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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710492278.9 (22)申请日 2017.06.26 (71)申请人 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中 心 地址 830001 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市碱泉一街138号 (72)发明人 史深 徐艺玫 罗芸 燕顺生 徐晓辉 袁江玲 闫化奎 补娟 (51)Int.Cl. A01K 67/02(2006.01) (54)发明名称 一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建 方法 (57)摘要 本发明公开一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物 模型的构建方法， 通过采用试验动物的筛选、 剖。
2、 取冲洗包囊、 制备原头节悬液、 镜检原头节、 麻醉 子午沙鼠、 建模等一系列的技术手段， 创造性的 提供了一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构 建方法， 利用此方法构建的泡球蚴病动物模型， 60d包囊组织几乎长满整个胸腔并完全包裹肺 脏， 15d、 45d、 60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小 鼠包囊系数均有显著差异， 本发明提供的子午沙 鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法具有成模率 高、 造模周期短、 成本低以及重现性好的优点， 对 于医学技术领域具有广泛地实用性。 权利要求书1页 说明书8页 附图3页 CN 107296007 A 2017.10.27 CN 107296007 A 1.一。
3、种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 其特征在于， 具体构建方法步骤如 下： （1） 试验动物： 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级BALB/c小 鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半； （2） 子午沙鼠的饲养： 采用常规饲养模式， 饲料类型为钴60辐照大小鼠维持饲料， 自由 采食， 每周添加饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理； （3） 剖取包囊： 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖取多 房棘球绦虫包囊； （4） 研磨冲洗包囊： 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研磨后过80目筛网， 同时以双抗溶 。
4、液冲洗筛网， 留取滤液； （5） 制备原头节悬液： 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上清液， 反复三次， 留取原头节悬液； （6） 镜检原头节： 混匀原头节悬液， 用0.5%伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时镜检 原头节活力， 原头节活力在95%以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至4000- 5000个/ml； （7） 麻醉子午沙鼠： 对子午沙鼠麻醉处理， 在颈部气管处备皮， 固定动物于手术台， 碘 伏酒精消毒手术区域； （8） 建模： 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的原头 节悬液0.02-0.03ml注射入气管内， 注射。
5、后针头置于气管内停留8-10s， 防止动物呛咳造成 悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将动物置于28-32恒温环境至苏 醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 2.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 其特征在于， 所 述成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型后进行术后处理， 术后每日以碘伏消毒手术创 口， 连续三日。 3.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 其特征在于， 所 述的双抗溶液由青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9%无菌生理盐水制备获 得。 4.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病。
6、动物模型的构建方法， 其特征在于， 所 述的对子午沙鼠麻醉处理时， 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠进行麻 醉处理。 5.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 其特征在于， 所 述的镜检原头节步骤中， 计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。 6.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 其特征在于， 所 述的建模步骤中， 将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内， 注射后针头置于气管内停留 10s。 7.如权利要求1所述的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 其特征在于， 所 述的恒温环境的温度为30。 权 利。
7、 要 求 书 1/1 页 2 CN 107296007 A 2 一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法 技术领域 0001 本发明属于医学技术领域， 具体的， 本发明涉及一种建立肺泡球蚴病动物模型方 法的技术领域。 背景技术 0002 包虫 病是一种多发于牧区的 人兽共患寄生虫 病 ， 主要由 细粒棘球绦虫 (Echinococcus granulosus .Eg)的幼体和多房棘球绦虫 (Echinococcus multilocularis.Em)的幼体感染人体发生。 其中多房棘球绦虫幼体(泡球蚴)导致的泡型包 虫病由于其包囊具有浸润性生长的特点， 又称泡球蚴病(alveolar echi。
8、nococcosis， Ae)， 造成该病极难治愈， 被称为 “虫癌” 。 在包虫病高流行地区， 包虫病已成为制约当地经济发 展、 影响社会安定的公共卫生问题。 人类包虫病中15以上是肺包虫病， 而目前报道的包虫 病动物模型， 多是用各种动物建立的腹腔动物模型， 未见理想的肺包虫病动物模型报道， 因 此， 建立合适的肺包虫病动物模型， 对肺包虫病的发生、 治疗和预防具有非常重要的现实意 义。 0003 目前， 为人类建立动物模型的实验动物品种仍然较少， 尚不能满足现有已存在和 不断增加的疾病防治和科学研究的需要。 而寻找体型小， 模拟人类疾病动物模型准确、 模型 周期短、 易于饲养繁殖的动物种。
9、类成为丰富实验动物新品种的重要途径。 在这种方向的指 引下， 被逐步驯化的实验动物成为实验动物新品种的主要来源。 国内已驯养成功和正在驯 化开发的有5-6种， 已被国内认可的新型实验动物如黑线仓鼠和长爪沙鼠， 已在生物医学研 究中广泛应用， 而且是多种疾病和病原的模型动物。 子午沙鼠(Meriones meridianus)属啮 齿目(Rodentia)、 仓鼠科(Cricetidae)、 沙鼠亚科(Gerbillinae)、 沙鼠属(Meriones)， 是欧 亚大陆中部荒漠、 半荒漠的鼠种， 具有体积小、 性情温和、 繁殖力强、 性成熟早、 易驯眠和易 饲养等特点。 作为和长瓜沙鼠同属一个。
10、属的子午沙鼠， 在生物学方面两者具有相似性， 但体 型只有长瓜沙鼠的2/3， 用小鼠盒就能饲养繁殖。 长瓜沙鼠体型大， 需要用中鼠盒饲养繁殖， 空间是小鼠盒的两倍， 饲料消耗比子午沙鼠多三分之一。 与长瓜沙鼠相比， 子午沙鼠在饲养 空间和饲料消耗方面具明显的优势。 现有报道显示， 用细粒棘球蚴和多房棘球蚴腹腔感染 子午沙鼠， 发现该鼠对两种棘球蚴的感染效果都明显优于现有实验动物。 0004 动物模型的制备， 尤其是模拟自然感染途径， 是进行包虫病研究的基础。 目前泡球 蚴感染小鼠模型有四种造模方式： 开腹直视肝脏穿刺接种、 经皮肝穿刺接种、 门静脉系侧枝 血管(回盲部静脉)穿刺接种和腹腔穿刺接。
11、种。 这四种造模方式均是适用于制备肝包虫病动 物模型， 且这四种方法具有肝易损伤、 腹腔易感染的缺点， 不能很好的反映肝脏原发病灶的 生长情况， 更不适用于肺包虫病动物模型的建立。 例如中国专利CN106236318A， 公开了一种 泡球蚴经肝门静脉途径感染肝脏的泡型包虫病动物模型的构建方法， 该专利主要是经肝门 静脉途径感染肝脏， 从而建立肝包虫病动物模型。 现有技术中关于肺包虫病动物模型报道 极少， 仅有一篇文献是申请人在研究子午沙鼠习性时， 向国家申请了自然科学基金 子午沙 鼠清洁级种群及其肺包虫病动物模型的建立 项目， 项目中记载的内容仅仅是申请人初期 说 明 书 1/8 页 3 CN。
12、 107296007 A 3 对子午沙鼠的研究， 这为如何建立肺包虫病动物模型奠定了基础， 但如何成功建立子午沙 鼠肺泡球蚴病动物模型， 仍需要进行进一步研究， 不能够获得解决子午沙鼠肺泡球蚴病动 物模型构建技术的突破。 因此， 需要在现有技术的基础上建立一种更接近自然感染途径、 感 染率高， 以及病灶原发于肺的泡型包虫病动物模型， 建立肺包虫病动物模型对研究人类肝 包虫病的发生、 发展、 治疗和预防具有非常重要的现实意义。 发明内容 0005 针对目前国内外有关利用子午沙鼠建立肺泡球蚴病动物模型的报道较少， 且现有 建模方法存在感染率高、 造模周期长， 不适用于子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构。
13、建技术 现状， 本发明旨在于提供一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 通过采用试验动 物的筛选、 剖取冲洗包囊、 制备原头节悬液、 镜检原头节、 麻醉子午沙鼠、 建模等一系列的技 术手段， 创造性的提供了一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 成功构建一种子 午沙鼠肺泡球蚴病动物模型， 60d包囊组织几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏， 15d、 45d、 60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小鼠包囊系数均有显著差异， 本发明提供的子午沙鼠肺泡 球蚴病动物模型的构建方法具有成模率高、 感染率低、 造模周期短、 成本低以及重现性好的 优点， 对于医学技术领域具有广泛地实用性。 0006 为。
14、了达到上述目的， 本发明所采用的技术方案： 0007 本发明提供一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 具体构建方法步骤如 下： 0008 (1)试验动物： 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级 BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半。 0009 (2)子午沙鼠的饲养： 采用常规饲养模式， 饲料类型为钴60辐照大小鼠维持饲料， 自由采食， 每周添加饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 0010 (3)剖取包囊： 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖 取多房棘球绦虫包囊。 0011 (4)。
15、研磨冲洗包囊： 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研磨后过80目筛网， 同时以双 抗溶液冲洗筛网， 留取滤液。 0012 (5)制备原头节悬液： 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 留取原头节悬液。 0013 (6)镜检原头节： 混匀原头节悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时 镜检原头节活力， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至 4000-5000个/ml。 0014 (7)麻醉子午沙鼠： 对子午沙鼠麻醉处理， 在颈部气管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒手术区域。 0015 (8)建模： 沿气管方向。
16、切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的 原头节悬液0.02-0.03ml注射入气管内， 注射后针头置于气管内停留8-10s， 防止动物呛咳 造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将动物置于28-32恒温环境 至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 0016 采用子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建后， 需要做好术后处理， 术后每日以碘 说 明 书 2/8 页 4 CN 107296007 A 4 伏消毒手术创口， 连续三日。 0017 本发明中， 双抗溶液由青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生 理盐水制备获得。 001。
17、8 本发明中， 对子午沙鼠麻醉处理时， 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1戊 巴比妥钠进行麻醉处理。 0019 本发明中， 镜检原头节步骤中， 计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。 0020 本发明中， 建模步骤中， 将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内， 注射后针头置 于气管内停留10s。 0021 本发明中， 恒温环境的温度为30。 0022 通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果： 0023 (1)本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 通过采用试验 动物的筛选、 剖取冲洗包囊、 制备原头节悬液、 镜检原头节、 麻醉子午沙鼠、 建模等一。
18、系列的 技术手段， 能够成功构建子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型， 克服了没有相关动物模型对于包 虫病病证机制的研究的限制， 具有成模率高、 感染率低、 造模周期短、 成本低以及重现性好 的优点， 对于医学技术领域具有广泛地实用性。 0024 (2)采用本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法， 分别于造 模后15d、 30d、 45d、 60d四个时间点评价模型建立情况， 比较子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管 感染多房棘球绦虫包囊解剖结果， 解剖后可见子午沙鼠接种多房棘球绦虫原头节15d肺组 织表面出现较多不规则白色突起， 30d形成明显包囊， 45d包囊组织迅速增长， 60d包囊组织。
19、 几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏。 BALB/c小鼠接种15d后肺脏表面未见明显异常， 30d肺 脏表面形成不规则突起， 45d可观察到单发的包囊， 60d包囊数量、 体积较45d均有增加。 感染 动物肺组织分离包囊后测算包囊系数， 15d、 45d、 60d子午沙鼠包囊系数较BALB/c小鼠包囊 系数均有显著差异(P0.05)。 0025 (3)采用本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法后， 对所有 感染动物肺组织提取进行cox1基因PCR检测， 15d时子午沙鼠有6只感染多房棘球蚴呈强阳 性， 而BALB/c小鼠只有2只； 30d和45d子午沙鼠感染强阳性均为7只， BALB。
20、/c小鼠感染强阳性 分别为4只和3只； 60d子午沙鼠感染8只均为强阳性， BALB/c小鼠为4只。 0026 (4)采用本发明提供的一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法后， 对子午 沙鼠和BALB/c小鼠不同时间点肺组织切片进行病理学诊断， 第15d时可见肺泡间隔增厚， 炎 细胞浸润伴有出血， 血管周围炎形成， 主要为嗜酸性粒细胞、 单核细胞及淋巴细胞。 第30d， 炎症反应加剧， 并有纤维素囊形成趋势， 周围大量炎细胞浸润， 主要为浆细胞、 嗜酸性粒细 胞、 嗜中性粒细胞及淋巴细胞。 第45d， 肺组织内大量囊腔形成， 棘球蚴包囊形成， 角质层和 生发层可见， 囊内有脱落的包囊砂(棘球。
21、砂)。 第60d， 肺组织被大量囊腔取代， 棘球蚴包囊形 成， 角质层和生发层可见， 腔内散在大量原头蚴， 钙颗粒形态寻常， 部分能看到囊液。 而 BALB/c小鼠第15d肺组织形态正常， 无明显病理性改变， 第30d可见炎性肉芽肿形成， 单核细 胞、 嗜酸性粒细胞为主， 并可见巨嗜细胞， 第45d肺泡间隔增厚， 炎细胞浸润伴有出血， 血管 周围炎初步形成， 第60d炎症反应加剧， 弥漫性炎细胞浸润伴有出血， 血管周围炎形成。 附图说明 说 明 书 3/8 页 5 CN 107296007 A 5 0027 图1显示为子午沙鼠经气管感染多房棘球绦虫后的解剖观察结果。 0028 图2显示为BAL。
22、B/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫后的解剖观察结果。 0029 图3显示为子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫肺组织cox1基因PCR 检测结果。 0030 图4显示为子午沙鼠经气管感染多房棘球绦虫肺组织病理切片。 0031 图5显示为BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫肺组织病理切片。 具体实施方式 0032 下面， 举实施例说明本发明， 但是， 本发明并不限于下述的实施例。 0033 本发明所使用的主要实验动物： 清洁级封闭群子午沙鼠40只， 812周龄， 雌雄各 半； 清洁级BALB/c小鼠40只， 810周龄， 雌雄各半， 均有新疆维吾尔自治区实验动物研究中 心提供(生产许。
23、可： SCXK(新)。 0034 本发明所使用的主要实验动物饲料： 钴60辐照大小鼠维持饲料， 胡萝 卜， 葵花籽。 0035 本发明所使用的感染材料： 多房棘球绦虫原头节， 由新疆维吾尔自治区实验动物 研究中心BALB/c小鼠体内保种传代。 0036 本发明所使用的实验试剂和仪器属于本领域常见， 其选用的试剂浓度和单位属于 本领域熟知方式： 0.5伊红、 95以上原头节活力、 双抗溶液、 青霉素50万单位、 链霉素50 万单位溶于500ml 0.9无菌生理盐水； 麻醉剂： 1戊巴比妥钠(美国默克公司)0.9无菌 生理盐水溶液。 DP-304组织基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)； 多房。
24、棘球绦虫 cox1基因引物(北京博迈德基因技术有限公司)； PCR Master Mix、 DNAMarker、 核酸染料均 购自德国凯杰(qiagen)公司； HE染色相关试剂均购自珠海贝索生物技术有限公司。 0037 本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的， 但不限制本发明的实 施， 其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。 动物实验 遵照新疆维吾尔自治区实验动物研究中心实验动物使用与管理委员会的批准， 样本取材程 序符合新疆维吾尔自治区实验动物研究中心实验动物伦理委员会标准， 实验严格遵循动物 实验的相关伦理学标准执行， 在实验过程中使用麻醉剂， 最大。
25、限度的减少小动物的术后疼 痛。 0038 实施例一： 0039 子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建的具体步骤如下： 0040 (1)试验动物： 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级 BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半。 0041 (2)子午沙鼠的饲养： 采用常规饲养模式， 饲料类型： 钴60辐照大小鼠维持饲料， 自 由采食， 每周添加饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 0042 (3)剖取包囊： 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖 取多房棘球绦虫包囊。 0043 (4)研磨冲洗包囊： 。
26、剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研磨后过80目筛网， 同时以双 抗溶液冲洗筛网， 留取滤液。 0044 (5)制备原头节悬液： 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 留取原头节悬液。 说 明 书 4/8 页 6 CN 107296007 A 6 0045 (6)镜检原头节： 混匀原头节悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时 镜检原头节活力， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至 4000-5000个/ml。 0046 (7)麻醉子午沙鼠： 对子午沙鼠麻醉处理， 在颈部气管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒。
27、手术区域。 0047 (8)建模： 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的 原头节悬液0.02-0.03ml注射入气管内， 注射后针头置于气管内停留8-10s， 防止动物呛咳 造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将动物置于28-32恒温环境 至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 0048 经过上述， 采用子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法后， 进行必要的术后处 理： 术后每日以碘伏消毒手术创口， 连续三日。 0049 本发明中， 双抗溶液由青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生 理盐水制备获得。 00。
28、50 本发明中， 对子午沙鼠麻醉处理时， 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1戊 巴比妥钠进行麻醉处理。 0051 本发明中， 镜检原头节步骤中， 计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。 0052 本发明中， 建模步骤中， 将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内， 注射后针头置 于气管内停留10s。 0053 本发明中， 恒温环境的温度为30。 0054 实施例二： 0055 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半， 均采用常规饲养模式， 自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料， 每周添加 饲喂胡萝 。
29、卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫 传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊， 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研 磨后过80目筛网， 同时采用以青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生理 盐水制备的双抗溶液冲洗筛网， 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 混匀原头节悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时镜检原头 节活力， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至4000个/ml。 0056 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂。
30、量腹腔注射1戊巴比妥钠进行麻醉处理， 在颈部气 管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒手术区域。 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离 颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内， 注射后针头置于气管 内停留8s， 防止动物呛咳造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将动 物置于28恒温环境至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 术后每日以碘伏消 毒手术创口， 连续三日。 0057 实施例三： 0058 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半， 均采用常规。
31、饲养模式， 自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料， 每周添加 饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫 传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊， 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研 说 明 书 5/8 页 7 CN 107296007 A 7 磨后过80目筛网， 同时采用以青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生理 盐水制备的双抗溶液冲洗筛网， 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 混匀原头节悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时镜检原头 节活力。
32、， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。 0059 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1戊巴比妥钠进行麻醉处理， 在颈部气 管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒手术区域。 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离 颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的原头节悬液0.03ml注射入气管内， 注射后针头置于气管 内停留9s， 防止动物呛咳造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将动 物置于29恒温环境至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 术后每日以碘伏消 毒手术创口， 连续三日。 0060 实施例四： 0061 选。
33、取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半， 均采用常规饲养模式， 自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料， 每周添加 饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫 传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊， 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研 磨后过80目筛网， 同时采用以青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生理 盐水制备的双抗溶液冲洗筛网， 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 混匀原头节。
34、悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时镜检原头 节活力， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至4000个/ml。 0062 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1戊巴比妥钠进行麻醉处理， 在颈部气 管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒手术区域。 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离 颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内， 注射后针头置于气管 内停留10s， 防止动物呛咳造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将 动物置于31恒温环境至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 术后每日。
35、以碘伏 消毒手术创口， 连续三日。 0063 实施例五： 0064 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半， 均采用常规饲养模式， 自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料， 每周添加 饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫 传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊， 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研 磨后过80目筛网， 同时采用以青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生理 盐水制备的双抗溶液冲洗筛网， 采用50ml注射器吸入。
36、滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 混匀原头节悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时镜检原头 节活力， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至4500个/ml。 0065 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1戊巴比妥钠进行麻醉处理， 在颈部气 管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒手术区域。 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离 颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的原头节悬液0.02ml注射入气管内， 注射后针头置于气管 内停留9s， 防止动物呛咳造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将动 物置于。
37、30恒温环境至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 术后每日以碘伏消 说 明 书 6/8 页 8 CN 107296007 A 8 毒手术创口， 连续三日。 0066 实施例六： 0067 选取清洁级封闭群子午沙鼠40只， 8-12周龄， 雌雄各半， 清洁级BALB/c小鼠40只， 8-10周龄， 雌雄各半， 均采用常规饲养模式， 自由采食钴60辐照大小鼠维持饲料， 每周添加 饲喂胡萝 卜10g/只、 葵花籽5g/只， 饮用水经高压灭菌处理。 二氧化碳麻醉处死多房棘球绦虫 传代BALB/c小鼠， 采用无菌手术剖取多房棘球绦虫包囊， 剪碎包囊置于研钵内研磨， 充分研 磨后过80目筛网， 。
38、同时采用以青霉素50万单位、 链霉素50万单位溶于500ml 0.9无菌生理 盐水制备的双抗溶液冲洗筛网， 采用50ml注射器吸入滤液， 加双抗溶液沉淀原头节， 排出上 清液， 反复三次， 混匀原头节悬液， 用0.5伊红染色后滴入血球计数板计数， 同时镜检原头 节活力， 原头节活力在95以上方可接种动物， 计数后调整原头节悬液浓度至5000个/ml。 0068 取子午沙鼠以0.5ml/100g剂量腹腔注射1戊巴比妥钠进行麻醉处理， 在颈部气 管处备皮， 固定动物于手术台， 碘伏酒精消毒手术区域。 沿气管方向切开颈部皮肤钝性分离 颌下腺及肌肉， 暴露气管， 将混匀的原头节悬液0.03ml注射入气。
39、管内， 注射后针头置于气管 内停留10s， 防止动物呛咳造成悬液外溢， 退针后还纳颌下腺， 缝合皮肤， 消毒手术创口， 将 动物置于32恒温环境至苏醒， 成功建立子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型。 术后每日以碘伏 消毒手术创口， 连续三日。 0069 实施例七： 子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的检测评价 0070 采用上述实施例一至实施例六任意一种子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建， 分 别于造模后15d、 30d、 45d、 60d四个时间点， 对采用上述实施例制备的子午沙鼠肺泡球蚴病 动物模型进行检测评价。 0071 (1)解剖学检查 0072 检查方法： 分别于造模后15d、 30d、 45d、 6。
40、0d四个时间点评价模型建立情况， 每次处 理子午沙鼠和BALB/c小鼠各8只。 称重后异氟烷吸入麻醉处死， 解剖胸腔观察肺组织感染情 况并记录。 对肉眼可见包囊的肺组织， 仔细剥离包囊称重， 结合动物体重， 计算包囊系数(包 囊系数包囊重/动物体重100)。 0073 检查结果： 子午沙鼠解剖结果参见附图1， 子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管感染多房 棘球绦虫包囊系数比较结果见表1。 解剖后可见子午沙鼠接种多房棘球绦虫原头节15d肺组 织表面出现较多不规则白色突起， 30d形成明显包囊， 45d包囊组织迅速增长， 60d包囊组织 几乎长满整个胸腔并完全包裹肺脏。 BALB/c小鼠解剖结果参见附。
41、图2， BALB/c小鼠接种15d 后肺脏表面未见明显异常， 30d肺脏表面形成不规则突起， 45d可观察到单发的包囊， 60d包 囊数量、 体积较45d均有增加。 0074 表1： 子午沙鼠与BALB/c小鼠经气管感染多房棘球绦虫包囊系数比较 0075 15d30d45d60d 子午沙鼠0.02820.0213*0.02430.01590.55670.6217*4.75452.8431* BALB/c小鼠0.00270.00440.01110.01270.02540.02440.03450.0426 0076 注： 与BALB/c小鼠相比P0.05 0077 由表1可知， 感染动物肺组织分离。
42、包囊后测算包囊系数， 15d、 45d、 60d子午沙鼠包 囊系数较BALB/c小鼠包囊系数均有显著差异(P0.05)。 说 明 书 7/8 页 9 CN 107296007 A 9 0078 (2)多房棘球绦虫cox1基因PCR检测 0079 检测方法： 所有感染动物取30mg肺组织提取总DNA。 根据已报道多房棘球绦虫cox1 基因设计引物 0080 (Cox1Fw： GTGGTGTTGATTTTTTGATGTTT； Cox1RV： CCAAACGTAAACAACACTATAAAAGA)， 扩 增体系： 2Ta PCR MasterMix 15 L， 样品DNA 3 L， 上、 下游引物各。
43、2 L， dd水8 L， 共30 L。 扩增条件： 预变性955min， 变性9530s， 退火5645s， 延伸7240s， 反复35个循环， 72 延伸12min。 扩增产物以2琼脂糖凝胶电泳检测。 0081 检测结果： 对所有感染动物肺组织提取进行cox1基因PCR检测， 结果参见附图3， 15d时子午沙鼠有6只感染多房棘球蚴呈强阳性， 而BALB/c小鼠只有2只； 30d和45d子午沙鼠 感染强阳性均为7只， BALB/c小鼠感染强阳性分别为4只和3只； 60d子午沙鼠感染8只均为强 阳性， BALB/c小鼠为4只。 0082 (3)组织病理学检查 0083 检查方法： 对子午沙鼠和B。
44、ALB/c小鼠不同时间点肺组织切片进行病理学诊断， 诊 断如下： 0084 子午沙鼠检查结果参见附图4， 第15d时可见肺泡间隔增厚， 炎细胞浸润伴有出血， 血管周围炎形成， 主要为嗜酸性粒细胞、 单核细胞及淋巴细胞。 第30d， 炎症反应加剧， 并有 纤维素囊形成趋势， 周围大量炎细胞浸润， 主要为浆细胞、 嗜酸性粒细胞、 嗜中性粒细胞及 淋巴细胞。 第45d， 肺组织内大量囊腔形成， 棘球蚴包囊形成， 角质层和生发层可见， 囊内有 脱落的包囊砂(棘球砂)。 第60d， 肺组织被大量囊腔取代， 棘球蚴包囊形成， 角质层和生发层 可见， 腔内散在大量原头蚴， 钙颗粒形态寻常， 部分能看到囊液。。
45、 0085 BALB/c小鼠检查结果参见附图5， 第15d肺组织形态正常， 无明显病理性改变。 第 30d可见炎性肉芽肿形成， 单核细胞、 嗜酸性粒细胞为主， 并可见巨嗜细胞。 第45d肺泡间隔 增厚， 炎细胞浸润伴有出血， 血管周围炎初步形成。 第60d炎症反应加剧， 弥漫性炎细胞浸润 伴有出血， 血管周围炎形成。 0086 综上所述， 通过采用试验动物的筛选、 剖取冲洗包囊、 制备原头节悬液、 镜检原头 节、 麻醉子午沙鼠、 建模等一系列的技术手段， 创造性的提供了一种子午沙鼠肺泡球蚴病动 物模型的构建方法， 本发明提供的子午沙鼠肺泡球蚴病动物模型的构建方法具有成模率 高、 造模周期短、 。
46、成本低以及重现性好的优点， 对于医学技术领域具有广泛地实用性。 0087 如上所述， 即可较好地实现本发明， 上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方 式进行描述， 并非对本发明的范围进行限定， 在不脱离本发明设计精神的前提下， 本领域普 通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进， 均应落入本发明确定的保护范围 内。 说 明 书 8/8 页 10 CN 107296007 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/3 页 11 CN 107296007 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/3 页 12 CN 107296007 A 12 图5 说 明 书 附 图 3/3 页 13 CN 107296007 A 13 。