技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是黄芩素作为抗真菌药物增效剂的新 用途。
背景技术：
黄芩素(黄芩苷元，Baicalein，BAI)是从唇形科植物黄芩的干燥 根中提取的有效成份之一，其结构如式(I)所示，为黄色针状结晶， 熔点为268℃-272℃(甲醇)，临床主要用于治疗各种急、慢性炎症。 有报道黄芩素对尖孢镰刀菌和白色念珠菌有抑制作用(周立刚等，黄 酮和甾体类化合物的抗真菌活性，天然产物研究与开发，1997，3：P24)， 但其抗真菌活性较弱，所需的有效药物浓度较高。
吡咯类抗真菌药物包括咪唑组(imidazoles)和三唑组。咪唑组 中有酮康唑、克霉唑、咪康唑、益康唑等。三唑组抗真菌药国内已上 市者有氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等。目前，临床常用的抗真菌药 物是氟康唑、酮康唑、咪康唑，它们虽然能有效治疗深部及浅表部真 菌感染。但由于临床耐药菌株的越来越普遍，导致这些抗真菌药物无 效或需加大用药量，而用药量的增加必然加大了毒副作用的产生。例 如酮康唑因其肝脏、心脏毒性而使治疗中断因而限制了其临床应用。 因此，在不增加抗真菌药物用量甚至在减少用药量的情况下，利用增 效剂有效治疗真菌感染特别是耐药性真菌感染具有重要的临床应用价 值。
至今尚未见黄芩素作为氟康唑、酮康唑、咪康唑等吡咯类抗真菌 药物增效剂的报道。
发明内容：
本发明的目的是在不增加抗真菌药物用量甚至在减少用药量的情 况下，寻找新的增效剂以有效治疗真菌感染特别是耐药性真菌感染。
本发明提供了黄芩素作为抗真菌药物增效剂的新用途，所说的抗 真菌药物是吡咯类抗真菌药物，黄芩素在抗真菌药物有效浓度中加入 量为4-16微克/毫升或微克/毫克。
上述黄芩素在抗真菌药物有效浓度中加入量优选为8微克/毫升 或微克/毫克、16微克/毫升或微克/毫克。
上述的抗真菌药物为咪唑类抗真菌药物或三唑类抗真菌药物。
上述的抗真菌药物为氟康唑、酮康唑或咪康唑。
上述应用中，每毫升液体制剂(或每毫克固体制剂)中加入黄芩 素4-16微克，同时加入氟康唑、酮康唑或咪康唑0.125-0.5微克。
经实验证明，黄芩素在较低浓度时具有明确的增效作用，对于临 床分离的耐药性菌株和实验室诱导的耐药性菌株，当抗真菌药物与黄 芩素合用时，能明显降低抗真菌药物的用药剂量，不仅能在减少用药 量的情况下同样确保其对浅表部或深部真菌感染的治疗效果，并能使 抗真菌药物恢复对耐药真菌的作用。因此可用作抗真菌药物的增效剂， 用于不同深部和浅表真菌感染的治疗。
本发明为黄芩素开辟了新用途，也为吡咯类抗真菌药物特别是氟 康唑、酮康唑、咪康唑等提供了一种有效的增效剂。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施不限于 此。
实施例1：黄芩素和氟康唑合用对不同临床真菌株的作用。
材料和方法
1.试药：
黄芩素：购自Sigma公司。
氟康唑：常州第二制药厂。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
黄芩素用二甲亚砜配成32mg/ml的浓度，氟康唑的浓度为2mg/ml， 受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化， 充分混匀，分别进行药效学试验。
2.菌株：
白念珠菌、克柔氏念珠菌和羊毛状小孢子菌临床株由上海长海医院 真菌室提供，分别采自该医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学 鉴定。也可以选用白念珠菌SC5314、ATCC76625国际标准菌株。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，于 35℃培养1周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆 置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
3.培养液：
RPMI 1640培养液：RPMI 1640(Gibco BRL公司)10.0g，NaHCO3 2.0g， 吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1N NaOH调pH至7.0， 定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存。
沙堡葡萄糖琼脂(SDA)培养基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g， 加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0， 定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。
YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水 900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭 菌后4℃保存。
4.仪器：
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)；
5.菌液制备：
(1)念珠菌菌液
从4℃保存的SDA培养基上挑取念珠菌少量，接种至1mlYEPD培养 液，于30℃以200rpm振荡培养活化，使真菌处于指数生长期后期。取 该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化16小时后，用血细胞 计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至3×103～5×103个 /ml的浓度。
(2)羊毛状小孢子菌菌液
从4℃保存的SDA培养基上挑取丝状菌少量接种至SDA斜面，于 35℃培养一周后，再次挑取少量接种至SDA斜面，于35℃培养一周。实 验前加适量RPMI 1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢 子游离于RPMI 1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血 细胞计数板计数后，加RPMI 1640培养液调整孢子浓度至3×103～ 5×103个/ml的浓度。
6.药敏板制备：
取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI1640培养液100μl作空白对 照；3-11号孔加入新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加入菌液196μl 和6.4mg/ml的氟康唑溶液2μl。在2号孔加入相应浓度的黄芩素 2μl，3-11号孔加入黄芩素1μl。
对2～11号孔进行倍比稀释，使2～11号孔的最终氟康唑浓度分别 为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml；1号孔为不 含药物的RPMI 1640培养液，作为阴性对照，12号孔为不含药物的菌液， 作为阳性对照。各药敏板于30℃培养。
7.MIC80值判定：
含菌96孔板分别于30℃培养24小时或一周后，用酶标分析仪于 620nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓 度孔中的药物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。
当药物的MIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“＞64μg/ml”。上述实验均平行操 作2到3次，当MIC80值能准确重复时才被接受；当MIC80值相差一个浓 度以上时，则需要新实验，直到符合要求为止。
实验结果见表1，表2。
表1黄芩素与氟康唑合用对5株临床白念珠菌的MIC80值 菌株 MIC80值(μg/ml) 单用 MIC80值(μg/ml) 合用 Flu BAI Flu BAI SC5314 ATCC76625 白念031105 白念040421 白念040209 白念040732 白念040134 1 1 1 2 2 2 1 32 32 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64 0.125 0.125 0.125 0.125 0.25 0.25 0.5 4 4 4 4 8 4 4
注：Flu表示氟康唑，BAI表示黄芩素(下同)。
表2黄芩素与氟康唑合用对3株临床克柔氏念珠菌和羊毛状小孢子菌 的MIC80值 菌株 MIC80值(μg/ml) 单用 MIC80值(μg/ml) 合用 Flu BAI Flu BAI 克柔071005 克柔031324 羊小060321 32 ＞64 32 ＞64 ＞64 ＞64 0.25 0.25 0.5 16 8 8
由表1和表2可见，8μg/ml的的黄芩素可使白念珠菌对氟康唑 的MIC80值下降2-8倍，16μg/ml的的黄芩素可使临床克柔氏念珠菌 和羊毛状小孢子菌对氟康唑的MIC80值从≥32降为≤0.5，说明黄芩素 能明显增强氟康唑的抗真菌作用。
实施例2：黄芩素与氟康唑合用对不同临床和实验室诱导耐药株的作 用
材料和方法
1.试药：
黄芩素：购自Sigma公司。
氟康唑：常州第二制药厂。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
黄芩素用二甲亚砜配成32mg/ml的浓度，氟康唑的浓度为2mg/ml， 受试药物于-20℃保存。实验前，将药物贮存液取出置35℃温箱融化， 充分混匀，分别进行药效学试验。
2.菌株：
临床耐药株：白念珠菌均由上海长海医院真菌室提供，分别采自该 医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
实验室诱导耐药株：白念珠菌(SC5314-R、Y01-R)为白念珠菌标准 株SC5314、ATCC76625经氟康唑诱导形成的耐药株，经形态学和生化 学鉴定。
其它实验步骤与方法同实施例1。
实验结果见表3，表4。
表3黄芩素与氟康唑合用对2株实验室诱导白念珠菌耐药株的MIC80值 菌株 MIC80值(μg/ml) 单用 MIC80值(μg/ml) 合用 Flu BAI Flu BAI 白念SC5314-R 白念Y01-R ＞64 ＞64 ＞64 ＞64 0.5 0.5 8 16
表4黄芩素与氟康唑合用对5株临床白念珠菌耐药株的MIC80值 菌株 MIC80值(μg/ml) 单用 MIC80值(μg/ml) 合用 Flu BAI Flu BAI 白念0501199 白念0601587 白念0601417 白念0603115 白念0601417 ＞64 ＞64 64 64 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64 ＞64 0.5 0.125 0.25 0.25 0.125 8 4 8 4 16
由表3、表4可以看出，原先对氟康唑耐药的临床白念珠菌MIC80值≥64，用16μg/ml的黄芩素即可使氟康唑的MIC80值下降为0.125- 0.5μg/ml，对实验室诱导的白念珠菌，用16μg/ml的黄芩素即可使氟 康唑的MIC80值下降为0.5μg/ml，表明黄芩素能使菌株恢复对药物的 敏感性，大大增强氟康唑的抗菌效力。
实施例3：黄芩素与咪康唑、酮康唑的联合用药
材料和方法
1.试药：
黄芩素：购自Sigma公司。
咪康唑：购自中国药品生物制品检定所。
酮康唑：购自中国药品生物制品检定所。
二甲亚砜：中国医药(集团)上海化学试剂公司。
黄芩素用二甲亚砜配成32mg/ml的浓度，咪康唑和酮康唑分别用 二甲亚砜配成6.4mg/ml的浓度，受试药物于-20℃保存。实验前，将药 物贮存液取出置35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学试验。
其它实验步骤与方法同实施例1。
实验结果见表5，表6。
表5黄芩素与咪康唑合用对3株临床白念珠菌耐药株的MIC80值 菌株 MIC80值(μg/ml) 单用 MIC80值(μg/ml) 合用 Micon BAI Micon BAI 白念0601587 白念0501900 白念0501212 32 32 16 ＞64 ＞64 ＞64 0.5 0.125 0.125 4 8 4
注：Micon表示咪康唑，BAI表示黄芩素。
表6黄芩素与酮康唑合用对3株临床白念珠菌耐药株的MIC80值 菌株 MIC80值(μg/ml) 单用 MIC80值(μg/ml) 合用 Ketocon BAI Ketocon BAI 白念0601573 白念0603421 白念0603488 16 32 16 ＞64 ＞64 ＞64 0.125 0.125 0.125 4 8 4
注：Ketocon表示酮康唑，BAI表示黄芩素。
由表5、6可见，黄芩素不但可对氟康唑合用产生增效作用，而且 对咪康唑、酮康唑等抗真菌药同样具有抗菌增效作用。用8μg/ml的黄 芩素即可使咪康唑、酮康唑对耐药白念珠菌的MIC80值从16-32μg/ml 下降为0.5-0.125μg/ml。