本申请为国际申请PCT/US2002/16464于2003年11月21日进入中 国国家阶段、申请号为02810355.6、发明名称为“化学修饰胰岛素的肺部 给药”的分案申请。
发明领域
本发明涉及通过吸入传送到肺部的具有生物活性的、亲水聚合物 修饰的胰岛素衍生物。同时还提供了这些衍生物的制备和给药方法。
发明背景
胰岛素是在正常(没有患糖尿病的)受试对象的胰腺β-细胞中产 生的一种多肽激素。人胰岛素是一个51个氨基酸的多肽激素，分子量 约为5800道尔顿。胰岛素分子由两条肽链组成(一条A链和一条B链)， 含有一个亚基内和两个亚基间二硫键。A链由21个氨基酸组成，而B 链由30个氨基酸组成。胰岛素的两条链形成了一种高度有序的结构， 在A链和B链中都有几个α-螺旋区。有趣的是，孤立的胰岛素链是没 有活性的。在溶液中，胰岛素可以以单体、二聚体或六聚体的形式存 在。在用于皮下治疗的高浓度制剂中胰岛素是六聚体，但是当它在体 液中被稀释后就变成单体形式了。胰岛素对于调节碳水化合物代谢、 降低血糖水平是必需的；胰岛素的全身性缺陷引起糖尿病。糖尿病病 人的生存依赖于频繁地、长期地施用胰岛素，以维持可以接受的血糖 水平。
现有的胰岛素制剂具有缺陷，在治疗糖尿病时可导致严重的医疗 并发症。例如，糖尿病人最经常使用的标准的锌胰岛素制剂是无活性 的六聚体胰岛素的微晶体悬浮液。微晶体的不溶性以及随后六聚体解 离为有活性的单体形式，会导致胰岛素吸收到血流中的延迟和受试对 象差异(F.Liu等，Bioconjugate Chem.，8，664-672(1997)；T.Uchio等， Adv.Drug Del.Rev.，35，289-306(1999)；K.Hinds等，Bioconjugate Chem.，11，195-201(2000))。胰岛素的制剂还受到物理不稳定性的困扰， 因为胰岛素趋于形成微丝和不溶性沉淀。对于打算在胰岛素泵中使用 的制剂来说，沉淀是特别重要的问题。配制的胰岛素还倾向于化学降 解，例如非酶促的脱氨作用，并形成高分子量的转化产物如共价结合 的胰岛素二聚体(Brange.J.等，Pharm.Res.，9，715-726(1992)；Brange J. 等，Pharm.Res.，9，727-734(1992))。已有重要的证据表明，对胰岛素的 免疫应答的发生可能是由于这些胰岛素的共价聚合物的存在(Robbins， D.C.等，Diabetes，36，838-841(1987))。此外，即使是高度纯化的人胰岛 素也具有轻微的免疫原性(Kim，同上)。
除了上面提到的制剂不稳定问题之外，从给药的观点来看，现有 的胰岛素疗法也有许多缺点。最常用的胰岛素给药方式是皮下注射， 通常是在腹部或大腿。胰岛素也可以通过静脉内或肌内方式给药。为 了将血糖维持在可以接受的水平，通常需要每天注射一次或两次胰岛 素，此外在需要时还要补充注射胰岛素。糖尿病的积极治疗可能需要 更频繁的注射，这时病人使用一个家庭诊断试剂盒严密地监测血糖水 平。出于多种考虑，以注射方式给药胰岛素是不受欢迎的。首先，许 多病人发现，根据维持可接受的血糖水平的需要而频繁地给自己注射 是相当困难和烦琐的。事实上，许多II型病人由于害怕扎针而不愿长 年连续使用胰岛素。这种不情愿可能导致不遵医嘱，在最严重的情况 下可能危及生命。此外，皮下注射的胰岛素的全身吸收相当慢，即使 是在使用快效胰岛素制剂的情况下，通常也需要45到90分钟。因此， 提供一种替代的胰岛素制剂和给药途径从而不需要自我注射，并能够 使胰岛素快速、全身性地发挥效用，是长期以来的一个目标。
已经探索了许多非注射的制剂，如口服或鼻吸制剂，但是，这些 努力的结果尚未导致开发出商业可用的基于口服或鼻吸的胰岛素给药 系统(Patton等，Adv.Drug Delivery Reviews，1，35(2-3)， 235-247(1999))，这主要是由于生物有效度非常低并且易变(Hilsted，J. 等，Diabetologia，38，680-684(1995))。尽管与吸收增强剂一起使用可以 增加生物有效度，但这些药剂可损伤粘膜。
但是，可吸入的胰岛素制剂已被开发，在克服上面提到的许多问 题方面表现得相当突出。例如，美国专利No.5,997,848(Patton等，Inhale Therapeutic Systems，Inc.(吸入治疗系统公司))描述了胰岛素的干粉 制剂，其(1)在室温下是化学和物理学稳定的，并且(2)当吸入时， 能够通过肺泡区的上皮细胞快速吸收到血液循环中。其中描述的这种 快效胰岛素制剂和方法不需要烦琐的自我注射，并且在一项为期三个 月的人体功效研究中显示，在I型和II型胰岛素依赖型糖尿病人中， 与皮下注射相比提供了同等的葡萄糖控制能力(Patton等，Adv.Drug Delivery Reviews，1，35(2-3)，235-247(1999))。Patton等描述的干粉胰岛 素制剂，在克服了制剂不稳定和病人不遵医嘱的问题的同时，为了有 效地控制葡萄糖水平，仍然需要频繁地(例如在就餐时)吸入胰岛素。 此外，这种基于快效可吸入胰岛素类型的制剂，对于I型和部分II型 糖尿病人，其典型的胰岛素用药方式仍然需要在就寝时注射一次长效 胰岛素。因此，仍然需要一种有活性的、可溶的、稳定的胰岛素类型， 它不需要频繁地用药，即是长效胰岛素制剂，最好通过吸入方式给药。
理想的长效胰岛素制剂的特征是起效非常缓慢，但效力持久、峰 值相对平缓。现有的长效可注射胰岛素制剂，例如ultralente(特慢的 锌胰岛素悬浮液)和鱼精蛋白锌胰岛素悬浮液，是非常不令人满意的。 这些制剂趋于出现高峰而不能提供低的基础的胰岛素浓度，并且不可 预测，一般作用的持续时间不超过大约一天。ultralente胰岛素具有长 的半衰期，使得很难确定它最适的剂量范围，而鱼精蛋白锌胰岛素由 于它的不可预测性及效力时间过长而很少使用(Goodman和Gilman， “The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗学的药理学基础)”， 第9版，Hardman和Limbird编辑，1996，第1500页)。其它已经探索 的不成功的长效可注射胰岛素制剂包括白蛋白结合的胰岛素和胰岛素 六聚体钴制剂(Hoffman，A.，Ziv，E.，Clin.Pharmacokinet，33(4)：285-301， (1997))。
许多长效肺部用胰岛素制剂也已被探索。其中包括含有相对于胰 岛素大大过量的脂质的脂质体(Liu.F-Y等，Pharm.Res. 10，228-232，(1983))、多孔的乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)胰岛素颗 粒(Edwards，D.A.等，Science 276(5320)，1868-1871(1997))，雾化的 PLGA纳米球(Kawashima，Y.等，J.Controlled Release，62(1-2)：279-287 (1999))和磷脂/鱼精蛋白胰岛素制剂(Vanbever，R.等，Proc.Control Rel. Bioact.Mater.，25，261-262(1998))。不幸的是，所有这些制剂都已被证 明是不令人满意的，或是由于当施用于大鼠时生物有效度低，或是由 于制剂不足。因此，长期以来仍存在对最适的长效胰岛素制剂的需求， 它们应该是具有生物活性的、物理学和化学稳定的、水溶性的并且最 好为单体。在理想情况下，这样的制剂最好适合于肺部给药。
发明概述
从一方面来说，本发明建立在胰岛素组合物的基础之上，该胰岛 素组合物可用于通过肺部深处向全身血液循环给药。具体来说，本发 明的组合物包含了一种结合物，由胰岛素共价结合到一个或多个非天 然存在的亲水聚合物分子上而形成。在一个优选实施方案中，共价结 合于胰岛素上的非天然存在的亲水聚合物是一种聚亚烷基二醇，例如 聚乙二醇(PEG)，尽管在此提出的所有实施方案也可以同等地用于其 它的非天然存在的亲水聚合物。
一般来说，本发明的胰岛素-聚合物结合物与天然胰岛素相比将表 现出改进的药代动力学和药效性质，特别是在肺部给药时。在一个实 施方案中，在此提供的PEG-胰岛素结合物在通过肺部和肺部深处给药 时，表现出良好的绝对的生物有效度。在一个特定的实施方案中，本 发明的PEG-胰岛素结合物的特征在于其具有高于天然胰岛素的绝对的 肺部生物有效度。在优选情况下，本发明的PEG-胰岛素结合物的特征 在于其具有高于天然胰岛素至少1.5-2.0倍的绝对的肺部生物有效度。 在更优选实施方案中，本发明的PEG-胰岛素结合物的特征在于其绝对 的肺部生物有效度高出大约15％，更优选情况下高出大约20％，或者 在最优选情况下高出大约30％。
在另一个实施方案中，本发明的PEG-胰岛素结合物当通过肺部给 药时，其Tmax值(达到最大浓度所需的时间)表现出至少1.5倍于天 然胰岛素，或在更优选情况下至少2或3倍于天然胰岛素，或更优选 情况下至少5倍于天然胰岛素。
本发明的结合物中使用的PEG可以具有几个不同的特点。在本发 明的一个实施方案中，在此描述的PEG-胰岛素结合物的聚乙二醇部分 在末端被一个惰性的或无反应性的末端基团所封闭，例如一个烷氧基、 或更具体地说一个甲氧基。
在另一个实施方案中，结合物的聚乙二醇部分将具有一个特别适 合于连接到胰岛素上的结构，包括线性的聚乙二醇和多枝化或支链的 聚乙二醇。在另一个实施方案中，一个PEG-胰岛素结合物可以含有两 个单官能衍生的胰岛素分子，它们之间由一个双活化的聚乙二醇连接 起来(胰岛素-PEG-胰岛素)。此外，在这个“哑铃”结构中的一个胰 岛素分子还可以被其它的PEG所修饰。
在另一个实施方案中，本发明的一个PEG-胰岛素结合物含有一个 分叉的聚乙二醇，在聚合物链的一端带有一个分支部分，还有两个连 接到分支部分上的游离的反应基(或多组两个基团)用于共价结合胰 岛素。在本发明的这个实施方案中，聚乙二醇的分支结构使得聚合物 链可以连接两个或多个胰岛素分子。
本发明的胰岛素结合物的聚乙二醇部分可任选含有一个或多个可 降解的连接。
一般来说，胰岛素通过位于PEG末端的一个连接部分共价结合到 PEG上。在本发明中使用的优选连接部分包括那些适合于与具有反应 性的胰岛素的氨基基团结合的部分，例如N-羟基琥珀酰亚胺活性酯、 活性碳酸盐、醛和缩醛。
在另一个实施方案中，本发明的结合物中共价结合于胰岛素上的 PEG将含有从大约两个到大约300个(OCH2CH2)亚基，在优选情况 下从大约4个到200个亚基，在更优选情况下从大约10个到100个亚 基。
在另一个实施方案中，共价结合于胰岛素上的PEG将具有名义平 均分子量从大约200到大约10,000道尔顿。在一个优选实施方案中， PEG将具有名义平均分子量从大约200到大约5000道尔顿。在一个更 加优选的实施方案中，PEG将具有名义平均分子量从大约200到大约 2000道尔顿或从大约200到大约1000道尔顿。
在一个特定的实施方案中，结合物的胰岛素部分含有天然的人胰 岛素。
在另一个实施方案中，本发明组合物中的结合物具有的纯度大于 大约90％(即在组合物的结合物部分中，有90％重量或以上为一种或 多种PEG-胰岛素)。也就是说，本发明的组合物其特征为含有高纯度 的结合的胰岛素成分，即组合物中不存在可以检测量的游离聚乙二醇 物种和其它与PEG相关的杂质。
在一个实施方案中，本发明的一种组合物含有一种结合物，其中 胰岛素在其一个或多个氨基位点上与PEG共价结合。本发明的一种组 合物中包含的胰岛素可以是单取代的(即只有一个PEG共价结合到其 上)。根据本发明，特定的单取代PEG-胰岛素结合物含有一个共价结 合到胰岛素分子上的聚乙二醇部分，结合位置选自PheB1、GlyA1和 LysB29。
在一个优选实施方案中，PEG部分共价结合在胰岛素的PheB1位 点上。在一个实施方案中，胰岛素上至少大约75％的B-1Phe位点与PEG 共价结合。在另一个实施方案中，胰岛素上至少大约90％的B-1Phe位 点与PEG共价结合。
本发明的组合物也可以含有一种混合物，它由具有上述一个或多 个特征的单结合和双结合的PEG-胰岛素组成。这样的组合物还可以含 有三结合的PEG-胰岛素。
在另一个实施方案中，本发明的一种PEG-胰岛素结合物的特征在 于其相对于非PEG化的或天然的胰岛素，蛋白水解速率降低。
本发明的一种组合物还可以含有PEG-胰岛素结合物与非化学修 饰的或天然的胰岛素的混合物。
此外，上述的组合物是雾化形式的。
本发明的组合物可以溶解或悬浮在液体中，或为干燥形式，此外 也可以含有可药用的赋形剂。
此外，在此还提供了一种生物活性的聚乙二醇-胰岛素结合物，它 适合于通过吸入给药到肺部深处。
在另一方面，本发明提供了一种将PEG-胰岛素结合物传送到需要 它的哺乳动物受试对象中的方法，通过吸入前述的雾化形式的PEG-胰 岛素组合物而给药。
在另一方面，本发明还提供了一种方法，用于提供一种通过肺部 给药的基本上非免疫原性的胰岛素组合物。该方法包括下列步骤：如 此所述将胰岛素共价结合到一个或多个非天然存在的亲水聚合物结合 物的分子上，然后通过吸入将组合物给药到受试对象的肺部，结果胰 岛素通过肺部进入到血液循环中。
在另一方面还提供了一种方法，用于提供一种可给药到人类受试 对象肺部的长效的胰岛素组合物。该方法包括：将胰岛素共价结合到 一个或多个非天然存在的亲水聚合物上从而提供了一种含有胰岛素-亲 水聚合物结合物的组合物，然后通过吸入将该组合物给药到受试对象 的肺部。在给药步骤中，胰岛素通过肺部进入血液循环，在给药后血 液中升高的胰岛素水平可以维持至少8小时。
本发明的PEG-胰岛素结合物，当雾化并通过吸入给药后，可用于 治疗糖尿病(DM)。
当阅读了下面的详细描述后，本发明的这些和其它的目的和特点 将会变得更加一目了然。
附图简述
图1是一个示例的PEG-胰岛素结合物(“750-2PEG胰岛素”)与 一个未修饰的胰岛素对照的酶解速率图，在实施例6中详细描述；
图2是静脉内给药示例的PEG化的(5K PEG胰岛素)与非PEG 化的胰岛素组合物后，血清中的平均胰岛素浓度图(在实施例7中详 细描述)；
图3是静脉内给药示例性PEG化的(5K PEG胰岛素)与非PEG 化的胰岛素组合物后的血糖浓度图(在实施例7中详细描述)；
图4是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(每只动物150μg 5K PEG 胰岛素)与非PEG化的人胰岛素(每只动物40μg)后，血清中的平均 胰岛素浓度图(实施例8)；
图5是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(每只动物150μg 5K PEG 胰岛素)与非PEG化的人胰岛素(每只动物40μg)后的平均血葡萄糖 浓度图(实施例8)；
图6是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(750-1PEG胰岛素)与 非PEG化的人胰岛素后，血清中的平均胰岛素浓度图(实施例9)；
图7是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(750-1PEG胰岛素)与 非PEG化的人胰岛素后的平均血糖浓度图(实施例9)；
图8是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(750-1PEG胰岛素，每 只动物80和160μg)与非PEG化的人胰岛素(每只动物80μg)后，血 清中的平均胰岛素浓度图(实施例10)；
图9是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(750-1PEG胰岛素，每 只动物80和160μg)与非PEG化的人胰岛素(每只动物80μg)后的平 均血糖浓度图(实施例10)；
图10是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(750-2PEG胰岛素，每 只动物80μg)与非PEG化的人胰岛素(每只动物80μg)后，血清中的 平均胰岛素浓度图(实施例11)；
图11是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(750-1PEG胰岛素，每 只动物80μg)与非PEG化的人胰岛素(每只动物80μg)后的平均血糖 浓度图(实施例11)；
图12是在雄性大鼠气管内滴注PEG化的(2K PEG胰岛素，每只 动物300μg、600μg、900μg和1200μg)与非PEG化的人胰岛素(每只 动物80μg)后的平均血糖浓度图(实施例12)；
图13是静脉内给药示例性PEG化的(2K PEG胰岛素)与非PEG 化的胰岛素组合物后，血清中的平均胰岛素浓度图(在实施例13中详 细描述)；以及
图14是静脉内给药示例性PEG化的(2K PEG胰岛素)与非PEG 化的胰岛素组合物后的平均血糖浓度图(在实施例13中详细描述)。
发明详述
为了通过肺部给药到肺，各种代表性的PEG-胰岛素结合物的设 计、合成和表征已被最适化。尽管PEG-胰岛素分子的制备在以前已有 描述，但利用与PEG的共价结合来提供长效的可吸入的胰岛素制剂， 在以前尚未被证实。因此，本申请人所面对的挑战，是提供PEG-胰岛 素结合物，其中共价结合在胰岛素分子上的PEG链具有最适的均衡数 目、位置、结构和分子量，从而提供适合于给药到全身循环系统中， 最好是通过肺部深处给药的胰岛素组合物。从前面的描述可以看到， 令人吃惊的是，本发明人发现了某些PEG-修饰的胰岛素制剂具有下述 一个或多个特点：(1)它们是生物活性的，即表现出至少大约5％的天 然胰岛素活性，或在优选情况下其生物活性与天然胰岛素相比至少或 是基本维持或是仅仅略有减少，或者在更优选情况下，其活性比天然 胰岛素高；(2)它们从肺部吸收进入血流(与“粘附”在肺部相反)； (3)它们是化学和物理学稳定的；(4)它们在通过肺部给药时，可以 在给药后将血液中的胰岛素水平升高到基准值以上至少大约8个小时； (5)它们对胰岛素降解酶的酶解攻击具有抗性；并且(6)在通过吸 入给药时，它们表现出的半衰期长于非PEG化的胰岛素。当阅读了下 面的描述后这些特点的详细情况将变得明显。
I、定义
在此所用的下列术语具有指定的意义。
除非在上下文中有清楚的说明，在说明书和附录的权利要求书中， 单数形式均包括了复数的概念。
在此所用的“胰岛素”其意义包括了前胰岛素，并包含了任何具 有天然胰岛素的部分或全部一级结构构象(也就是说连续的氨基酸残 基序列)和至少一种生物学性质的纯化的、分离的多肽。总而言之， 术语“胰岛素”其意义包括天然的和合成衍生的胰岛素，包括其糖结 合形式，以及其类似物，包括具有一个或多个氨基酸修饰(缺失、插 入或替代)的多肽，只要它们基本上保留了全长胰岛素(在用本文所 述的亲水的、非天然存在的聚合物进行化学修饰之前)的至少80％或 以上的治疗活性。本发明的胰岛素可以通过任何标准的方式生产，包 括但不限于胰腺提取、重组表达和体外多肽合成。天然或野生型胰岛 素是指其氨基酸序列与自然界中发现的胰岛素的氨基酸序列相对应的 胰岛素。天然或野生型胰岛素可以天然地(即从天然来源分离)或合 成地生产。
“生理上可裂解的”或“可降解的”键是在生理条件下可以与水 反应(即被水解)的弱键。在优选情况下是指在pH8和25℃下水解半 衰期少于大约30分钟的键。一个键在水中水解的趋势不仅依赖于连接 两个中心原子的键的一般类型，而且依赖于结合在这些中心原子上的 取代基。合适的水解不稳定的或弱的键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、 酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基酯、亚胺、邻位酯、肽和寡核苷酸。
“水解稳定的”连接或键是指一个化学键，一般来说是共价键， 它在水中基本稳定，也就是说在生理条件下，在一段较长的时间内， 不会发生任何可以感觉到的水解。水解稳定的键的例子包括但不限于 下列的键：碳-碳键(例如在脂族链中)、醚键、酰胺键、氨基甲酸乙酯 等。一般来说，水解稳定的键在生理条件下表现出的水解速率小于每 天大约1-2％。代表性的化学键的水解速率可以在大多数标准化学教科 书中找到。
在此所用的“PEG”或聚乙二醇其意义包括任何水溶性的聚环氧 烷烃。在最典型的情况下，本发明中所用的PEG含有下列结构： “-CH2CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2-”，其中末端基团或整个PEG部分的 实际结构可以变化。一种常用的PEG是末端封闭的PEG，其中PEG的 一个末端被一个相对无活性的基团封闭，一般是烷氧基团如甲氧基 (-OCH3)，而另一个末端是一个羟基基团，它易于进行随后的化学修 饰。用于制备本发明的胰岛素结合物的特殊的PEG形式，如分支的、 线性的、分叉的PEG等，将在后面更详细地描述。
“PEG-胰岛素结合物”是指一个胰岛素分子(如前所定义)，其上 共价地连接或结合了至少一个聚乙二醇部分，并具有任何可检测程度 的胰岛素活性(例如天然胰岛素大约2％到大约100％或以上的生物活 性)。
在涉及到本发明亲水的非天然存在的聚合物如PEG时，“名义平 均分子量”是指聚合物的质量平均分子量，一般由孔径排阻层析、光 散射或在1，2，4-三氯苯中的内禀速度来确定。本发明的聚合物一般是多 分散的，具有小于大约1.05的低的多分散性。
“亲脂部分”是一个基团，当通过一个可降解的或不可降解的键 与本发明的亲水聚合物结合时，对于基本上改变聚合物及聚合物-胰岛 素结合物的亲水特性是有效的。典型的亲脂基团如脂肪酸可以含有大 约12到22个碳原子。
本发明的“基本非免疫原性的”胰岛素结合物与天然胰岛素相比 具有减少的免疫原性。免疫原性可以通过将PEG-胰岛素结合物相对于 未修饰的胰岛素给药小鼠，或最好是兔子后，测定抗体的滴度来进行 评估。
“烷基”是指碳氢链，一般长度范围为大约1个到15个原子。碳 氢链最好但不必需是饱和的，可任选含有其它结合在其上的官能团。 碳氢链可以是支链的也可以是直链的。烷基的例子包括乙基、丙基、 1-甲基丁基、1-乙基丙基和3-甲基戊基。在本发明的一个优选实施方案 中，含有一个烷基化的PEG，特别是一个线性的烷基化的PEG的结合 物，是指具有一个不是脂肪酸或其它亲脂部分的烷基部分的结合物。
“低级烷基”是指含有1到5个碳原子的的烷基基团，可以是直 链的或是支链的，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
“绝对的肺部生物有效度”是传送到哺乳动物肺部的药物剂量(例 如本发明PEG-胰岛素结合物)与天然胰岛素静脉内剂量相比被吸收和 进入血液循环的百分数。用于测定绝对的肺部生物有效度的具有代表 性的模型系统包括大鼠、狗、兔和猴。从一方面来说，本发明的可吸 入的PEG-胰岛素组合物，其特征为在血浆或血液中绝对的肺部生物有 效度为至少大约20％，通常绝对的肺部生物有效度范围从大约10％到 30％或更高。总的来说，根据PEG-胰岛素结合物的特定性质，本发明 的结合物具有至少大约下列之一的绝对的肺部生物有效度：10％、12％、 15％、18％、20％、22％、25％、30％、32％、35％或更高。绝对的肺部 生物有效度可以通过测量PEG-胰岛素结合物组合物被直接气管内给 药、滴注或吸入后产生的吸收值来进行估计。
在涉及PEG-胰岛素结合物的半衰期时，“分配阶段”是指胰岛素 开始快速从血浆中消失的阶段。末端缓慢或清除阶段半衰期是指胰岛 素从身体中被清除的缓慢阶段。
“长效”胰岛素是指效用(即在基准值以上的升高的血液中水平) 持续时间至少大约6小时，在优选情况下至少大约8小时的胰岛素。
“被抑制的葡萄糖水平”是指被抑制在基准值或基本水平以下的 血糖水平(例如在施用本发明的PEG-胰岛素结合物后)。
“可药用的盐”包括但不限于氨基酸盐，用无机酸制备的盐，如 氯化物、硫酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、氢溴酸盐和硝酸盐，或用有机 酸制备的盐，如苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、反丁烯二酸盐、酒石酸盐、 琥珀酸盐、乙基琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、 苯甲酸盐、抗坏血酸盐、对甲苯磺酸盐、棕榈酸盐、水杨酸盐和硬脂 酸盐、以及estolate、葡庚糖酸盐(gluceptate)和乳糖酸盐(lactobionate)。 同样地，含有可药用的阳离子的盐包括但不限于钠、钾、钙、镁、铝、 锂和铵(包括取代的铵)盐。
“氨基酸”是指任何同时含有一个氨基基团和一个羧酸基团的化 合物。尽管氨基基团通常出现在与羧基官能团相邻位置上，但它也可 以位于分子内任何位置。氨基酸也可以含有其它的官能基团，例如氨 基、硫代基、羧基、氨甲酰基、咪唑基等。氨基酸可以被合成或天然 形成，可以以消旋体或光学活性(D-或L-)的形式使用，包括含有各 种比例的对映体。
“肽”由两个或多个通过肽键连接起来的氨基酸组成。肽可以是 同源的肽或异源的肽(即由相同的或不同的前述氨基酸残基组成)，其 长度可以在两个氨基酸到几百个氨基酸之间变化。
“干粉”是指一般含有不足大约10％水分的粉状组合物。
“适合于肺部传送的”组合物是指能够被雾化并被受试对象吸入， 从而使雾化微粒的一部分到达肺部并穿入到下呼吸道和肺泡中的组合 物。这样的组合物被认为是“可呼吸的”或“可吸入的”。
“雾化”微粒是悬浮于气体中的液体或固体颗粒，一般是通过致 动(或启动)一个吸入装置，如干粉吸入器、喷雾器、计量的吸入器 或雾化器而产生。
“发射剂量”或“ED”为一个适当的吸入器装置在启动或分散事 件后从中传送的药物制剂提供了指示。更具体地说，对于干粉制剂， ED是从一个单位剂量包中取出的与从吸入装置的喷嘴中喷出的粉末 的百分比的度量。ED被定义为吸入装置传送的剂量与额定剂量(即在 启动前放置在适当的吸入装置中的每个单位剂量的粉末质量)的比率。 ED是一个由实验确定的参数，一般使用一个被设计用来模拟病人用药 的体外装置来测定。为测定ED值，额定剂量的干粉，一般以单位剂量 的形式被放置在一个适当的干粉吸入器中(例如在美国专利No. 5,785,049中描述的吸入器，命名为吸入治疗系统)，然后启动装置发射 粉末。接着通过真空将产生的烟雾云从此装置中抽出，并被连接在装 置喷嘴上的一个配衡滤器捕捉。到达过滤器的粉末的量组成了发射剂 量。例如，对于放置在吸入装置中的含5mg干粉的剂量，如果粉末发 射后在上述配衡滤器上回收了4mg粉末，那么干粉制剂的发射剂量是： 4mg(传送的剂量)/5mg(额定剂量)×100％＝80％。对于非均质的 粉末，ED值为启动后从一个吸入装置传送药物而不是干粉提供了指 示，其基于药物的量而不是总粉末的重量。同样地，对于MDI和雾化 器传送形式，ED对应于从传送形式中取出的与从吸入装置的喷嘴中喷 出的药物的百分比。
“细小颗粒剂量”或“FPD”被定义为气动粒径在3.3μm以下的 粉末颗粒的质量百分比，一般通过在Anderson阶式碰撞采样器中测量 来确定。这个参数为具有最大潜力能够到达病人肺部深处以全身地吸 收药物成分的颗粒的百分比提供了一个指示。
“可分散的”或“分散的”粉末是指ED值为至少大约30％，更 优选是40-50％，以及更优选甚至是至少大约50-60％或更高的粉末。
“质量中值粒径”或“MMD”是平均粒径的度量，这是由于本发 明的粉剂一般是多分散的(即由一定范围内的粒径组成)。尽管任何常 用的技术都可用于测量平均粒径(例如电子显微镜、光散射、激光衍 射)，在此报告的MMD值是通过离心沉降测定的。
“质量中值气动粒径”或“MMAD”是被发散颗粒的气动粒径的 度量。气动粒径用于描述雾化粉末的沉降行为，是在空气中与微粒具 有同样的沉降速度的单位密度球体的直径。气动粒径含盖了微粒的形 状、密度和微粒的物理大小。在此所用的MMAD，除非另有指明，是 指通过阶式碰撞采样器确定的雾化粉末的气动粒径分布的中点或中 值。
“可药用的赋形剂或载体”是指可任选包含在本发明组合物中的 赋形剂。用于吸入的组合物中优选的赋形剂是那些能够被带入肺部， 并且对受试对象，特别是受试对象的肺部没有明显毒副作用的赋形剂。
“药物有效量”或“生理有效量”是为了在血流中提供预期的胰 岛素水平以达到目标血糖水平而需要的，在此描述的治疗组合物中存 在的PEG-胰岛素结合物的量。准确的量依赖于许多因素，例如特定的 PEG-胰岛素、所用的传送装置、治疗组合物的成分和物理性质、预期 的病人数量、病人的因素等等，可以由本领域技术人员根据提供的信 息容易地确定。
II、亲水的非天然存在的聚合物-胰岛素结合物
根据本发明已经制备了几种示例性的PEG-胰岛素结合物。尽管在 本发明的结合物中聚乙二醇是优选的聚合物，但是其它水溶性的、亲 水的、非天然存在的聚合物也可以使用。其它适合于在本发明中使用 的聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰基吗啉、聚唑 啉和聚氧乙基化多元醇如聚氧乙基化甘油、聚氧乙基化山梨醇和聚氧 乙基化葡萄糖。也可以使用从上述水溶性聚合物中选择的含有亚基或 亚基嵌段的聚合物。此外，聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物也可以使用。 在优选情况下，本发明的聚合物基本不含脂肪酸基团或其它亲脂部分。
下文阐述了通过仔细地选择一种或多种PEG部分、PEG化试剂、 胰岛素PEG化位点、PEG化条件及后续的结合物纯化，可以获得具有 预期临床性质(改进的药代动力学和/或药效性质)的PEG-胰岛素组合 物。现在将提供本发明的PEG-胰岛素结合物的特殊特征。
A、聚合物和产生的结合物的结构特征
本发明的PEG-胰岛素结合物一般含有一个或多个PEG链，每个 链的分子量从大约200到大约40,000道尔顿，在优选情况下从大约200 到大约10,000道尔顿。在优选情况下，本发明中使用的PEG所具有的 平均分子量将位于下列范围之一：从大约200到10,000道尔顿，从大 约200到大约7,500道尔顿，从大约200到大约6,000道尔顿，从大约 200到大约5,000道尔顿，从大约200到大约3000道尔顿，从大约200 到大约2000道尔顿，以及从大约200到大约1000道尔顿。在实施例 1-4中提供了用具有分子量为5,000道尔顿、2,000道尔顿和750道尔顿 的PEG制备的结合物的例子。
优选的给药到肺部的PEG-胰岛素将具有分子量小于大约5000道 尔顿、优选小于大约2000道尔顿、以及甚至小于大约1000道尔顿的 PEG部分。在本发明的一个特定的实施方案中，PEG-胰岛素结合物中 的PEG部分具有下列平均分子量之一：200、300、400、500、600、750、 1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或5000。在某些情况下， 不倾向使用较高分子量的PEG，这是由于它们具有使胰岛素分子失去 活性或在肺部用药时通过肺的有效性降低(实施例8)的潜在可能性。
由于较高的生物有效度倾向于选择较低分子量的PEG，但高分子 量的PEG链，例如平均分子量为5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、 30,000或40,000道尔顿或更高的PEG链，尽管一般认为减少了天然胰 岛素的生物有效度，但倾向于增加半衰期，特别是在可注射的制剂中。 也就是说对于一个高分子量的PEG-胰岛素(相对于天然胰岛素而言)， 药代动力学参数如曲线下的面积(AUC)的显著提高，可以补偿它活 性的损失。
至于亚基的数量，本发明使用的PEG一般含有的(OCH2CH2)亚 基的数量在下列一个或多个范围之内：2到大约900个亚基、从大约4 个到大约200个亚基、从大约4个到大约170个亚基、从大约4个到 大约140个亚基、从大约4个到大约100个亚基、从大约10个到大约 100个亚基、从大约4个到大约70个亚基、从大约4个到大约45个亚 基和从大约4个到大约25个亚基。
本发明的PEG-胰岛素结合物可以是单取代的(也就是说，一个 PEG结合到一个单一的具有反应性的胰岛素位点上)、双取代的(具有 结合到两个反应活性位点上的PEG部分)、三取代的或者，甚至有聚合 物结合到胰岛素分子上的三个以上的位点上。在此单取代、双取代和 三取代胰岛素也分别指PEG单体、二聚体和三聚体。多取代的胰岛素 (指具有共价结合于两个或多个胰岛素位点上的PEG部分的胰岛素) 一般来说在每个反应活性位点上结合的PEG部分是相同的，尽管并不 是必需这样。也就是说，具有超过一种以上类型的结合到胰岛素上的 PEG部分的PEG-胰岛素组合物是可以预期的。就本发明而言，优选的 组合物是那些主要含有单体和/或二聚体胰岛素结合物的组合物。令人 吃惊的是，已经发现非位点特异的PEG-胰岛素组合物(包括具有共价 结合到一个以上的反应活性位点上的PEG的PEG-胰岛素物种的混合 物)具有高于天然胰岛素的药代动力学和药效性质，特别是当在肺部 给药时(实施例11)。
就PEG取代的位置而言，胰岛素分子具有几个位点适合于PEG 化，一般来说更优选氨基位点，但这不是必需的。适合于PEG化的特 定的胰岛素氨基基团包括两个N-末端GlyA1和PheB1，以及LysB29。 胰岛素分子上的这些位点在本文中也分别被称为A1、B1和B29。用于 连接到胰岛素上的反应性氨基基团上的亲电活化的PEG包括 mPEG2-ALD、mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸、mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸、 mPEG-CM-HBA-NHA、mPEG-苯并三唑碳酸、mPEG-乙醛二乙缩醛等 (Shearwater Corporation，Huntsville，Alabama)。
在一个实施方案中，本发明的一种组合物可以主要含有(超过 90％)单取代的胰岛素，例如单A1胰岛素、单B1胰岛素或单B29胰 岛素。这样的组合物可以含有：1)单A1胰岛素，2)单A1胰岛素和 单B1胰岛素的混合物，或3)单A1胰岛素、单B1胰岛素和单B29 胰岛素的混合物。此外，本发明的组合物可以主要含有双取代的胰岛 素，例如双-A1，B1-胰岛素或双-A1，B29-胰岛素或双-B1，B29-胰岛素或其 任何不同的组合。
此外，本发明的组合物可以含有不同PEG-胰岛素结合物的混合物 (即PEG结合在可能的结合位点的任何一种组合上)。以胰岛素上的氨 基位点为例，本发明的组合物可以含有下列PEG-胰岛素结合物中的任 何一种或多种：单A1-PEG胰岛素、单B1-PEG胰岛素、单B29-PEG 胰岛素、双-A1，B1-胰岛素、双-A1，B29-胰岛素、双-B1，B29-胰岛素或三 -A1，B1，B29-胰岛素。在一个实施方案中，优选主要含有单体和二聚体 的组合物。代表性的组合物可以包括含有至少大约75％组合的单体和 二聚体、至少大约80％组合的单体和二聚体或至少大约85-90％组合的 单体和二聚体的PEG-胰岛素结合物混合物(如实施例5和6)。
PheB1是结合PEG进行化学修饰的特别优选的位点。特别是在一 个实施方案中，用于本发明的PEG-胰岛素结合物组合物，具有这样的 特征：不论在组合物中PEG-胰岛素物种的总数如何，其中胰岛素上至 少大约70％的B-1位点被PEG共价结合(例如，表3A，实施例5)。 其它的实施方案包括下列组合物，其中胰岛素上至少大约75％的B-1 位点被PEG共价结合或其中胰岛素上至少大约80％的B-1位点被PEG 共价结合或其中胰岛素上至少大约90％的B-1位点被PEG共价结合。
令人吃惊的是，本发明人已经发现PEG-胰岛素的随机混合物(通 过随机而不是定点的PEG化而制备)，当给药到肺部时，使血液中升高 的胰岛素水平可以维持至少6小时，更典型的情况下为给药后维持至 少8小时或更长时间。这样的混合物具有优势，不仅因为它们更好的 药代动力学和药效性质，而且因为它们的合成比相应的位点特异的方 法更加简单(不需要多个合成步骤，不需要使用保护基团，不需要多 步纯化等)。
在天然胰岛素分子上可以通过共价结合PEG而进行化学修饰的其 它位点包括2个C-末端、Arg22B、His10B、His5A、Glu4A、Glu17A、 Glu13B和Glu21B。
除了天然胰岛素，具有一个或多个氨基酸替代、插入或缺失的非 天然胰岛素也可以加以使用，以便其他位点可用于连接一个或多个 PEG部分进行化学修饰。本发明的这个实施方案对于在胰岛素分子内 引入其他定制的PEG化位点尤其有用，例如，用于形成对酶解有更高 抗性的PEG-胰岛素。这样的方法提供了更高的灵活性，可用于设计具 有所需均衡的活性、稳定性、溶解性和药物学性质的最适化的胰岛素 结合物。尽管在胰岛素分子内任何数量的位点上都可以进行突变，即 位点特异的诱变，但最优选的胰岛素突变体是B链上的前4个氨基酸 中的任何一个被一个半胱氨酸残基取代。这样的半胱氨酸残基然后可 以与一个和巯基基团特异性反应的活化的PEG进行反应，例如在美国 专利No.5,739,208和国际申请公开No.WO 01/62827中描述的N-顺丁 烯二酰亚胺基聚合物或其它衍生物。用在本发明的这个特定的实施方 案中的巯基选择性PEG包括mPEG-分支的顺丁烯二酰亚胺 (mPEG(MAL)2)、mPEG2-分支的顺丁烯二酰亚胺(mPEG2(MAL)2)、 mPEG-顺丁烯二酰亚胺(mPEG-MAL)和mPEG2-顺丁烯二酰亚胺 (mPEG2-MAL)(Shearwater Corporation)。这些活化的PEG的结构分 别如下：mPEG-CONHCH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL]、 mPEG2-赖氨酸-NH-CH[CH2CONH(CH2CH2O)2CH2CH2-MAL]2、 mPEG-MAL和mPEG2-赖氨酸-NH-CH2CH2NHC(O)CH2CH2MAL。
如果需要，也可以使用天然胰岛素序列的其它突变，以提高其生 物学活性在PEG化后有所损失的PEG-胰岛素结合物的生物活性。一个 这样的突变是8位的苏氨酸变为组氨酸。其它的突变可以在例如 Diabetes Care，13(9)，1990中找到，其内容在此引为参考。
在本发明中使用的PEG可以具有不同的结构：线性的、分叉的、 分支的、哑铃状的等等。一般来说，PEG用一个适当的活化基团进行 活化，以适合于结合在胰岛素分子的一个或多个预期位点上。活化的 PEG在一端具有一个反应基以与胰岛素反应。在此所用的术语“接头”， 其意义包括位于PEG末端与胰岛素反应的活化基团，还可以进一步包 括位于聚合物的PEG部分与末端的活化基团之间的其它(一般为惰性) 原子，以使活化的PEG的制备简便。接头可以含有多种原子中的任何 一种，但是，优选的接头含有介于PEG骨架和末端活化基团之间的亚 甲基，例如在mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸和mPEG-丁酸中那样。代表性 的活化的PEG衍生物和将这些试剂与药物如胰岛素结合的方法在本领 域内是广为人知的，进一步的描述可以参见Zalipsky，S.等在 “Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications(聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用)”中的“Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides (使用功能化的聚乙二醇进行多肽修饰)”，J.M.Harris编，Plenus出 版社，New York(1992)，以及Advanced Drug Reviews，16：157-182 (1995)。
在本发明的一个特定的实施方案中，结合物的PEG部分缺少对显 著修饰聚合物或聚合物-胰岛素结合物的水溶性性质有效的一个或多个 亲脂基团。也就是说，本发明的结合物的聚合物或非胰岛素部分可以 含有一组原子，与亲水原子相比它们被认为是更亲脂的(例如具有从 大约2个到8-12个碳原子的碳链)，但是，如果这样的一个或多个基团 的存在对显著改变聚合物或结合物的亲水性质无效，那么这样的部分 可以包含在本发明的结合物中。也就是说，本发明的胰岛素结合物本 身的特征是亲水的，而不是亲脂的或两亲的。一般来说，一个胰岛素 结合物的聚合物部分在结合到胰岛素之前，不论是否含有亲脂基团， 总具有高的亲水/亲脂差额(HLB)数。HLB数是基于分子中每种类型 基团(亲水的或亲脂的)的重量百分数，其值的范围一般在大约1-40。 用于本发明结合物的聚合物，总得来说其特征为亲水的，不管是否存 在一个或多个亲脂取代基。在本发明的一个实施方案中，聚合物-胰岛 素结合物的聚合物部分，其特征为HLB数大于25，更优选情况下大于 30，或更优选情况下甚至大于35。在本发明的某些实施方案中，亲脂 部分可以存在，但在优选情况下此部分不位于PEG链的一个末端。
用于本发明的结合物中的分支的PEG包括在国际专利公开WO 96/21469中描述的那些，以其全文内容在此专门引为参考。一般来说， 分支的PEG可以用通式R(PEG-OH)n来表示，其中R代表中央的“核 心”分子，n代表臂的数目。分支的PEG具有一个中央的核心，从其 上伸出两个或多个PEG臂。在分支构型中，分支的聚合物核心具有一 个单一的反应活性部位以与胰岛素结合。用于本发明的分支的PEG一 般含有少于4个PEG臂，在更优选情况下含有少于3个PEG臂。分支 的PEG提供了一些优点：具有单一的反应活性部位，与它们的线性PEG 对应物相比与更大的更浓密的聚合物云结合。一种特殊类型的分支 PEG可以用(MeO-PEG-)pR-X表示，其中p等于2或3，R是其上连接 有2或3个PEG臂的中央核心结构如赖氨酸或甘油，以及X代表任何 适当的被活化的或能够被活化的以连接胰岛素的官能团。一个特别优 选的分支PEG是mPEG2-NHS(Shearwater Corporation，Alabama)，它具 有mPEG-赖氨酸-琥珀酰亚胺的结构。
在另一个分支结构中，“悬垂PEG”的反应基可以将蛋白沿着PEG 骨架定位结合，而不是象在前面的例子中那样结合在PEG链的末端。 从PEG骨架延伸出来用于结合胰岛素的反应基可以是相同的，也可以 是不同的。悬垂PEG结构可能是有用的，但一般不倾向使用，特别是 对于吸入组合物。
此外，PEG-胰岛素结合物的PEG部分可以含有一个分叉的结构， 在聚合物链的一端带有一个分支部分，还有两个连接到分支部分上的 游离的反应基(或任意2的倍数)用于结合胰岛素。分叉的PEG的例 子在国际专利公开No.WO 99/45964中有描述，其内容在此专门引为参 考。分叉的聚乙二醇还可任选在聚合物链的相反末端包含一个烷基或 “R”基团。更具体来说，本发明的分叉的PEG-胰岛素结合物的通式 为：R-PEG-L(Y-胰岛素)n，其中R是烷基，L是一个水解稳定的分支 点，以及Y是一个连接基团，其为分叉的聚合物与胰岛素之间提供了 化学连接，n是2的倍数。L可以代表一个单个的“核心”基团，例如 “-CH-”，也可以含有更长的原子链。L基团的例子包括赖氨酸、甘油、 季戊四醇或山梨醇。一般来说，分支部分中特定的分支原子是碳。
在本发明的一个特定的实施方案中，分叉的PEG与胰岛素分子之 间的连接(Y)是水解稳定的。在一个优选实施方案中，n是2。在与 胰岛素上的反应活性部位结合以前，适当的Y部分包括但不限于活性 酯、活性碳酸、醛、异氰酸、异硫氰酸、环氧化物、醇、顺丁烯二酰 亚胺、乙烯砜(vinylsulfone)、酰肼、二硫吡啶和碘乙酰胺。适当的活 化基团的选择依赖于结合在胰岛素分子上的目的位点，可以被本领域 专业技术人员容易地确定。在产生的PEG-胰岛素结合物中相应的Y基 团，来自于活化的分叉聚合物与胰岛素上的适当反应活性部位的反应。 对于本领域专业技术人员来说，这样的最终连接的特定身份是明显的。 例如，如果反应的分叉PEG含有活化的酯，如琥珀酰亚胺或顺丁烯二 酰亚胺酯，通过胰岛素上的一个氨基位点的连接将产生相应的酰胺键。 这些特别的分叉聚合物是特别有吸引力的，因为它们提供了胰岛素与 PEG的摩尔比为2∶1或更高的结合物。这样的结合物不可能阻断胰岛素 受体位点，同时仍然提供了设计上的灵活性，以保护胰岛素免受例如 胰岛素降解酶的酶促降解。
在一个相关的实施方案中，本发明的分叉的PEG-胰岛素结合物由 通式R-[PEG-L(Y-胰岛素)2]n表示。在这种情况下，R代表其上至少结 合了一个PEG-双-胰岛素结合物的中央核心结构。具体而言，根据本发 明这一方面，优选那些分叉聚合物，其中n选自1、2、3、4、5和6。 核心R结构的例子也可以从赖氨酸、甘油、季戊四醇或山梨醇衍生而 来。
在另一个实施方案中，在任何本文提供的代表性的结构中，胰岛 素与聚合物分支点之间的化学键可以是可降解的(即水解不稳定的)。 此外，在聚合物骨架中可以含有一个或多个可降解的键，以便在体内 产生具有比开始给药的结合物更短的PEG链的PEG-胰岛素结合物。聚 合物结合物的这种可选择的特点，可以对结合物给药后其最终的预期 药物学性质提供附加的控制。例如，可以给药一种大的和相对惰性的 结合物(即结合物上连接有一个或多个高分子量的PEG链，例如一个 或多个分子量大于大约10,000的PEG链，其中结合物基本不具有生物 活性)，然后它或是在肺中或是在血流中被水解，产生了一种含有一部 分最初存在的PEG链的生物活性的结合物。采用这种方式，可以在一 定程度上更为有效地适合PEG-胰岛素结合物的性质。例如，起始的聚 合物结合物，当最初通过最好是但不必需是吸入给药时，它的吸收可 能是慢的。当水解可降解的键在体内裂解后，游离的胰岛素(依赖于 可降解的键的位置)或其上带有一个小的聚乙烯标记的胰岛素就被释 放，它们更容易通过肺部吸收和/或在血液中循环。
本发明的这个实施方案的一个特征是，水解前的完整的聚合物结 合物，在给药后降解很慢，以便可裂解的键的水解能够有效地控制活 性胰岛素慢速地释放到血流中，这与胰岛素在其释放到全身性循环中 之前先酶促降解相反。
适合的在生理条件下可裂解的键包括但不限于酯、碳酸酯、氨基 甲酸酯、硫酸酯、磷酸酯、酰氧基烷基酯、缩醛和缩酮。这样的结合 物应该具有生理条件下可裂解的键，其在储存和给药时是稳定的。例 如，PEG-可裂解的键-胰岛素结合物，在产生最后的药物成分之时，如 果使用了适当的给药媒介物在溶解在其中之时，以及不管途径如何在 给药之时，都应该维持它的完整性。
如前面的一般性描述，更具体地说，用于本发明的具有可生物降 解的键的PEG-胰岛素结合物由下列结构表示：PEG1-W-PEG2-胰岛素 (其中PEG1和PEG2可以是相同的也可以是不同的)或PEG-W-胰岛 素，其中W代表一个弱的可生物降解的键。这些结合物含有可以在体 内除去的(即可裂解的)PEG臂或PEG臂的部分。这些特殊修饰的胰 岛素在完整时一般基本上无生物活性，这或是由于分子完整的PEG部 分的大小或是由于PEG链对胰岛素分子上的活性位点的空间位阻。但 是，这样的结合物在生理条件下被裂解，释放出胰岛素或能够通过例 如肺部吸收进入全身循环的具有生物活性的PEG-胰岛素。在第一种示 例结构中，PEG1部分可以具有本文讨论的多种不同结构中的任何一 种，一般分子量为至少大约10,000，以便结合物在给药后不被快速吸 收。分子的PEG2部分优选分子量小于大约5000道尔顿，在更优选情 况下小于2000道尔顿，以及在更优选情况下甚至小于1000道尔顿。 引用第二个示例结构PEG-W-胰岛素，其PEG部分的分子量一般至少 大约10,000道尔顿或更高。
在本发明的另一个特定实施方案中，PEG-胰岛素结合物具有一种 哑铃状的结构，其中两个胰岛素部分被一个中央的PEG相互连接起来。 具体而言，这样的结合物可以用“胰岛素-Y-PEG-Z-胰岛素”结构来表 示，其中Y和Z是水解稳定的连接基团，用于将胰岛素与PEG部分连 接起来。在一个特定的实施方案中，Z在结合之前是一个活化的砜，适 合于与胰岛素上的巯基基团(例如半胱氨酸)反应。此外，Y和Z可 以是任何适合于与胰岛素共价结合的基团。其它的例子参见美国专利 No.5,900,461，其内容在此专门引为参考。
其它代表性的具有线性或分支结构的用于制备本发明结合物的单 或双官能的PEG可以从Shearwater Corporation(Alabama)购买。图例的 结构在Shearwater的2001年目录中有描述，标题为“用于生物医学应 用的聚乙二醇及衍生物”，其内容在此专门引为参考。
B、制备
将PEG连接到胰岛素上的反应条件依赖于所用的特定PEG衍生 物、结合到胰岛素上的位点和反应基的具体类型(即赖氨酸与半胱氨 酸)、所需的PEG化程度等而变化，本领域技术人员可以容易地确定。
在后面更详细的例子中，本发明的结合物的合成可以是定点的(实 施例1、2和4)，也可以是随机的(实施例3)。适合与胰岛素氨基基 团(例如GlyA1、PheB1、Lys29B)反应的PEG活化基团是tresylate、 醛、环氧化物、羰基咪唑、活性碳酸酯(例如琥珀酰亚胺碳酸酯)、缩 醛和活性酯例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和NHS-衍生的PEG。其 中反应性最强的是PEG羧甲基-NHS、正亮氨酸-NHS和琥珀酰亚胺基 碳酸酯。其它用于结合胰岛素的PEG试剂包括PEG-琥珀酰亚胺基琥珀 酸和丙酸。适用于本发明的PEG活性酯，例如具有单个丙酸或丁酸部 分的PEG活性酯，在美国专利No.5,672,662中有描述，在此以其全部 内容引为参考。用于制备本发明的结合物的特定的活性酯包括mPEG- 琥珀酰亚胺基丙酸和mPEG-琥珀酰亚胺基丁酸(实施例1-4)。
对于一个特定结合物的最适实验条件，一般来说可以通过常规的 实验，由本领域技术人员容易地确定。
为了结合到胰岛素的巯基基团上，适合于活化PEG-聚合物的反应 基包括乙烯砜、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺和二巯基-邻吡啶。特别优 选的试剂包括PEG乙烯砜和PEG-顺丁烯二酰亚胺。其它用于本发明的 代表性乙烯砜在美国专利No.5,739,208中有描述，其内容在此专门引 为参考。
在某些情况下，本发明的组合物选择性含有PEG化的胰岛素，即 产生的结合物在位置和PEG化程度方面基本上是均质的。也就是说， 氨基基团的位点选择性或定点PEG化可以产生一个胰岛素结合物组合 物，其中主要在预期靶位点，例如PheB1上结合了一个PEG部分。依 赖于预期的PEG化位点，可能需要一种保护/去保护合成策略以防止胰 岛素分子内非靶反应活性部位的PEG化，例如通过使用一个保护基团 例如t-BOC(叔丁氧基羰基)或二-BOC(二丁氧基羰基)。其它适合的 氨基保护基团包括苄氧羰基(CBZ)、三苯甲基衍生物例如三苯甲基 (Tr)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)等。其它的保护基团，例如环二酰 基基团或硝基苯基亚磺酰(Nps)也证实可用于保护氨基官能团。实施 例1和2中提供了定点合成一种5K-PEG-胰岛素组合物的例子。
这种用于提供本发明的胰岛素结合物的定点结合化学可以产生在 胰岛素分子的特定反应活性部位上高度取代的组合物。然后，如果需 要，这些组合物可以被进一步纯化以提供基本上是纯的单或双官能的 PEG-胰岛素的组合物。
基本上纯的PEG-胰岛素组合物是指根据下列任何一种分析方法 检测到其中含有至少大约90％纯度，在优选情况下至少大约95％纯度 的PEG-胰岛素结合物。就这点而言，纯度是指PEG-胰岛素结合物的含 量。也就是说，至少大约90％纯度的PEG-胰岛素结合物含有至少大约 90％重量的PEG-胰岛素结合物物种，而其余近10％代表不是PEG-胰岛 素结合物的杂质。本发明的PEG-胰岛素结合物一般使用一种或多种纯 化技术进行纯化，例如离子交换层析、孔径排阻层析、亲和层析、疏 水相互作用层析和反相色谱。得到的PEG-胰岛素的总体均一性(存在 的胰岛素-PEG形式的数量)可以通过使用一种或多种下列方法进行评 估：层析、电泳、质谱以及特别是MALDI-MS和核磁共振光谱(NMR)。 一种特别有用的识别胰岛素修饰位点的方法是反相高压液相色谱 (RP-HPLC)肽作图，偶联有一个使用内切蛋白酶Glu-C的人胰岛素 USP身份检验(实施例6)。
C、PEG-胰岛素结合物的特性
按照本发明的一个方面，提供了适合于肺部给药的PEG-胰岛素结 合物组合物。通过实施例7-11的体内数据可以看出，本发明的PEG- 胰岛素结合物，当给药到肺部时，具有比天然胰岛素更高的药代动力 学和药效性质。已经表明，可以用分子量高达5,000K到10,000K或更 高的PEG来修饰胰岛素，同时仍然可以维持活性。一个代表性的PEG- 胰岛素结合物5K-PEG-胰岛素的活性在实施例7中描述。此外，从本 文提供的实施例可以看出，具有平均分子量范围从750道尔顿到2000 道尔顿、到5000道尔顿的PEG链的示例性PEG-胰岛素结合物，当通 过静脉和肺部给药时，都具有生物活性，并且当肺部给药时基本上不 滞留在肺中，正如由可检测到的血清胰岛素水平所表明的那样，并且 能够有效地产生对葡萄糖水平有大幅度的抑制(实施例7到11)，在某 些情况下，这种抑制的持续时间明显长于使用天然胰岛素所观察到的 持续时间。此外，在此提供的PEG-胰岛素结合物，当在肺部给药时， 生效很快(在给药后1小时内)。表13提供了本发明的示例PEG-胰岛 素组合物的药代动力学和药效参数的概要。
一般来说，本发明的PEG-胰岛素组合物将具有一种或多种下列的 特性。本发明的PEG-胰岛素结合物至少维持了可测量程度的比活性。 也就是说，本发明的PEG-胰岛素结合物将具有天然胰岛素从大约2％ 到大约100％或更多的比活性。在本发明的一个优选实施方案中，PEG- 胰岛素结合物将具有未修饰的天然胰岛素至少10％或更多的生物学活 性，并且基本上非免疫原性。在优选情况下，本发明结合物的生物活 性为天然胰岛素生物活性的大约5％到至少大约20％或更高。本发明结 合物的生物活性的表征可以间接地例如通过监测血液中的葡萄糖和胰 岛素水平来产生相应的药代动力学和/或药效数据，或通过RIA(放射 免疫测定法)来进行。
至于在将PEG-胰岛素结合物给药到例如肺部后血清中的胰岛素 浓度，在此描述的结合物一般出峰(即达到最大浓度(Cmax)或浓度 曲线的最高点)在给药后大约2到8小时，更普遍的是在大约3到6 小时左右。此外，本发明化学修饰的胰岛素，特别是在此提供的长效 胰岛素制剂，与天然胰岛素相比，在提供可测量到的葡萄糖降低效应 和在较长的时期内维持胰岛素浓度两个方面，都是有效的。更具体来 说，通过肺部给药时，PEG-胰岛素结合物在给药后将表现出升高的胰 岛素水平(高于基础或基线水平)至少大约6小时，在优选情况下至 少8小时。在优选情况下，通过肺部给药时，PEG-胰岛素结合物在给 药后将产生升高的血液胰岛素水平超过至少9小时、10小时、12小时 或至少14小时的延长期，其中在给药后这样的延长期内在血流中可以 检测到高于基线水平的胰岛素结合物。在实施例中提供了能够表现这 些特征的代表性组合物。
如前所述，本发明的胰岛素结合物对于降低血糖水平是有效的。 现在看看本发明的组合物抑制血糖的能力，通过例如肺部给药时，本 发明的PEG-胰岛素结合物在给药后能够将血糖水平有效抑制在基础水 平以下至少6小时。在更特定的情况下，本发明的PEG-胰岛素组合物 在给药后能够将血糖水平有效抑制在基础水平以下至少8小时，优选 情况下至少10小时，或更优选情况下至少12小时或更长时间。
此外，本发明的PEG-胰岛素制剂表现出高于天然胰岛素的绝对的 肺部生物有效度。具体而言，在此提供的的PEG-胰岛素制剂具有天然 胰岛素至少约1.2倍的绝对的肺部生物有效度，在优选情况下至少大约 1.5倍于天然胰岛素，更优选情况下至少比天然胰岛素高出约2倍，或 者在更优选情况下至少高出约2.5倍或3倍。(表13提供了说明性的结 果)。
III、制剂
本发明的聚合物-胰岛素结合物组合物可以单独给药，也可以以含 有其它赋形剂、溶剂、稳定剂等的治疗/药物组合物的形式给药，这依 赖于给药的特殊方式和剂量形式。本结合物可以肠胃外或非肠胃外给 药。具体的给药途径包括口服、直肠、含服、局部、鼻、眼、皮下、 肌内、静脉内、经皮和肺部。更优选的是肠胃外和肺部途径。
对于哺乳动物以及优选是人的给药来说，药物制剂一般含有至少 一种本发明的PEG-胰岛素结合物及一种或多种可药用的载体，特别是 对肺部组合物而言，这将在后面更详细描述。例如用于肠胃外给药的 本发明制剂，最普通的是液体溶液或悬浮液，而用于肺部给药的可吸 入制剂一般为液体或粉末，其中优选情况下一般为粉剂。其它较少采 用的本发明的化学修饰的胰岛素组合物包括糖浆、乳膏、软膏、片剂 等。
胰岛素的制剂和相应的剂量将随着使用的胰岛素的生物活性浓度 而变化。可注射的胰岛素以USP胰岛素单位和USP胰岛素人类单位(U) 来计量；一个单位的胰岛素等于在禁食的兔子中将血糖水平减少到 45mg/dl(2.5mM)所需的胰岛素量。典型的注射用胰岛素制剂的浓度范 围为30到100单位/mL，大约为每毫升3.6mg胰岛素。在病人中要达 到预期生理效应所需的胰岛素量不仅随着病人及其疾病(例如I型与II 型糖尿病)的具体情形而变化，而且随着所用胰岛素的强度和特殊类 型而变化。例如，普通胰岛素(快效型)的剂量范围为每天每公斤体 重使用从大约2到0.3U胰岛素。从一方面说，本发明的组合物在经历 治疗的病人中，能够有效地使禁食血糖水平达到大约90到140mg/dl 之间，饭后的值低于大约250mg/dl。对于本领域技术人员来说，结合 对特定的给药途径所用的确切胰岛素结合物的药代动力学和药效学， 可以确定精确的用药剂量，并且可以根据周期性葡萄糖监测的结果容 易地进行调整。
可吸入胰岛素结合物制剂的单剂量(在每吸入一次的基础上)的 范围一般是从大约0.5mg到15mg胰岛素结合物，其中一般在大约1到 10次呼吸内达到所需的总剂量，优选情况下在大约1到4次呼吸内。 平均来说，每次用药期通过吸入给药的PEG胰岛素总剂量为大约10U 到大约400U，每个单剂量或单位剂量形式(对应于单次吸入)含有大 约5U到400U。
A、化学修饰胰岛素的可吸入制剂
如上所述，本发明胰岛素结合物的一种优选给药途径是吸入到肺 部。现在将更充分地描述具体的制剂成分、性质和给药装置。
制剂中胰岛素结合物的量，是传送每单位剂量的治疗有效量的胰 岛素以达到至少一种天然胰岛素的治疗效果，即将血糖水平控制在接 近正常血糖量的能力所必需的量。在实践中，这将依赖于具体的胰岛 素结合物、它的活性、将要治疗的糖尿病症状的严重程度、病人的种 群、制剂的稳定性等而广泛变化。组合物一般含有从大约1％重量到大 约99％重量的PEG-胰岛素，典型的是含有从大约2％到大约95％重量 的结合物，更典型的是含有从大约5％到85％重量的结合物，同时也依 赖于组合物中包含的赋形剂/添加剂的相对量。更具体来说，组合物一 般含有至少下面一种百分比的PEG-胰岛素：10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％重量或更高。在优选情况下，粉末组合 物将含有至少大约60％，例如从大约60％到100％重量的PEG-胰岛素。 应该明白，在此描述的制剂中可以掺入一种以上的胰岛素，术语“药 剂”或“胰岛素”的使用决非排除使用两种或多种胰岛素或胰岛素与 其它活性剂的组合。(例如，一种说明性的PEG-胰岛素制剂还可以含 有天然胰岛素)。
A.1、赋形剂
在大多数情况下，本发明的组合物将包括一种或多种赋形剂。优 选的是碳水化合物赋形剂，可以单独使用也可以与其它赋形剂或添加 剂结合使用。用于本发明组合物中的代表性碳水化合物包括糖、衍生 糖例如糖醇、醛糖糖酸、酯化的糖和糖聚合物。适用于本发明的碳水 化合物赋形剂的例子包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄 糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等； 多糖如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如 甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、 吡喃糖基山梨糖醇、肌醇等。优选的是非还原糖，与胰岛素结合物混 合时能形成基本上是干的无定形或玻璃相的糖，以及具有相对高的Tgs 的糖(例如Tgs高于40℃，在优选情况下高于50℃，更优选情况下高 于60℃，以及更优选情况下高于70℃，最优选情况下Tgs为80℃或更 高)。
其它的赋形剂包括氨基酸、肽和特殊的含有2-9个氨基酸的寡聚 体，优选为2-5聚体，以及多肽，它们都可以是同种或异种的。代表性 的氨基酸包括甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、 异亮氨酸(ile)、甲硫氨酸(met)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、 色氨酸(trp)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸 (tyr)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、 组氨酸(his)、正亮氨酸(nor)，以及它们的修饰形式。一个特别优选 的氨基酸是亮氨酸。
其它在可吸入组合物中优选用作赋形剂的是含有两个或多个亮氨 酰残基的二肽和三肽，这在Inhale Therapeutic System(吸入治疗系统 公司)的国际专利申请PCT/US00/09785中进行了描述，在此以其全文 引为参考。
具有玻璃转相温度高于大约40℃、更优选情况下高于50℃、更优 选情况下甚至高于60℃以及最优选情况下高于70℃的二肽和三肽也是 优选的。
其它用于本发明的能够增强稳定性和气雾剂性能的肽是含有上述 氨基酸的任何组合的4聚体和5聚体，尽管由于它们在水中的溶解度 有限而较少使用。在更优选情况下，该4聚体或5聚体含有两个或多 个亮氨酸残基。亮氨酸残基可以占据肽中的任何位置，同时其它的(即 非亮氨酰的)氨基酸位置被上述任何氨基酸占据，只要产生的4聚体 或5聚体在水中的溶解度至少大约1mg/ml。在优选情况下，4聚体或5 聚体中的非亮氨酰氨基酸是亲水氨基酸，例如赖氨酸，从而增加了肽 在水中的溶解度。
多聚氨基酸，特别是含有任何在此描述的氨基酸的那些多聚氨基 酸，也适合于用作稳定剂。优选的多聚氨基酸是例如多聚赖氨酸、多 聚谷氨酸和多聚(赖氨酸，丙氨酸)。
其它可用于本组合物和方法的赋形剂和添加剂包括但不限于蛋 白、非生物聚合物和生物聚合物，它们可以以单独或组合的形式出现。 适合的赋形剂在Inhale Therapeutic Systems的国际专利公开No.WO 96/32096和No.WO 98/16205中提供。优选的赋形剂具有玻璃转相温度 (Tg)高于大约35℃，优选情况下高于大约40℃，更优选情况下高于 大约45℃，最优选情况下高于大约55℃。
蛋白赋形剂的例子包括白蛋白例如人血清白蛋白(HAS)、重组人 白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白、血红蛋白等。组合物也可以含有缓冲 液或pH调节剂，一般但不必需是有机酸或碱的盐。代表性的缓冲液包 括有机酸柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或邻苯二甲酸的盐。其它适合的缓冲液包括Tris、氨基丁三醇盐酸 (tromethamine hydrochloride)、硼酸、甘油磷酸和磷酸。氨基酸如甘 氨酸也适用。
本发明的组合物还可以包含其它的聚合物赋形剂/添加剂，例如聚 乙烯基吡咯烷酮、衍生的纤维素如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟 丙基甲基纤维素，Ficoll(一种多聚体糖)、羟乙基淀粉(HES)、dextrate (例如环糊精如2-羟基丙基-β-环糊精和磺基丁基醚-β-环糊精)，聚乙二 醇和果胶。
组合物还可以包括增味剂、掩味剂、无机盐(如氯化钠)、抗菌剂 (如苯扎氯铵(benzalkonium chloride))、甜味剂、抗氧化剂、抗静电 剂、表面活性剂(如聚山梨酸酯如吐温20和吐温80，以及得自BASF 的非离子型表面活性剂普卢兰尼克(Pluronics)如F68和F88)、山梨 聚糖醇酯、脂类(例如，磷脂如卵磷脂和其它的磷脂酰胆碱、磷脂酰 乙醇胺，尽管在优选情况下不以脂质体的形式)、脂肪酸和脂肪酯、甾 体(如胆固醇)和螯合剂(如EDTA、锌和其它这样的适合的阳离子)。 后面更详细地描述了使用某些双取代的磷脂酰胆碱来生产有孔的微型 结构(即中空有孔的微球)。其它适用于本发明的组合物的药物赋形剂 和/或添加剂在Remington的“The Science & Practice of Pharmacy(药 物科学与实践)”第19版，Williams & Williams出版社，1995年和 “Physician′s Desk Reference(医生桌面参考)”第52版，Medical Economics出版社，Montvale，NJ(1998)中列出。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以不含增透剂，它可能引 起刺激，并且在高浓度时是有毒的，而这种高浓度通常是提供大幅度 的吸收增强所必需的。可以不包含在本发明组合物中的具体的增强剂 是去污剂类的增强剂如脱氧胆酸、月桂醇聚氧乙烯醚-9(Laureth-9)、 DDPC、甘氨胆酸盐和梭链孢酸(fusidate)。但是，某些增强剂，例如 那些保护胰岛素免受酶降解的增强剂，如蛋白酶和肽酶抑制剂如α-1抗 蛋白酶剂、卡托普利(captropril)、thiorphan及HIV蛋白酶抑制剂，在 本发明的某些实施方案中，可以包含在本发明的PEG-胰岛素制剂中。 在另一个实施方案中，本发明的PEG-胰岛素结合物可以不含脂质体、 脂类基质和封装剂。
通常，本发明的药物组合物含有从大约1％到大约99％重量的赋形 剂，在优选情况下含有从大约5％到98％重量的赋形剂，在更优选情况 下含有从大约15％到95％重量的赋形剂。在更优选情况下，喷雾干燥 的组合物含有从0到50％重量的赋形剂，更优选情况下，含有从0到 40％重量的赋形剂。一般来说，希望在最终的药物组合物中含有高的胰 岛素浓度。通常情况下，赋形剂/添加剂的最适量由实验确定，即通过 制备含有不同赋形剂量的组合物(范围从低到高)，检测PEG-胰岛素 的化学和物理稳定性、药物组合物的MMAD和可分散性，然后进一步 探索获得最适气雾剂性能、同时对胰岛素的稳定性无明显副作用的剂 量范围。
A.2、制备干粉
本发明的含有PEG-胰岛素结合物的干粉制剂可以通过任何一种 干燥技术制备，优选采用喷雾干燥的方法。制剂的喷雾干燥在例如 “Spray Drying Handbook(喷雾干燥手册)”第5版，K.Masters，John Wiley & Sons出版社，NY，NY(1991)以及Platz，R.等的国际专利公开 No.WO 97/41833(1997)和No.WO 96/32149(1996)中有一般性的描述， 其内容在此引为参考。
PEG-胰岛素结合物的溶液在常规喷雾干燥器，例如那些从商业供 应商如Niro A/S(Denmark)、Buchi(Switzerland)等处获得的干燥器中进 行喷雾干燥，得到一种可分散的干粉。PEG-胰岛素溶液喷雾干燥的最 适条件随着制剂成分而变化，一般通过实验确定。用于喷雾干燥材料 的气体一般是空气，尽管惰性气体如氮气或氩气也可适用。此外，用 于干燥所喷雾材料的气体的入口和出口的温度以不引起被喷雾材料中 的PEG-胰岛素的降解为宜。这样的温度一般由实验确定，尽管在通常 情况下，入口的温度范围从大约50℃到大约200℃，而出口的温度范围 从大约30℃到大约150℃。优选的参数包括雾化压力从大约20到 150psi，在优选情况下从大约30-40到100psi。一般所用的原子化压力 为下列之一(单位为psi)：20、30、40、50、60、70、80、90、100、 110、120或更高。
具有本文描述的特征的可呼吸的PEG-胰岛素组合物也可以按照 WO 99/16419中描述的方法生产，对某些制剂成分进行干燥，从而形成 有孔的微型结构粉末，该专利的全部内容在此引为参考。有孔的微型 结构粉末一般含有喷干的中空的微球，具有相对薄的孔壁，形成大的 内部空间。有孔的微型结构粉末可以分散在一种选定的悬浮介质中(例 如非水的和/或用氟化的发泡剂)以在干燥前提供稳定的分散作用。使 用相对低密度的有孔的微型结构或微型颗粒显著地减少了微粒间的吸 引力，从而降低了剪切力，增加了产生的粉末的流动性的分散性，以 及减少了由絮凝作用、沉淀作用或其稳定的分散体的分层所引起的降 解。
此外，肺部给药的PEG-胰岛素组合物可以含有空气动力学上轻的 颗粒，如美国专利No.6,136,295中所描述的那样。
本发明的粉末制剂还可以通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾冻干、 超临界液体加工(如在Hanna等的美国专利No.6,063,138中所描述的 那样)、空气干燥或其它形式的蒸发干燥方法来制备。
在另一种方法中，干粉的制备方法可以是将粉末成分凝聚、将材 料筛分以获得凝聚物、球化以提供更呈球状的凝聚物以及筛分以获得 大小均一的产品，这种方法在例如Ahlneck，C.等的国际PCT公开No. WO 95/09616(1995)中有描述，在此引为参考。
干粉也可以通过对干粉形式的制剂成分进行混合、研磨、筛分或 喷射研磨来制备。
干粉组合物一旦形成，在生产、加工和储存过程中最好保持在干 燥条件下(即相对低的湿度)。不论使用何种干燥工艺，最好将产生可 吸入的高度可分散的颗粒，所述颗粒含有在此描述的化学修饰的胰岛 素。
A.3、干粉制剂的特征
本发明的粉末还具有几个特点，其中最显著的是下面的一个或多 个特征：(1)始终如一的高度可分散性，即使在储存后也可维持；(2) 小的气动粒度(MMADs)；(3)细小颗粒剂量值高，即粉末中粒度小 于3.3微米MMAD的百分含量较高；这些特征都有助于提高粉末穿过 下呼吸道的组织(即肺泡)传送到全身循环中的能力。本发明的可吸 入粉末的这些物理性质，对于将这些粉末雾化传送到肺部深处的效率 最大化是非常重要的，将在下面更充分地描述。
本发明的干粉由能够有效透入肺中的可雾化颗粒组成。本发明颗 粒的质量中值粒径(MMD)小于大约20-30μm，或小于20μm，或小于 大约10μm，优选情况下小于大约7.5μm，以及更优选情况下小于大约 4μm，甚至小于大约3.5μm，通常粒径是在0.1μm到5μm的范围内。优 选的粉末由MMD从大约0.2到4.0μm的微粒组成。在某些情况下，粉 末也含有不可呼吸的载体微粒例如乳糖，这些不可呼吸的微粒大小一 般大于大约40μm。
本发明的粉末还具有这样的特征，其气雾剂粒度分布的质量中值 气动粒径(MMAD)小于大约10μm，优选情况下MMAD小于大约5μm， 更优选情况下小于4.0μm，在更优选情况下甚至小于3.5μm，以及最优 选情况下小于3μm。粉末的质量中值气动粒径范围在特征上从大约0.1 到10μm，优选情况下MMAD从大约0.2到5μm，更优选情况下MMAD 从大约1.0到4.0μm，在更优选情况下甚至从1.5到3.0μm。小的气动 粒径一般可以通过将最适的喷雾干燥条件与赋形剂的选择和浓度结合 起来而获得。
本发明的PEG-胰岛素粉末其特征还在于它们的密度。用于吸入的 粉状组合物一般来说堆积密度从大约0.1到10g/立方厘米，优选情况下 从大约0.1到2g/立方厘米，更优选情况下从大约0.15到1.5g/立方厘 米。
粉末的水分含量一般低于大约20％重量，通常低于大约10％重量， 以及在优选情况下低于大约5％重量。本发明优选的粉末的水分含量低 于大约下列重量百分比中的一个或多个：15％、10％、7％、5％或3％。 这样的低水分含量的固体在包装和储存时倾向于表现出较高的稳定 性。
此外，在此描述的喷雾干燥方法和稳定剂能够有效地提供高度可 分散的PEG-胰岛素制剂。对于粉剂来说，这些粉末的发射剂量(ED) 一般大于30％，通常大于40％。在更优选情况下，本发明粉末的ED 大于50％，并且经常大于60％。
在此描述的组合物还具有良好的稳定性，包括化学稳定性和物理 稳定性两方面，即经过长时间后的气雾剂性能。一般而言，在化学稳 定性方面，经过喷雾干燥后，制剂中包含的PEG-胰岛素结合物的降解 一般不超过大约15％。也就是说，粉末将含有至少大约85％的完整的 PEG-胰岛素结合物，在优选情况下至少大约90％或95％的完整的结合 物，在更优选情况下甚至含有至少大约97％或更多的完整的PEG-胰岛 素。在优选情况下，喷雾干燥过程产生的粉末含有少于大约10％的总 蛋白聚合物，也就是说，大于90％重量的化学修饰的胰岛素是单体形 式。
在气雾剂性能方面，本发明的组合物其特征为，当在环境条件下 储存3个月后，发射剂量的降低一般不超过大约20％，在优选情况下 不超过大约15％，以及更优选情况下不超过大约10％。
A.4、组合物的给药
在此描述的PEG-胰岛素制剂的传送可以使用任何合适的干粉吸 入器(DPI)，即利用病人的吸气作为运载工具将干粉药物输送到肺部 的吸入装置。其中优选的是吸入Inhale Therapeutic System的干粉吸入 装置，如在Patton，J.S.等的美国专利No.5,458,135，1995年10月17日、 Smith，A.E.等的美国专利No.5,740,794，1998年4月21日和Smith，A.E. 等的美国专利No.5,785,049，1998年7月28日中所描述，在此引为参 考。当通过这种类型的装置给药时，粉状药剂被放置在一个接受器中， 该接受器具有一个可刺穿的盖或其它可进入的表面，优选情况下是硬 质泡沫料衬垫的包装或盒，在接受器中可以含有单个剂量单位或多个 剂量单位。在例如Parks，D.J.等的国际专利公开WO 97/41031，1997 年11月6日中描述了将计量剂量的干粉药剂填入大量空腔(即单位剂 量包装)的便利的方法，在此引为参考。
其它用于干粉肺部给药的干粉分散装置包括在例如Newell，R.E. 等的欧洲专利No.EP 129985，1988年9月7日、Hodson，P.D.等的欧洲 专利No.EP472598，1996年7月3日、Cocozza，S.等的欧洲专利No. EP467172，1994年4月6日和Lioyd，L.J.等的美国专利No.5,522,385， 1996年6月4日中描述的那些，在此引为参考。其它适合于传送PEG- 胰岛素干粉的吸入装置例如Astra-Draco的“TURBUHALER”。这种类 型的装置在Virtanen，R.的美国专利No.4,668,218，1987年5月26日、 Wetterlin，K.等的美国专利No.4,667,668，1987年5月26日和Wetterlin， K.等的美国专利No.4,805,811，1989年2月21日中被详细描述，在此 全部引为参考。其它适合的装置包括干粉吸入器如Rotahaler(Glaxo)、 Discus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura Pharmaceuticals)和Spinhaler (Fisons)。其它合适的装置使用了一个活塞来提供空气，既可用于夹常 粉末药剂、将空气通过载体筛网从筛网上扬起药剂，也可在一个混合 室中将空气与粉末药剂混合，然后通过装置的喷嘴将粉末导入病人， 例如在Mulhauser，P.等的美国专利No.5,388,572，1997年9月30日中 所描述，在此引为参考。
可吸入的PEG-胰岛素组合物也可以使用一种加压的计量剂量吸 入器(MDI)来给药，例如Ventolin计量剂量吸入器，它含有的药物 溶解或悬浮在药物学上惰性的液体推进剂中，例如氯氟烃或氟烃，如 在Laube等的美国专利No.5,320,094，1994年6月14日和Rubsamen， R.M.等的美国专利No.5,672,581(1994)中所描述，在此均引为参考。
此外，在此描述的PEG-胰岛素可以溶解或悬浮在溶剂，如水或盐 水中，然后通过雾化给药。传送雾化溶液的喷雾器包括AERxTM(Aradigm)、Ultravent(Mallinkrodt)、Pari LC PlusTM或Pari LC StarTM(Pari GmbH，Germany)、De Vilbiss Pulmo-Aide、和Acorn II(Marquest Medical Products)。
如前所述，在此描述的PEG-胰岛素结合物也可以通过静脉内注 射，或较少情况下通过肌内或皮下注射而肠胃外给药。这些制剂的精 确成分可以由本领域技术人员容易地确定。适合于肠胃外给药的制剂 类型包括备注射的溶液、使用前与溶剂混合的干粉、备注射的悬浮液、 使用前与介质混合的不溶性干组合物、给药前需要稀释的乳剂或液体 浓缩物。例如，本发明PEG-胰岛素组合物的可注射溶液可以包括溶解 于水性介质如氯化钠水溶液、任氏液、葡萄糖注射液、乳酸化的任氏 液等中的组合物，并可以包含一种或多种上述的可药用的相容性赋形 剂或添加剂。
IV、用途
本发明的组合物，当通过任何适当的给药途径，优选为吸入或注 射，以治疗有效量给药到哺乳动物受试对象时，可用于治疗糖尿病， 特别是I型或II型糖尿病。
所有在此参考的文章、书籍、专利和其它出版物都以其全文引为 参考。
下面的实施例举例说明了本发明的范围，但决不是打算对本发明 的范围进行限制。
实施例
材料与方法
聚乙二醇试剂得自Shearwater公司(Huntsville，Alabama)。
人胰岛素得自Diosynthm Inc。
实施例1
双-NαA1，NεB29-t-Boc-胰岛素的合成
主要由单PEG化的胰岛素组成的组合物按照实施例1和2所述的 位点特异性方式，使用示例性线性的5,000道尔顿的聚乙二醇制备。
双保护的胰岛素首先如下述方法制备。602mg人胰岛素 (0.103mmol)溶解于含有166μL三乙胺的3.0mL无水二甲亚砜 (DMSO)中。在胰岛素溶液中加入50μL二-叔丁基-碳酸氢盐 (0.215mmol)。室温放置60分钟后，反应液倒入240mL丙酮中，然 后加入3滴6M的HCl以起始絮凝作用。沉淀通过过滤分离，并在真 空中干燥。反应产物使用制备型HPLC纯化，使用Waters 25×100mm C18 柱(平均粒度15μm，孔径100A)。乙腈和0.1％TFA的去离子水混合物 用作洗脱液，洗脱速度3.0mL/min。收集产物，蒸馏以除去乙腈，然后 冷冻干燥。产量为164.8mg(26.7％，通过MALDI测定分子量约为6000)。
实施例2
单PEG-化的mPEG-5K-SPA-PheB1-胰岛素结合物
NαB1-甲氧基聚乙二醇5K-胰岛素(mPEG5K-PheB1-胰岛素)的合 成
150mg(约0.025mmol)从实施例1得到的新纯化的双 -NαA1，NεB29-t-Boc-胰岛素溶解于含有95μL三乙胺的4mL DMSO中。在 胰岛素溶液中加入169mg(0.032mmol)mPEG-SPA-5000(m-PEG-琥 珀酰亚胺基丙酸，mPEG-O-CH2CH2C(O)O-琥珀酰亚胺，分子量5000)。 在室温保温过夜(29小时)后，得到的mPEG-胰岛素衍生物用去离子 水稀释到100mL，对去离子水透析4小时，然后冷冻干燥。冷冻干燥 的产品重新溶解在4mL无水TFA中，并在氮气中0℃下维持1.5小时 以除去Boc保护基团。去保护的mPEG-胰岛素用去离子水稀释到 50mL，对0.1％NH4HCO3和去离子水透析过夜。将产物冷冻干燥得到 白色粉末。产量为117.6mg(41.6％，通过MALDI测定分子量约为 11311.6)。
基于质谱数据，单结合的胰岛素的含量约为90％，证实了这种合 成方法的位点特异性质。其它的特征数据在实施例5中提供。得到的 产物的胰岛素含量为51.3％。为便于引用，NαB1-甲氧基聚乙二醇5K- 丙酰胺基-胰岛素或mPEG5K-PheB1-胰岛素在本文中将被称为“5K PEG胰岛素”。
实施例3
mPEG-2K-SPA-胰岛素结合物的合成
下列方法用于制备以非位点特异性(即随机)方式PEG化的胰岛 素，使用了分子量为大约2,000道尔顿的示例的线性聚乙二醇。0.1012g 胰岛素(分子量5826道尔顿，0.01737mmol)溶于0.5mL无水DMSO， 然后用50μL三乙胺(0.3587mmol，20倍过量的克分子数)处理。在 上述反应混合物中加入52mg m-SPA-2000(mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸， Shearwater公司，分子量约为2000道尔顿，0.02605mmol，1.5倍过量的 克分子数)。混合物在室温和氮气下搅拌大约17小时。然后将反应混 合物溶解于0.1％的TFA中，使总体积达到5.5mL，然后通过反相HPLC 纯化，使用C-18柱，乙腈/0.1％TFA为洗脱液。反相HPLC显示了含 有单-(结合了一个PEG)和双-PEG化(结合了两个PEG)的产物的 混合物，这种组合物在本文中称为“2K PEG胰岛素”。
产量：68mg
通过RP-HPLC分析的胰岛素含量：50.5mg
实施例4
mPEG-750Da-SPA-胰岛素结合物的合成
以位点特异的方式制备主要由在B1位点PEG化的胰岛素组成的 组合物，使用一种具有代表性的聚乙二醇改性剂，即具有适合于共价 结合到胰岛素上琥珀酰亚胺基丙酸末端的线性的750道尔顿的聚乙二 醇。
4A、双-NA1，NB29-t-Boc-胰岛素的合成
双保护的胰岛素制备如下。602mg人胰岛素(0.103mmol)溶解于 含有166μL三乙胺的3.0mL无水二甲亚砜(DMSO)中。在胰岛素溶 液中加入50μL二-叔丁基-碳酸氢盐(0.215mmol)。室温放置60分钟后， 反应液倒入240mL丙酮中，然后加入3滴6M的HCl以起始絮凝作用。 沉淀通过过滤分离，在真空中干燥。反应产物使用制备型HPLC纯化， 使用Waters 25×100mm C18柱(平均粒度15μm，孔径100A)。乙腈和 0.1％TFA的去离子水的混合物用作洗脱液，洗脱速度3.0mL/min。收集 产物，蒸馏以除去乙腈，然后冷冻干燥。产量为164.8mg(26.7％，通 过MALDI测定分子量约为6000)。
4B、mPEG-750Da-SPA-PheB1-胰岛素结合物的合成
63.4mg(约0.01056mmol)从实施例4A得到的新纯化的双 -NA1，NB29-t-Boc-胰岛素溶解于含有200μL三乙胺的0.5mL DMSO中。 在胰岛素溶液中加入33mg(0.03137mmol，mSPA750分子量大约为1040 道尔顿)mPEG-SPA-750(m-PEG-琥珀酰亚胺基丙酸， mPEG-O-CH2CH2C(O)O-琥珀酰亚胺，PEG MW 750)。室温下保温过夜 (29小时)后，在反应混合物中加入300μL TFA，得到的mPEG-胰岛 素衍生物在100mL乙醚中沉淀，然后真空干燥。产量为大约28.5mg， 通过反相HPLC测定的胰岛素含量为21.3mg(33.6％，通过MALDI测 定的分子量约为6639.3道尔顿)。为了简化，该组合物在本文中称为 “750PEG胰岛素”。
对这种物质进行了两次不同的合成，均利用前述的合成方法，只 有一点例外：一个合成所用的mPEG-SPA-750与胰岛素的克分子比率 为7∶1，而另一个合成所用的mPEG-SPA-750与胰岛素的克分子比率为 3∶1。从这两种制备得到的产物组合物在本文中称为“750-1PEG胰岛 素”(PEG试剂与胰岛素的克分子比率为7∶1)和“750-2PEG胰岛素” (PEG试剂与胰岛素的克分子比率为3∶1)。
实施例5
示例性PEG-胰岛素组合物的鉴定
使用各种分析技术对上述的PEG化的胰岛素结合物组合物的性质 进行了进一步研究。
使用质谱法根据相对峰面积对每种组合物中存在的单、双和三-结 合的胰岛素(也称为PEG胰岛素单体、二聚体和三聚体)的相对量进 行了评估。结果见下面的表1。
表1、根据质谱获得的单、双和三-结合的胰岛素的相对量 PEG-胰岛素 组合物 单结合物％ 双结合物％ 三结合物％ 5K PEG胰岛素 91 4 未测定 750-1PEG 胰岛素 46 39 15 750-2PEG 胰岛素 60 32 8 2K PEG胰岛素 51 45 未测定
对上述的750-1、750-2和2K PEG-胰岛素组合物进行孔径排阻层 析(SEC)，在Waters 2690HPLC系统上使用两个串联装配的Shodex SEC柱(部件号KW-802.5)。流动相由22％冰醋酸和33％乙腈(v/v) 的水组成。层析数据被用作另一种确定这些组合物中每种含有的单、 双和三-结合的胰岛素的相对量的方法。结果见下面的表2。对表1和 表2中的数据进行比较可以看出，这两种不同的方法在组合物中存在 的每种类型结合物的相对量方面提供了近乎一致的结果。
表2、根据HP-SEC获得的单、双和三-结合的胰岛素的相对量 胰岛素 类型 单结合物％ 双结合物％ 三结合物％ 其它物质％ PEG 750-1 48 47 5 0 PEG 750-2 66 26 7 2 PEG 2000 40 51 未检测 9
进行了其它的研究来确定这三种示例组合物的每种中不同位置结 合物的分布，即三个可能的结合位点A-1Gly、B-1PheH或B-29Lys 中的每个位置取代的程度。二硫苏糖醇(DTT，Sigma)被用来还原胰 岛素样品中的二硫键，致使胰岛素A链和B链之间的共价结合被打破。
为进行还原反应，将PEG-胰岛素样品溶解在含有0.4M碳酸氢铵 的8M尿素中，使每种结合物物种中相当的胰岛素质量达到大约 0.2mg/mL。将DTT溶解于水中(7mg/mL)形成DTT水溶液。然后在 5份的每种胰岛素溶液中加入1份DTT溶液，还原反应在50℃进行15 分钟。使用碘乙酰胺(Sigma)将还原的750PEG胰岛素组合物烷基化。 在层析和酶解前将6份PEG-胰岛素溶液与1份100mM碘乙酰胺进行 反应。然后用HPLC分析反应产物。根据在对照样品之后洗脱下来的 胰岛素A链或B链的量(归因于和聚乙二醇结合)估计与胰岛素A链 或B链结合的百分数。因此对于对照而言，这些后洗脱下来的峰在预 期的保留时间不会出现。相对峰面积被用来对聚乙二醇与胰岛素A链 或B链结合的百分数提供指示。
为了进一步研究PEG结合到B-29LyS和B-1Phe上的相对量，从 上述DTT还原反应得到的还原和烷基化的750-1和750-2PEG胰岛素 组合物的A链和B链被进一步使用测序级的酶——内切蛋白酶Glu-C (Sigma)进行消化。制备含有0.125μg/μL酶的碳酸氢铵水溶液。在加 入酶液之前，每种还原反应混合物在含有0.4M碳酸氢铵的8M尿素中 的胰岛素浓度为0.05μg/μL。然后在40份胰岛素溶液中加入1份酶液。 用内切蛋白酶Glu-C消化后产生A1-A4、A5-A17、A18-A21、B1-B13、 B14-B21和B22-B30的胰岛素肽段。
酶法消化750-1和750-2PEG胰岛素组合物的A链和B链得到的 片段用HPLC分析以评估这些组合物每种中PEG结合到胰岛素上的位 点的总体分布。相对于对照没有出现的峰的百分数为结合到PEG上的 片段的量提供了一种评估，这是因为那个片段在层析图上别处被洗脱 下来。
表3A、示例性PEG-胰岛素制剂中PEG结合位点的分布 胰岛素类型 A-1位点结合的百 分数 B-1位点结合的百分 数 B-29位点结合的百 分数 PEG 750-1 30 95 21 PEG 750-2 11 95 15 PEG 2000 63 85*
*只是还原回收而没有消化的数据
表3A的数字是基于每个位点被百分之百结合的概率。例如，每个 单结合物种有三种可能的构型(单-A1、单-B1和单-B-29)，每个双结 合物也有三种构型(双-A1，B-1、双-A1，B-29和双-B1，B29)。查看表3A 中的数据，例如，对于PEG-750-1，在组合物中存在的所有可能的物种 中，95％的PEG-胰岛素结合物具有一个共价结合在B-1位点上的聚乙 二醇。
表3B、各种可能的结合物物种 类型 单-结合物 双-结合物 三结合物 HMWP 物种# 1 2 3 4 5 6 7 8 结合 位点 A-1 B-1 B-29 A-1+ B-1 A-1+B- 29 B-1+B- 29 A-1+B-1 +B-29 结合的胰岛 素二聚体
实施例6
酶法消化750-2PEG胰岛素与未修饰胰岛素速率的比较
对750-2PEG胰岛素与胰岛素被胰凝乳蛋白酶酶法消化的速率进 行了比较。
制备1mg/mL胰岛素对照和PEG 750胰岛素-2组合物的pH7.8的 磷酸盐缓冲液。制备1mg/mL胰凝乳蛋白酶的1mM盐酸溶液。在20 份胰岛素溶液中加入1份酶液。大约每个小时从混合液中取出少量等 份样品。
开发了一种RP(反相)-HPLC方法，使用C-18柱，流动相含有 高氯酸钠、磷酸和乙腈。使用乙腈梯度来分级洗脱PEG化的胰岛素物 种，在214nm处检测得到一组略微可分辨的峰。这组峰被手动积分为 一个峰并标记为PEG胰岛素。在消化的进程中，将完整的PEG胰岛素 和胰岛素的减少作图(图1)。它们在存在胰凝乳蛋白酶时的半衰期得 以估算。
酶法消化一半浓度的750-2PEG胰岛素组合物的主要成分所需的 时间是未修饰的胰岛素所需时间的5倍长。也就是说，与常规的胰岛 素相比，用胰凝乳蛋白酶消化一半浓度的图示的PEG化的胰岛素要花 5倍长的时间。这些结果表明，与未修饰胰岛素相比，由于增强了对蛋 白水解作用的抗性，PEG胰岛素结合物在肺泡中具有延长驻留时间的 潜力。
实施例7
在大鼠中静脉内给药5K PEG胰岛素后血清葡萄糖和胰岛素浓度 的评估(P-2001-015)
实施这个研究是为了确定5K PEG胰岛素组合物中的胰岛素在经 过用示例的5K聚乙二醇链进行化学修饰后，其活性是否还予以保留， 同时为了探索这些组合物在静脉内给药时的剂量和葡萄糖反应曲线。
露出颈背、皮下有螺纹接入口的预插导管的(位于颈/股骨静脉 [JVC/FVC])雄性Sprague Dawley大鼠由Hilltop Lab Animal Inc.提供 (P.O.Box 183，Scottdale，PA15683)。颈静脉插管用药物级的聚乙烯吡 咯烷酮(PVP-分子量40000)、生理盐水和肝素钠的溶液(管腔填充物) 填充以保持开放。在研究当天，取出密封插管的尼龙纤维塞，用 Monoject钝导管23Gx1(VWR#53498-484)代替。试验系统包括1只 随机选取的雄性大鼠用于安慰剂组，2只随机选取的雄性大鼠用于非 PEG化的组，以及4只随机选取的雄性大鼠用于PEG-胰岛素组。用于 本研究的PEG化胰岛素来自实施例2的5K PEG胰岛素。剂量通过静 脉内给药。
动物的数量/性别
第一天：对于安慰剂组1，每组1只雄性大鼠
对于组2，每组2只雄性大鼠；对于组3-5，每组4只雄性大鼠
在开始研究前，动物被禁食12-18小时。人胰岛素(Diosynth)在 使用前储存于-20℃。5K PEG胰岛素(实施例2)在使用前储存于-20 ℃。制备两种不同的用于给药的溶液：
用于静脉内给药的溶液
非PEG化的人胰岛素(1.0mg/mL储液)：在1.0mL PBS中加入 1.0mg胰岛素粉末。
5K PEG胰岛素(1.0mg/mL人胰岛素，浓度基于胰岛素而不是结 合物)：在6.0mL PBS中加入11.7mg 5K PEG胰岛素粉末。
通过吸入异氟烷(isoflurane)麻醉动物。通过FVC给予静脉内剂 量(每只动物300μL)，然后将导管结扎以消除与抽取血液的交叉污染。 所有的血样通过JVC抽取。磷酸盐缓冲液(PBS)以300μL的剂量静 脉内给药到组1。非PEG化的人胰岛素以每只动物20μg的剂量静脉内 给药到组2。PEG化的人胰岛素以每只动物20μg的剂量静脉内给药到 组3，以每只动物40μg的剂量静脉内给药到组4，以及以每只动物30μg 的剂量静脉内给药到组5。在给药前(给药前2到2.5小时)、给药后 10、15、30、60、120和180分钟从JVC收集血样(约500μL)。将少 量血液置于葡萄糖试纸上，通过Glucometer Elite葡萄糖检测仪(Bayer Corp.，Elkart，IN)测定血糖。将剩余的样品放入血清分离管中，置于离 心机中分离血液。然后将血清倒入另一个试管中，通过放射免疫分析 方法(RIA)进行分析。使用MicrosoftExcel 2000计算平均值和标准 偏差(SD)。
表4、体内实验概要
下面是实际的给药剂量和每组实际使用的动物数。研究在一天内 完成。 组号 组合物 给药路线 总的胰岛素的日剂 量(μg/动物) 动物数/性别 1 安慰剂 静脉内 0 1只雄性 2 非PEG胰岛素 静脉内 20 2只雄性 3 PEG胰岛素 静脉内 20 4只雄性 4 PEG胰岛素 静脉内 40 4只雄性 5 PEG胰岛素 静脉内 30 4只雄性
结果表明5K PEG胰岛素组合物具有生物活性，即胰岛素分子经 过聚乙二醇修饰后保留了活性，这从它降低血糖的能力可以看出。静 脉内给药PEG化的胰岛素后，血清中的平均胰岛素浓度是剂量依赖的， 同时也观察到了剂量依赖性的葡萄糖水平的降低。结果总结于图2和 图3中。图2是静脉内给药图示的PEG化与非PEG化的胰岛素的组合 物后血清中的平均胰岛素浓度图；图3是静脉内给药上述的组合物后 的血糖浓度图。
实施例8
5K PEG胰岛素的肺部给药(P-2001-017)
通过气管内给药，将一种示例的PEG化的胰岛素——5K PEG胰 岛素给药至大鼠，以确定(1)当给药到肺部后它的活性是否还维持， 以及(2)如果有的话，当直接给药到肺部时它对血清胰岛素和血糖浓 度的影响。
储存液
非PEG化的胰岛素：将1mL PBS加到1.0mg胰岛素粉末中以制 备1mg/mL储存液。胰岛素(对照)的储存液在研究开始的当天配制。
5K PEG胰岛素：将4.0mL PBS加到7.8mg 5K PEG胰岛素粉末中 以制备1mg/mL(基于胰岛素)的储存液。
用药溶液
每只动物40μg胰岛素：在用药2小时内，将667μg胰岛素储存液 加到4.33mL PBS中。
每只动物150μg胰岛素B-1：在用药2小时内，将2.5mL 5K PEG 胰岛素储存液加到2.5mL PBS中。
气管内滴注
在一个树脂玻璃麻醉室中令大鼠吸入与氧气混合的3.0-5.0％异氟 烷(Abbott Laboratories)大约5分钟以将大鼠轻微麻醉。将安装在1mL 注射器上的灌食针(Popper & Sons Inc.；18×3”W2-1/4mm ball，New Hyde Park，NY 11040)插入大鼠的嘴中，向下达到刚好位于主龙骨突上 方的气管以完成给药。在将灌食针插入气管时，使用灌食针的球通过 感觉咽喉皮肤下的软骨环的粗糙程度来确定插入是否合适。利用这种 方法将剂量给药到肺中，然后拔出灌食针。
在这项研究中使用了14只(每组7只)内部带有颈静脉导管(JVC) 的禁食的雄性大鼠(Hilltop Lab Animal，Scottsdale，PA(300-350g))。非 PEG化的人胰岛素以40μg/300μL的剂量气管内给药到组1。PEG化的 人胰岛素制剂以150μg/300μL的剂量气管内给药到组2。在给药前(给 药前2到0.25小时)、给药后15、30、60、120、240、360、480和720 分钟收集血样(约500μL)。将少量血液置于葡萄糖试纸上，通过 Glucometer Elite葡萄糖检测仪(Bayer Corp.，Elkart，IN)测定血糖。将 剩余的样品放入血清分离管中，通过放射免疫分析方法进行分析。使 用MicrosoftExcel 2000计算平均值和标准偏差(SD)。由于导管堵塞， 动物2和3从研究中舍弃。
表5、大鼠体内实验总结
下面是实际的给药剂量和每组实际使用的动物数。 组号 胰岛素类型 给药途径 动物数/性 别 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 用药天数 1 胰岛素 气管内 7只雄性 40 1 2 5K PEG胰 岛素 气管内 7只雄性 150 1
表6、体内剂量水平 组号 胰岛素类型 总的胰岛素日剂 量(μg/动物) 剂量体积(μL) 用药溶液浓度 (μg/mL) 1 胰岛素 40 300 133.33 2 5K PEG胰岛素 150 300 500
对气管内给药后胰岛素和5K PEG胰岛素在血清和血液中的平均 浓度进行作图，分别显示在图4和图5中。结果表明本发明的PEG化 的胰岛素组合物在传送肺部和留在肺中时具有活性。药代动力学数据 进一步证明，PEG化的胰岛素不仅通过肺进入了血液循环，而且同时 维持了活性，正如在血清中可检测到的对应于非内源胰岛素的胰岛素 水平所表明的那样。根据在气管内给药后大约1小时内观察到的血液 中的胰岛素水平判断，似乎PEG化的胰岛素基本上不在肺中停留，在 给药后很短的时间内就穿过肺部进入血流。结果还表明，PEG化的胰 岛素，当通过肺部给药时，能有效降低血糖。然而，在本实施例中， PEG化的胰岛素与非PEG化的胰岛素相比，在所给药的剂量在降低血 糖方面似乎有效性较低。气管内给药PEG化的胰岛素的药代动力学和 药效学反应曲线与非PEG化的胰岛素有某种程度的相似之处，尽管根 据图4的曲线，PEG-胰岛素的作用时间显得比非PEG化的胰岛素长。 基于在此提供的指导原则，并根据一个特定化学修饰的胰岛素产物的 用药需求、目标病人的种群、要治疗的病症等，一个本领域技术人员 可以容易地完成对用药剂量和具体的聚乙二醇修饰剂的进一步优化。
实施例9
750-1PEG胰岛素的肺部给药(P-2001-025)
通过气管内给药，将一种代表性的PEG化胰岛素——750-1-PEG 胰岛素给药至大鼠。开展本研究部分是为了研究共价结合了一个或多 个分子量大约为1000道尔顿或以下的聚乙二醇链的胰岛素组合物当其 传送至肺部时的效果。
大鼠的体内研究基本上如前面实施例8中所述的那样进行。其后 精确的用药方案和给药剂量在下面的表中概述。
表7 组号 胰岛素类型 给药途径 动物数量/ 性别 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 用药天数 1 胰岛素 气管内 2只雄性 80 1 2 750-1PEG 胰岛素 气管内 4只雄性 100 1 3 750-1PEG 胰岛素 气管内 4只雄性 300 1 4 750-1PEG 胰岛素 气管内 4只雄性 500 1
表8 组号 胰岛素类型 总的胰岛素日剂量(μg/ 动物) 剂量体积 (μL) 用药溶液浓度 (μg/mL) 1 胰岛素 80 300 266.67 2 750-1PEG胰岛素 100 300 333.33 3 750-1PEG胰岛素 300 300 1000.00 4 750-1PEG胰岛素 500 300 1666.67
对胰岛素和750-1PEG胰岛素在大鼠中气管内给药后的血清胰岛 素和血糖浓度进行作图，分别显示在图6和图7中。从图6中的平均 血清胰岛素浓度图可以看到，天然或非PEG化的胰岛素在大约15分钟 时达到最高的血清浓度，而PEG化的胰岛素组合物在大约6小时(每 只动物100μg)和8小时(每只动物300μg)达到最高的血清浓度，证 明了这些组合物在通过吸入给药到肺部时的长效性质。从图6可以看 出，未修饰的胰岛素在给药后大约6小时回到基线，而PEG化的胰岛 素在6小时时的胰岛素水平仍显著高于基线(高于基线值大约3到7 倍或更高)。此外，气管内给药PEG化的胰岛素使全身的胰岛素水平甚 至在给药后12个小时仍然维持而不回到基线。事实上，PEG化胰岛素 的胰岛素水平在8小时和12小时时是基线值(即未修饰胰岛素的值) 的3倍以上。这些结果的图在图6中显示。
总而言之，当肺部给药时，750-1PEG胰岛素与未修饰的胰岛素相 比产生了更高的全身性胰岛素水平。此外，PEG化的胰岛素组的全身 性胰岛素水平即使在12小时时仍然显著高于基线。也就是说，PEG 化的胰岛素组升高的胰岛素水平的维持时间至少2倍长于未修饰胰岛 素。这个数据进一步证明PEG化的胰岛素穿过肺部后仍具有生物活性， 并且与未修饰胰岛素相比提供了时间延长的全身胰岛素水平。
图7提供了气管内给药非PEG化和750-1PEG化的胰岛素后平均 血糖浓度图。对于PEG化胰岛素组来说，血糖反应水平与血清胰岛素 水平关联性很好。(也就是说，在血清胰岛素水平升高时，同时也观察 到相应的血糖的抑制/降低。)从图7可以看出，本发明的PEG化胰岛 素化合物当口服给药到肺部时，与天然胰岛素相比表现出快速的起效， 而不是许多缓释制剂通常表现的延迟的起效。也就是说，对葡萄糖的 抑制在给药后很快发生。此外，天然或非PEG化的胰岛素在大约2小 时内达到最大的葡萄糖降低，而PEG化的胰岛素在使用500μg、100μg 和300μg剂量后达到最大的葡萄糖降低的时间分别延长到至少4小时、 6小时和8小时。所以，PEG化胰岛素当肺部给药时，达到最大葡萄糖 降低的时间比非PEG化的胰岛素延长了2到4倍。总的来说，750-1PEG 胰岛素与未修饰胰岛素相比，其葡萄糖抑制显著地增加了超过12个小 时的时间。在8小时时，未修饰胰岛素组的葡萄糖水平已经基本上恢 复正常，而PEG胰岛素组的葡萄糖水平比未修饰胰岛素组低1.3到3 倍。PEG化的胰岛素组的葡萄糖水平甚至在12小时时仍未恢复到基线， 这进一步表明本发明的化学衍生的胰岛素组合物具有延长的葡萄糖抑 制能力。
实施例10
750-1PEG胰岛素的肺部给药(P-2002-001)
在与上述实施例9相似的研究中，以比实施例9中使用的剂量低 的剂量通过气管内给药方式将750-1PEG胰岛素给药至大鼠。
体内气管内大鼠的研究基本上如前面实施例8中所述的那样进 行。精确的用药方案和给药剂量在下面的表中概述。
表9 组号 胰岛素类型 给药途 径 动物数量/性 别 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 给药天数 1 胰岛素 气管内 5只雄性 80 1 2 750-1PEG 胰岛素 气管内 5只雄性 80 1 3 750-1PEG 胰岛素 气管内 5只雄性 160 1
表10 组号 胰岛素类型 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 剂量体积 (μL) 用药溶液浓度 (μg/mL) 1 胰岛素 80 300 266.7 2 750PEG胰 岛素-1 80 300 266.7 3 750PEG胰 岛素-1 160 300 533.3
对未修饰胰岛素和750-1PEG胰岛素在大鼠中气管内给药后的血 清胰岛素和血糖浓度进行作图，结果分别显示在图8和图9中。从图8 中的平均血清胰岛素浓度图可以看到，天然或非PEG化的胰岛素在大 约15分钟时达到最高的血清浓度，而PEG化的胰岛素组合物在2小时 (每只动物80μg)和6小时(每只动物160μg)达到最高的血清浓度。 也就是说，当通过肺部给药到全身循环中时，PEG修饰的胰岛素达到 最大血清胰岛素浓度的时间比天然或非PEG化胰岛素延长了8到24 小时。从图8可以看出，未修饰的胰岛素在给药后大约12小时回到基 线，而PEG化的胰岛素组在同样的12小时时间点其胰岛素水平是基线 值的2.5到3.5倍。PEG化胰岛素组的胰岛素水平直到大约25小时才 回到基线，这意味着与未修饰胰岛素组相比，PEG化胰岛素组回到基 线要花两倍长的时间。对于PEG花胰岛素组，全身的胰岛素水平维持 的时间大约为未修饰胰岛素组的两倍(25小时对12小时)。在长达大 约6小时时间点，两个PEG化胰岛素组的胰岛素水平与给药的剂量基 本相对应(也就是说，每只动物160μg的组的胰岛素浓度大约为每只 动物80μg的组的两倍)。
图9提供了气管内给药非PEG化和750-1PEG化的胰岛素后平均 血糖浓度图。在给药后25小时时，两个PEG化胰岛素组的葡萄糖抑制 仍然没有回到基线，这与未修饰胰岛素组相反。与实施例9的结果相 似，PEG化胰岛素组的总体情况证明葡萄糖抑制的持续时间延长到25 小时以上。在8小时时，未修饰胰岛素组的葡萄糖水平已经接近恢复 正常，而PEG胰岛素组的葡萄糖水平比未修饰胰岛素组低大约1.5倍。 这些结果进一步表明具有一个或多个聚乙二醇部分的修饰的胰岛素产 生了穿过肺部的良好的生物有效度，以及延长的全身性胰岛素水平和 葡萄糖抑制。
实施例11
肺部给药750-2PEG胰岛素(P-2002-003)
通过气管内给药，将一种代表性的PEG化的胰岛素组合物—— 750-2-PEG胰岛素给药至大鼠。进行本研究是为了进一步探索不同剂量 的PEG化与非PEG化的胰岛素当直接肺部给药时的效果。PEG化和非 PEG化形式的胰岛素以每只动物80μg胰岛素的剂量给药动物。体内大 鼠的研究基本上如前面实施例8中所述的那样进行。其后精确的用药 方案和给药剂量在下面的表中概述。
表11 组号 胰岛素类型 给药途 径 动物数量/性 别 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 用药天数 1 胰岛素 气管内 7只雄性 80 1 2 750PEG-2 胰岛素 气管内 7只雄性 80 1
表12 组号 胰岛素类型 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 给药体积 (μL) 用药溶液浓度 (μg/mL) 1 胰岛素 80 300 266.7 2 750PEG-2 胰岛素 80 300 266.7
图10显示了非PEG化胰岛素和750-2PEG胰岛素以每只动物80μg 的剂量气管内滴注后平均血清胰岛素浓度图。图11显示了非PEG化胰 岛素和750-2PEG胰岛素以每只动物80μg的剂量气管内滴注后平均的 血糖浓度图。结果与实施例9和10中获得的结果相似。
下面提供了实施例10和11的药代动力学参数列表。生物有效度 是绝对生物有效度(即与静脉内给药胰岛素相比)。
表13、平均血清胰岛素药代动力学 实施例 胰岛素类型 途径 剂量μg/ 动物 Cmax μU/mL Tmax 分钟 AUC μU*min/mL 绝对生物 有效度 9(P-2001-2 5) 胰岛素 气管内 80 56 15 12878 9 750-1PEG 气管内 100 64 368 27954 9 750-1PEG 气管内 300 160 188 50691 9 750-1PEG 气管内 500 3474 184 255881 10(P-2002-00 1) 胰岛素 气管内 80 132 15 28167 10 750-1PEG 气管内 80 56 210 36818 10 750-1PEG 气管内 160 117 78 60713 静脉内参 比 (P-2002-00 2) 胰岛素 静脉内 20 3057 5 44388 静脉内参比 750-2PEG 静脉内 20 2638 7 63190 静脉内参比 750-2PEG 静脉内 30 3510 5 62746 11(P-2002- 003) 胰岛素 气管内 80 89 24 22203 12.5 11 750-2PEG 气管内 80 164 73 57639 32** 32***
*异常值没有从数据组中除去。
**相对于静脉内每只动物20μg的剂量。除去异常值后的值为22％
***相对于静脉内每只动物30μg的剂量。除去异常值后的值没有 变化
绝对生物有效度计算如下：
实施例12
肺部给药2K PEG胰岛素(P-2002-010)
通过气管内给药，将另一种示例性PEG化胰岛素组合物——2K PEG胰岛素给药至大鼠。用于本研究的2K PEG胰岛素的制备在实施 例3中描述。非PEG化胰岛素以每只动物80μg胰岛素的剂量给药动物。 2K PEG胰岛素以每只动物300μg、600μg、900μg、1200μg胰岛素的剂 量给药动物。体内大鼠的研究基本上如前面实施例8中所述的那样进 行。其后精确的用药方案和给药剂量在下面的表中概述。
表14 组号 胰岛素类型 给药途 径 动物数量/性 别 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 用药天数 1 胰岛素 气管内 3只 80 1 2 PEG 2K-1胰 岛素 气管内 3只 600 1 3 PEG 2K-1胰 岛素 气管内 3只 80 1 4 PEG 2K-1胰 岛素 气管内 3只 160 1 5 PEG 2K-1胰 岛素 气管内 3只 300 1 6 PEG 2K-1胰 岛素 气管内 3只 900 1 7 PEG 2K-1胰 岛素 气管内 3只 1200 1
表15 组号 胰岛素类型 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 剂量体积 (μL) 用药溶液浓度 (mg/mL) 1 胰岛素 80 300 0.267 2 PEG 2K-1胰 岛素 600 300 2.0 3 PEG 2K-1胰 岛素 80 300 0.267 4 PEG 2K-1胰 岛素 160 300 0.533 5 PEG 2K-1胰 岛素 300 300 1.0 6 PEG 2K-1胰 岛素 900 300 3.0 7 PEG 2K-1胰 岛素 1200 300 4.0
图12显示了气管内给药后平均的血糖浓度图。PEG化胰岛素组合 物在肺部给药时观察到良好的剂量反应(即较高的2K PEG胰岛素剂量 导致血糖浓度降低得更多)。尽管对于PEG化和非PEG化的组合物来 说，曲线中达到最大葡萄糖抑制的时间点都显示为大约3小时，但PEG 化与非PEG化胰岛素的图形在葡萄糖抑制的持续时间方面有显著差 异。具体来说，对于大约6小时以后的时间点，在三个较高的2K PEG 化胰岛素剂量(每只动物600μg、900μg和1200μg)处，葡萄糖水平受 到抑制，显著低于非PEG化胰岛素。这些结果进一步证明，通过肺部 给药PEG化的胰岛素可以达到延长的全身性效果。
实施例13
大鼠中静脉内给药2K PEG胰岛素后血清葡萄糖和胰岛素浓度的 评估(P-2002-009)
进行本研究是为了进一步探索在一个示例2K PEG胰岛素组合物 中胰岛素的活性，以及为了确定能够将血糖有效降低到大约30到 40mg/dL浓度的PEG化人胰岛素(PEG 2K-1)的静脉内(i.v.)使用剂 量。
使用下表中概括的组合物、动物组和剂量，按照与实施例7中描 述的相似的步骤进行实验。
表16 组号 胰岛素类型 给药途 径 动物数量/性 别 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 用药天数 1 胰岛素 静脉内 2只雄性 20 1 2 PEG 2K-1胰 岛素 静脉内 2只雄性 20 1 3 PEG 2K-1胰 岛素 静脉内 2只雄性 30 1 4 PEG 2K-1胰 岛素 静脉内 2只雄性 40 1 5 PEG 2K-1胰 岛素 静脉内 2只雄性 80 1 6 PEG 2K-1胰 岛素 静脉内 2只雄性 160 1
表15 组号 对照/测试项 目 总的胰岛素日剂量 (μg/动物) 剂量体积 (μL) 用药溶液浓度 (μg/mL) 1 胰岛素 20 300 67 2 PEG 2K-1胰 岛素 20 300 67 3 PEG 2K-1胰 岛素 30 300 100 4 PEG 2K-1胰 岛素 40 300 133 5 PEG 2K-1胰 岛素 80 300 267 6 PEG 2K-1胰 岛素 160 300 533
图13显示了以每只动物20μg(非PEG化胰岛素)和每只动物20、 30和40μg(2K PEG胰岛素)剂量将非PEG化的胰岛素和2K PEG胰 岛素静脉内给药后平均血清胰岛素浓度图。图14显示了以上述剂量将 非PEG化的胰岛素和2K PEG胰岛素静脉内给药后平均的血糖浓度图。