页 10 0037 表 7 1单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 活性回收 0038 说 明 书 CN 102580062 A 10 9/12 页 11 0039 表 8 2单因素保护剂冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 活性回收 0040 说 明 书 CN 102580062 A 11 10/12 页 12 0041 表 9 4单因素保护剂组份冻干后、 100干热和 80干热后 FVIII 活性回收 0042 说 明 书 CN 102580062 A 12 11/12 页 13 0043 从表 1、 2、 3 可以看出冻干后及两种干热灭活后。
23、制品外观 ： I 组 ( 组氨酸 )、 II 组 ( 精氨酸 )、 IV 组 ( 甘露醇 )、 VII 组 ( 甘氨酸 )， 4 III 组 ( 赖氨酸 ) 均能合格 ； 0044 从表4、 5、 6可以看出冻干后及两种干热灭活后制品复溶情况 ： 100干热I组(组 氨酸 )、 II 组 ( 精氨酸 )、 III 组 ( 赖氨酸 )、 IV 组 ( 甘露醇 )、 VII 组 ( 甘氨酸 ) 均能合格 ； 80干热 I 组 ( 组氨酸 )、 II 组 ( 精氨酸 ) 均能合格 ； 0045 从表 7、 8、 9 可以看出， 以 120mM 甘氨酸作为稳定剂的制品经 80或 100干热处 理后， 。
24、凝血因子 VIII 回收率均不超过 75， 而以不同配比的氨基酸或糖醇， 有部分可以在 100干热回收率到达 80以上， 各冻干制品的外观部分有明显差别， 但大部分用注射用水 说 明 书 CN 102580062 A 13 12/12 页 14 复溶后， 澄明度无影响， 说明本发明稳定剂能有效保护人凝血因子 VIII 与 vWF 复合物或人 凝血因子 VIII 制剂。 0046 综上所述， 组氨酸在制品冻干后、 两种干热过程中， 考察的外观和复溶情况均能到 达要求， 冻干后及干热制品 FVIII 效价考察中， 浓度越高活性越低， 但差异性不明显， 整体 体情况组氨酸冻干加 100干热后活性回收。
25、率为 81.896.99 ( 不同浓度均值 )， 因此 1、 2的组氨酸或其盐均能作为保护剂选用 ； 精氨酸在冻干后、 两种干热过程中， 外观随 着浓度越高， 骨架支撑而萎缩， 复溶情况均能达到要求， 冻干后及干热制品 FVIII 效价考察 中， 差异性不明显， 整体体情况精氨酸冻干加 100干热后活性回收率为 62.2015.01 ( 不同浓度均值 )， 因此 1的精氨酸或其盐可作为保护剂选用 ； 赖氨酸在冻干后、 两种干 热过程中， 外观随着浓度越高， 骨架支撑由萎缩逐渐变化为正常， 复溶情况 100 30min 均能达到要求， 80 72hr 1能达到要求， 冻干后及干热制品 FVIII。
26、 效价考察中， 差异性 不明显， 整体体情况赖氨酸或其盐冻干加 100干热后活性回收率为 47.702.36 ( 不 同浓度均值 )。甘氨酸在制品冻干后、 两种干热过程中外观随着浓度越高， 骨架支撑由萎 缩、 空洞逐渐变化为正常， 在两种干热过程中， 外观情况无明显变化， 复溶情况两种均能 达到要求， 冻干后及干热制品 FVIII 效价考察中， 差异性明显， 随着浓度增加， 活性降低， 估计和甘氨酸自身吸湿性一定关系， 整体体情况甘氨酸冻干加 100干热后活性回收率 为 43.6234.85 ( 不同浓度均值 )。甘露醇在制品冻干后、 100干热过程中， 考察的 外观 2和 4能够达到要求， 。
27、复溶情况均能到达要求， 冻干后及干热制品 FVIII 效价考 察中， 浓度越高活性越低， 有差异性， 整体体情况甘露醇冻干加 100干热后活性回收率为 54.644.44(不同浓度均值)， 因此1的甘露醇能作为保护剂备选 ； 海藻糖在制品冻干 后、 100干热过程中， 考察的外观和复溶情况均不能到达要求， 颜色发生类似美德拉反应， 干热容易产生融解状态， 可能由于海藻糖自身容易吸湿， 正常状态己二水水合物形式存在， 结合水在冻干过程中间不易去除， 海藻糖熔点从无水的 203将至 97， 使得干热灭活后 效价测定中， 随着 D- 海藻糖浓度增加， 活性保护越低的情况， 因此， 海藻糖不能作为干热。
28、病 毒灭活的冻干保护剂备选， 但是可作为其他方式的生物冻干保护剂型。 蔗糖在制品冻干后、 100干热过程中， 考察的外观和复溶情况均不能到达要求， 冻干后及干热制品 FVIII 效价 考察中， 整体体情况蔗糖冻干加 100干热后活性回收率为 94.642.76 ( 不同浓度均 值 )， 因此蔗糖不能作为单因素保护剂， 但是比较良好的活性保护作用， 可以作为多因素保 护剂进行进一步的深入研究。 0047 以上所述， 仅为本发明较佳的具体实施方式， 本发明的保护范围不限于此， 任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内， 可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 102580062 A 14 1/2 页 15 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102580062 A 15 2/2 页 16 图 3 说 明 书 附 图 CN 102580062 A 16 。