一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410710582.2 (22)申请日 2014.11.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105684894 A (43)申请公布日 2016.06.22 (73)专利权人 北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路35号 (72)发明人 许立新 瞿杨 梁小红 韩烈保 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (56)对比文件 CN 1732。

2、758 A,2006.02.15, CN 1732758 A,2006.02.15, CN 1732758 A,2006.02.15, CN 102450214 A,2012.05.16, CN 103975860 A,2014.08.13, CN 103314860 A,2013.09.25, 文沛玲等.不同浓度6-BA对黑麦草种子出愈 率的影响. 草原与草坪 .2014,第34卷(第3期), 第20-23+30页. 审查员 王琼 (54)发明名称 一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法 (57)摘要 本发明涉及一种多年生黑麦草愈伤组织的 诱导方法， 包括以下步骤： 将多年生黑麦草种子 消毒处理。

3、并脱种皮， 再在3-5的无菌水中浸泡 7-9小时后接种于诱导培养基中进行愈伤诱导； 其中， 所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂 的MS培养基， 在所述诱导培养基中含有按质量体 积比计3.8-6.2mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6- BA和0-0.12g/L酸水解酪蛋白。 利用本发明所提 供的方法， 可以通过简单的操作步骤对多年生黑 麦草愈伤组织进行诱导， 不需要对种子进行划开 处理， 而且具有显著提高的出愈率和胚性愈伤 率。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 105684894 B 2017.11.14 CN 105684894 B 1.一种多年生黑麦草愈伤组织。

4、的诱导方法， 其特征在于包括以下步骤： 将多年生黑麦 草种子消毒处理并脱种皮， 再在3-5的无菌水中浸泡7-9小时后接种于诱导培养基中进行 愈伤诱导； 所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III； 其中， 所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基， 在所述诱导培养基中含 有按质量体积比计， 5.8-6.2mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA、 0.08-0.12g/L的酸水解酪 蛋白； 所述愈伤诱导的步骤包括： 在20-28下全黑暗培养67-77天， 全黑暗培养过程中每30- 35天换一次培养基继代一次， 共继代2次。 2.根据权利要求1所述的诱导方法， 其特征在于。

5、， 全黑暗培养7天后将种子发出的芽拔 除。 3.根据权利要求1或2所述的诱导方法， 其特征在于， 所述消毒处理并脱种皮的步骤包 括： 将多年生黑麦草种子4-5g置于含有浓度为1.2-1.8的吐温-80和8.5-9.5的次氯酸 钠的溶液中搅拌40-50min脱去种皮， 再用无菌水清洗3-6遍。 4.根据权利要求3所述的诱导方法， 其特征在于， 所述方法还包括在浸泡结束后用无菌 水将种子清洗2-3遍， 再用滤纸吸干种子表面的水分。 5.根据权利要求1或4所述的诱导方法， 其特征在于， 所述方法还包括在第一次继代时 统计出愈率， 在第二次继代时统计胚性愈伤率。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 C。

6、N 105684894 B 2 一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法 技术领域 0001 本发明涉及植物组织培养领域， 具体的， 涉及一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导 方法。 背景技术 0002 愈伤组织在草坪草的遗传转化中通常被用作受体材料， 用于农杆菌、 基因枪等介 导的遗传转化。 同时愈伤组织也是细胞悬浮培养和原生质体培养的原材料。 因此， 愈伤组织 培养是很多植物科学研究的基础材料， 也是植株再生体系建立和遗传转化体系建立的基 础。 0003 诱导愈伤组织的形成和形态发生， 是使一个离体的细胞、 一块组织或一个器官的 细胞， 通过脱分化最终形成愈伤组织的过程。 愈伤组织由外植体脱分化产生，。

7、 一些愈伤组织 为胚性的， 另一些为非胚性的。 它们可以通过形态和细胞结构加以区分， 胚性愈伤通常具有 易脆、 干燥、 有序， 颜色为白色或淡黄色。 胚性愈伤组织具有全能性， 经过进一步培养能分化 为再生植株， 而非胚性愈伤要分化则非常困难。 0004 目前现有的诱导愈伤组织技术体系中仍然存在一些问题和局限， 现有技术通常利 用成熟胚为外植体， 需显微镜下取成熟胚置于培养基上， 操作过程均较为繁琐和复杂、 愈伤 组织诱导率不高， 胚性愈伤获得率低； 而利用种子做外植体的方案通常需经过种子划破和 切割处理才能够提高愈伤组织诱导率， 同样具有操作过程繁琐的缺陷， 而且诱导率普遍低 于50。 因此，。

8、 需要继续摸索建立多年生黑麦草品种的愈伤组织诱导体系， 简化诱导过程， 提高愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织获得率。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术中存在的操作过程复杂、 诱导效率低下的缺陷， 提供一种操作过程简单， 愈伤组织诱导率和胚性愈伤组织获得率高的多年生黑麦草愈伤组 织的诱导方法。 0006 为了达到这一目的， 本发明提供了一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法， 包括 以下步骤： 将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮， 再在3-5的无菌水中浸泡7-9小时后 接种于诱导培养基中进行愈伤诱导； 0007 其中， 所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基， 在所述诱导培养基。

9、 中含有按质量体积比计3.8-6.2mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA和0-0.12g/L酸水解酪 蛋白。 0008 可选的， 所述多年生黑麦草种子的品种为高帽， 在所述诱导培养基中含有按质量 体积比计， 6mg/L的2,4D、 0.2mg/L的6-BA， 不含有酸水解酪蛋白。 0009 可选的， 所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III或夜影， 在所述诱导培养基中 含有按质量体积比计， 5.8-6.2mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA、 0.08-0.12g/L的酸水解 酪蛋白。 说 明 书 1/8 页 3 CN 105684894 B 3 0。

10、010 可选的， 所述多年生黑麦草种子的品种为德比极品， 在所述诱导培养基中含有按 质量体积比计， 3.8-4mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA、 0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白。 0011 可选的， 所述愈伤诱导的步骤包括： 在20-28下全黑暗培养67-77天， 全黑暗培养 过程中每30-35天换一次培养基继代一次， 共继代2次。 0012 可选的， 全黑暗培养7天后将种子发出的芽拔除。 0013 可选的， 所述消毒处理并脱种皮的步骤包括： 将多年生黑麦草种子4-5g置于含有 浓度为1.2-1.8的吐温-80和8.5-9.5的次氯酸钠的溶液中搅拌40-50m。

11、in脱去种皮， 再 用无菌水清洗3-6遍。 0014 可选的， 所述方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍， 再用滤纸吸干 种子表面的水分。 0015 可选的， 所述方法还包括在第一次继代时统计出愈率， 在第二次继代时统计胚性 愈伤率。 0016 利用本发明所提供的方法， 可以通过简单的操作步骤对多年生黑麦草愈伤组织进 行诱导， 不需要对种子进行划开处理， 而且具有显著提高的出愈率和胚性愈伤率。 附图说明 0017 图1是蒙特利种子诱导60天后获得的胚性愈伤组织。 0018 图2是德比极品诱导60天后获得的胚性愈伤组织。 具体实施方式 0019 下面将通过具体实施方式对本发明进行详细。

12、说明。 0020 本发明提供了一种多年生黑麦草愈伤组织的诱导方法， 所述方法包括以下步骤： 将多年生黑麦草种子消毒处理并脱种皮， 再在3-5环境下的无菌水中浸泡7-9小时后接种 于诱导培养基中进行愈伤诱导； 0021 其中， 所述诱导培养基是添加有植物生长调节剂的MS培养基， 在所述诱导培养基 中含有按质量体积比计3.8-6.2mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA和0.08-0.12g/L酸水解 酪蛋白。 0022 本发明所提供的方法选用多年生黑麦草种子作为外植体， 所述多年生黑麦草种子 至少选自夜影、 蒙特利、 高帽和德比极品中的一种。 0023 在本发明所提供的方法中。

13、， 在进行消毒处理前， 可以先对多年生黑麦草种子进行 筛选， 去除不实种， 具体的， 可以将种子浸泡在水中， 用清水冲洗掉漂浮的不实种， 将筛选出 的种子进行消毒处理。 0024 本发明中， 对于消毒处理并脱种皮的方法可以采用多种方式进行， 为了获得更好 的消毒效果， 本发明将多年生黑麦草种子置于含有1.2-1.8吐温-80和8.5-9.5次氯酸 钠的溶液中进行消毒， 优选的， 置于含有1吐温-80和9次氯酸钠的溶液中对种子进行消 毒。 为了在脱除种皮的过程中不对种子造成损伤， 可以加入磁力转子对溶液进行搅拌， 在搅 拌的过程中， 观察草种种皮脱离的情况， 直至大部分种子的种皮脱落漂离种子， 。

14、搅拌的时间 可以为40-50min， 优选的， 搅拌的时间可以为45分钟。 在脱皮结束后， 在利用无菌水对脱皮 后的种子清洗3-6遍。 在进行最后一遍清洗后， 不需要将无菌水倒出， 可以直接对脱皮后的 说 明 书 2/8 页 4 CN 105684894 B 4 种子进行浸泡， 具体的， 可以将盛放种子的容器进行密封以避免污染， 然后将密封后的容器 置于4的冰箱中超过8小时， 进行浸泡步骤。 0025 本发明所提供的方法还包括在浸泡结束后用无菌水将种子清洗2-3遍， 再用滤纸 吸干种子表面的水分。 具体的， 可以将清洗后的种子置于铺有4层无菌滤纸的培养皿中， 待 滤纸将种子表面的水分吸干后， 。

15、再将种子接种在诱导培养基中。 0026 值得注意的是， 本发明所提供的方法在接种时不需要对种子进行划破处理， 可以 直接将种子放置在诱导培养基上， 一般的， 可以按照每个平皿40粒种子的密度对种子进行 排布。 0027 在本发明所提供的方法中， 所述诱导培养基的制备方法可以为在MS培养基中加入 一定总量的2,4D、 6-BA和酸水解酪蛋白(AHC)后调解pH值至6-7后在121下高压灭菌 15min。 优选的， 所述诱导培养基的pH值为6。 0028 在本发明的一种实施方式中， 当所述多年生黑麦草种子的品种为高帽时， 为了获 得更好的诱导效果， 在所述诱导培养基中含有按质量体积比计， 6mg/。

16、L的2,4D、 0.2mg/L的6- BA， 不含有酸水解酪蛋白。 0029 在本发明的一种实施方式中， 当所述多年生黑麦草种子的品种为蒙特利III或夜 影时， 为了获得更好的诱导效果， 在所述诱导培养基中含有按质量体积比计， 5.8-6.2mg/L 的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA、 0.08-0.12g/L的酸水解酪蛋白。 0030 在本发明的一种实施方式中， 当所述多年生黑麦草种子的品种为德比极品时， 为 了获得更好的诱导效果， 在所述诱导培养基中含有按质量体积比计， 3.8-4mg/L的2,4D、 0.18-0.22mg/L的6-BA、 0.08-0.12g/L的酸水。

17、解酪蛋白。 0031 根据本发明， 所述愈伤诱导的步骤包括： 在20-28下全黑暗培养67-77天， 其中， 每25-35天更换培养基继代一次， 共继代2次。 优选的， 每30天继代一次， 继代所更换的诱导 培养基的成分不变。 为了及时了解愈伤组织诱导的情况， 所述方法还包括在第一次继代时 统计出愈率， 在第二次继代时统计胚性愈伤率。 其中， 出愈率(出愈数/外植体数) 100； 胚性愈伤率(胚性愈伤数/外植体数)100。 0032 在愈伤诱导过程中， 由于种子作为外植体进行愈伤组织诱导时发芽非常迅速， 需 要将种子发出的芽拔除， 一般的， 在全黑暗培养7天后开始将种子发出的芽拔除干净。 00。

18、33 利用本发明所提供的方法获得的愈伤组织为胚性愈伤组织。 0034 为衡量愈伤质量， 根据李书平的标准(李书平等， 1998)， 依其形态特征， 将愈伤组 织分为4种类型。 0035 类型1： 愈伤组织乳白色、 淡黄色， 新鲜， 质地中等， 易碎， 生长旺盛； 类型2： 愈伤组 织呈乳白色， 质地较松散， 生长较快； 类型3： 愈伤组织呈青白色， 透明水浸状， 生长缓慢； 类 型4： 愈伤组织呈白色， 顶部生有气生根， 生长迟缓。 类型1和2可认为是胚性愈伤组织。 0036 本发明所提供的方法还包括在获得愈伤组织后的后续处理步骤， 当将愈伤组织用 作多年生黑麦草农杆菌介导法的受体材料时， 在。

19、利用农杆菌对愈伤组织进行侵染前， 要对 愈伤组织进行预处理， 将愈伤组织转入新鲜的诱导培养基中进行预培养， 预培养的时间可 以为3-6天， 通过预培养步骤可以显著提高胚性愈伤的活性。 此处， 胚性愈伤活性测试是通 过基因枪遗传转化成功率定义的。 利用本发明所提供的方法培养出来的胚性愈伤组织进行 基因枪遗传转化， 成功率较高。 说 明 书 3/8 页 5 CN 105684894 B 5 0037 下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。 需要理解的是以下实施 例的给出进是为了起到说明的目的， 并不是用于对本发明的范围进行限制。 本领域的技术 人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下， 。

20、可以对本分发明进行各种修改和替换。 0038 以下实施例中： 0039 MS培养基的配方如表1所示： 0040 表1 0041 0042 夜影种子、 蒙特利种子、 高帽种子和德比极品种子均由北京绿冠种业发展有限 说 明 书 4/8 页 6 CN 105684894 B 6 公司提供。 0043 实施例1 0044 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0045 将4g蒙特利种子装在50ml的离心管里， 加入45ml的蒸馏水和5ml的次氯酸钠溶 液(9)， 加入吐温-80(终浓度为1)， 放入磁力转子， 在磁力搅拌器上， 搅拌45分钟， 至大 部分种子的种皮脱落飘至溶液上层。。

21、 过滤后得到的种子用无菌水清洗6遍后， 保持无菌水在 离心管中浸泡种子， 封好盖子， 放入4冰箱10小时。 0046 用MS培养基配置AHC浓度为0.1g/L、 6-BA浓度为0.2mg/L、 2,4D浓度为6mg/L的诱导 培养基， 将诱导培养基高压灭菌后放置于超净工作台静置降温后倒在培养皿中等待接种。 0047 将浸泡后的种子取出， 重新用无菌水清洗3遍后， 倒在铺有4层无菌滤纸的培养皿 中， 待滤纸吸干种子表面水份后， 按一盘40粒种子的数量在培养基上接种。 0048 将种子在25下全黑暗培养进行愈伤诱导30天后更新培养基进行继代一次， 统计 出愈率， 此后， 30天再继代一次， 共计6。

22、0天， 统计胚性愈伤率。 诱导过程中观察种子的出芽情 况， 及时将芽拔除。 将出愈率(愈伤组织诱导率， 简称出愈率)和胚性愈伤率列于表2。 蒙特利 种子诱导60天后获得的胚性愈伤组织见图1。 0049 实施例2 0050 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0051 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中2,4D的浓度为 6.2mg/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0052 实施例3 0053 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0054 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中2,4D。

23、的浓度为 5.8mg/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0055 实施例4 0056 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0057 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中6-BA的浓度为 0.18mg/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0058 实施例5 0059 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0060 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中6-BA的浓度为 0.22mg/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0061 实施例6 0062 本实施。

24、例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0063 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中AHC的浓度为 0.08g/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0064 实施例7 0065 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0066 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中AHC的浓度为 0.12g/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 说 明 书 5/8 页 7 CN 105684894 B 7 0067 实施例8 0068 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 006。

25、9 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 所诱导的多年生黑麦草种子为夜 影种子。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0070 实施例9 0071 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0072 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 所诱导的多年生黑麦草种子为高 帽种子， 培养基中不含有AHC。 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0073 实施例10 0074 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0075 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 所诱导的多年生黑麦草种子为德 比极品， 诱导培养基中2,4D的浓度为4m。

26、g/L。 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 德比极品诱导60 天后获得的胚性愈伤组织见图2。 0076 实施例11 0077 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0078 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 所诱导的多年生黑麦草种子为德 比极品， 诱导培养基中2,4D的浓度为3.8mg/L。 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0079 实施例12 0080 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中2,4D的浓度为 5.0mg/L。 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0081 实施例13 0082 按照与实施例10相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培。

27、养基中2,4D的浓度为 5.0mg/L。 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0083 实施例14 0084 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中不添加AHC。 出愈率 和胚性愈伤率列于表2。 0085 实施例15 0086 本实施例用于说明本发明所提供的黑麦草愈伤组织的诱导方法。 0087 按照与实施例9相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中6-BA的浓度为 0.22mg/L。 诱导培养60天， 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0088 对比例1 0089 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中2,4D的浓度为 6.4mg/L。 出愈率和胚性愈伤。

28、率列于表2。 0090 对比例2 0091 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中6-BA的浓度为 0.16mg/L。 出愈率和胚性愈伤率列于表2。 0092 对比例3 0093 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中不添加6-BA。 出愈 率和胚性愈伤率列于表2。 说 明 书 6/8 页 8 CN 105684894 B 8 0094 对比例4 0095 按照与实施例1相同的方法进行诱导， 不同的是， 诱导培养基中不添加2,4D。 出愈 率和胚性愈伤率列于表2。 0096 表2 0097 出愈率()胚性愈伤率() 实施例190.8390.83 实施。

29、例286.2286.22 实施例387.0787.07 实施例486.5986.59 实施例578.8578.85 实施例688.7688.76 实施例787.3887.38 实施例886.6786.67 实施例981.6781.67 实施例1075.8375.83 实施例1172.7272.72 实施例1281.6781.67 实施例1365.7265.72 实施例1471.271.2 实施例1570.1870.18 对比例164.6764.67 对比例270.5970.59 对比例347.0647.06 对比例420.3315.78 0098 通过将实施例1-15的结果与对比例1-4的结果。

30、进行对比可以看出， 利用本发明所 提供的方法进行多年生黑麦草愈伤组织诱导时， 出愈率和胚性愈伤率显著高于对比例所取 得的诱导效果。 0099 通过将实施例1的结果与实施例2和3的结果进行对比可以看出， 当2,4D的浓度为 本发明优选的浓度时， 获得的出愈率和胚性愈伤率更高。 0100 通过将实施例1的结果与实施例4和5进行对比可以看出， 当6-BA的浓度为本发明 优选的浓度时， 获得的出愈率和胚性愈伤率更高。 0101 通过将实施例10的结果与实施例11和13的结果进行对比可以看出， 当对德比极品 进行诱导时， 2,4D的浓度为本发明优选的浓度时， 获得的德比极品出愈率和胚性愈伤率更 高。 0。

31、102 通过将实施例9的结果与实施例15的结果进行对比可以看出， 当对高帽进行诱导 时， 诱导培养基中各原料的浓度为本发明优选的浓度时， 获得的高帽出愈率和胚性愈伤率 更高。 0103 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 说 明 书 7/8 页 9 CN 105684894 B 9 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 8/8 页 10 CN 105684894 B 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 11 CN 105684894 B 11 。