技术领域
本发明属于生物医用高分子材料与生物活性药物控释制剂研究领域，具体 地说，本发明涉及一种多肽药物缓释微球制剂及其制备方法。
背景技术
大多数的蛋白、多肽类药物，口服生物利用度很低，以致口服后不能产生 足够高的有效血药浓度，这类药物不能通过口服途径给药。皮下注射时由于体 内蛋白酶的存在，药物在体内的半衰期很短，需要频繁注射，增加了患者的痛 苦，降低患者依从性。
利用生物相容性可降解材料(例如高分子材料)包裹药物活性成分，制成 微球制剂，通过可降解的生物高分子材料在体内逐步降解来控制药物释放，维 持有效的血药浓度。然而，大多数微球制剂都存在很高的药物突释现象以及此 后的低释，造成血药浓度过高或者低于有效血药浓度。此外，在微球制剂生产 过程中很容易造成生物活性药物成分活性降低或降解，对于多肽类药物来说尤 其如此。因此，需要一种新的制剂和工艺来改善这类缓释制剂的突释及维持释 放期间的有效血药浓度。
艾塞那肽(exenatide)是人工合成的北美毒蜥外泌肽(exendin-4)，由39 个氨基酸残基构成，分子式为C184H282N50O60S，相对分子量4186.57，其氨基酸 序列如下：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly -Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽为人胰高血糖素样肽 -1(GLP-1)的类似物，与GLP-1具有相同的生理功能，其53％的氨基酸顺序与 哺乳动物胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)的氨基酸顺序相同，其主要生物功能为： ①增加胰岛素的生物合成及葡萄糖依赖性促胰岛素分泌；②刺激β细胞增殖和 再生，抑制β细胞凋亡从而增加β细胞的数量；③抑制胰高血糖素的分泌；④ 抑制肝糖生成，但不会引起严重低血糖；⑤抑制餐后胃肠道动力及分泌功能； ⑥降低食欲，减少食物的摄入；⑦对神经细胞具有保护作用。可促进葡萄糖依 赖的胰岛素分泌，抑制不适当的葡萄糖依赖的胰高血糖素的分泌，减慢胃排空， 改善外周组织对胰岛素的敏感性，充分控制血糖。
艾塞那肽注射剂已于2005年4月获美国食品药品监督管理局(FDA)批准 上市，商品名为百泌达(Byetta，Exenatide Injection)，用于改善使用二甲双胍和 磺酰脲类药物不理想的2型糖尿病患者的血糖控制或者用来控制体重。临床结 果显示，艾塞那肽用于糖尿病治疗效果明显。艾塞那肽的半衰期仅2.4小时，需 每日注射两次。2012年1月27日，FDA批准了每周注射一次的艾塞那肽缓释 剂型，商品名Bydureon。
美国礼来公司(Eli Lilly and Company)、Amylin、Alkermes公司生产的艾 塞那肽缓释制剂(Bydureon)采用相凝聚原理来制备艾塞那肽微球，该制剂其 配方包括5％的艾塞那肽、2％蔗糖及93％PLGA(50∶50)。
此方法制备的微球形状不规整，不是规则圆球，表面凹凸不平，粒径分 布不均匀，平均粒径在20～40微米之间。制备过程中需要筛选出不符合要求 的部分，来控制微球的平均粒径和粒径分布，使产率大大下降，同时增加了 制备工艺的复杂性和无菌工艺操作的难度。国内也有研究机构采用复乳法 (W/O/W)制备类似微球，按照复乳化方法不同有直接机械搅拌和膜乳化 两种方法。膜乳化法虽然可制得粒径相对均一的微球，但多肽药物大都易溶 于水，在制备过程中药物易于向外水相扩散，造成药物包封率不高，生产成 本上升，而成本亦是微球制剂生产过程中的一个关键因素。
现有技术在制备微球过程中，生物活性多肽药物与聚乳酸-羟基乙酸共 聚物分别溶于水和有机溶剂，分属互不相容两相：油相和水相，药物和聚乳 酸-羟基乙酸共聚物是非均相体系。
发明内容
基于此，有必要提供一种多肽药物缓释微球制剂的制备方法，其制备得到 的缓释微球制剂能有效延长在体内的作用时间。
一种多肽药物缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸溶于有机溶剂中，形成浓度为 100～800mg/mL的溶液；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交酯∶丙交酯 ＝15∶85～90∶10，所述聚乳酸-羟基乳酸共聚物的分子量为2000～65000；所述聚乳 酸的分子量为4000～50000；所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、 丙酮、乙酸、乙腈中的一种或几种；
(2)分别按10～500mg/ml和10～200mg/ml的浓度，将多肽药物和保护剂溶 于无菌水中，得到多肽药物溶液，所述保护剂为糖、糖醇类、蛋白类、无机盐、 高分子稳定剂中的一种或几种；
(3)按体积比为1∶5～50将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液或聚乳酸溶 液与步骤(2)的多肽药物溶液混合，搅拌至形成均一、澄清、透明的混合液；
(4)配制含0.5～5wt％稳定剂的油相，所述油相选自大豆油、花生油、玉米 油、芝麻油、矿物油、二甲基硅油、棉籽油、橄榄油、椰子油、橘油、脂肪烃、 环脂烃或芳香烃中的一种或几种；所述稳定剂选自卵磷脂、span80、单硬脂酸甘 油酯或双硬脂酸聚甘油酯；油相作用是作为乳液连续相，为了保持乳液两相稳 定，油相中需加入一定量的稳定剂。稳定剂的含量影响最终微球粒径的大小。 稳定剂含量越高，乳化时形成的乳滴越小，最终得到的微球粒径越小。
(5)按体积比1∶2～50将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相均质形成O/O型乳 液；形成乳液的方法有机械搅拌(时间3～15min)、高压均质或高剪切均质等。 两相比及两相间的表面张力影响最终微球粒径大小。有机相与油相体积比越大， 对应得到的微球粒径越大。
(6)挥发步骤(5)的乳液除去有机溶剂，待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，把收集到的微球放入 真空冷冻干燥器干燥4～10h，得到多肽药物缓释微球制剂，置于-20℃保存。
可以在300～3000rpm搅拌速度下搅拌6～15h除去有机溶剂，也可以采取加 热、减压蒸发等方法达到相同效果。溶剂挥发的速度影响微球的表面形态，有 机溶剂挥发速度慢，得到的微球表面更加致密，微球孔隙率小。
在其中一些实施例中，所述多肽药物为艾塞那肽(exenatide)、胰高血糖素 样肽(GLP-1)、促黄体激素释放激素(LHRH)、细胞因子、肿瘤坏死因子、生 长激素、降钙素、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、干扰素、生长 激素、酶、白细胞介素、促红细胞生长素、免疫球蛋白、抗体、集落刺激因子、 胰岛素或其类似物、衍生物、修饰物或盐。
在其中一个实施例中，所述多肽药物为艾塞那肽、利拉鲁肽或其药学上可 接受盐。
在其中一些实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液或聚乳酸溶液的浓 度为100～500mg/mL。聚乳酸-羟基乳酸共聚物或聚乳酸在有机溶剂中的浓度越 大，乳化时形成的液滴越大，对应最后形成微球的粒径越大。
在其中一些实施例中，所述保护剂为人血白蛋白、锌盐如氯化锌、碳酸锌、 硫酸锌和醋酸锌、蔗糖或明胶。保护剂的作用是保持生物活性多肽药物的稳定 性，防止多肽药物形成多聚体失活或无法释放。
在其中一些实施例中，艾塞那肽或利拉鲁肽的浓度为50～200mg/ml，保护剂 的浓度为50～100mg/ml。
在其中一些实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与艾塞那肽溶液的 体积比为1∶5～10。
在其中一些实施例中，所述稳定剂的含量为0.5％～3％。
在其中一些实施例中，所述混合液与油相的体积比为1∶2～10。
在其中一些实施例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000～50000。
在其中一些实施例中，油相的粘度为10～500cp。油相的粘度对微球粒径有 较大影响，粘度越大，乳化时形成的液滴尺寸越大。
在其中一些实施例中，油相的粘度为30～100cp。
在其中一些实施例中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特性粘数为0.1～0.5。
在其中一个实施例中，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的特性粘数为0.3～0.5。
本发明还提供了一种由上述制备方法制得的多肽药物缓释微球制剂。所述 制剂主要包括可生物降解的高分子聚合物、多肽药物和保护剂，所述可生物降 解的高分子聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸或其改性修饰物中的一种 或几种。该多肽药物缓释微球制剂是经皮下或肌肉注射的，主要是由生物活性 多肽药物与可生物降解的聚合物构成的缓释组合物(微球)，生物活性多肽药物 均匀分散在可生物降解的聚合物中。优选的微球粒径在20～100微米，更优选的 为30～60微米。微球平均粒径的大小也影响生物活性多肽药物从微球中的释放。 随着微球粒径的逐渐增大，生物活性多肽药物从微球中释放速度也逐渐减慢， 相应释放时间也随之延长。微球粒径越大，注射时越困难，病人的疼痛感越强。
本发明的缓释微球的原料如下：
1.艾塞那肽(以艾塞那肽为例说明，也可以是其它的生物活性多肽药物，如 GLP-1、LHRH、利拉鲁肽、降钙素、细胞因子、肿瘤坏死因子、生长激素、EGF、 NGF、干扰素、生长激素、酶、白细胞介素、促红细胞生长素、免疫球蛋白、 抗体、集落刺激因子、胰岛素以及上述蛋白、多肽的类似物、衍生物、修饰物 及盐，上述多肽药物可以是通过天然提取、化学合成或者基因工程方法得到)
艾塞那肽是一种含有39个氨基酸的多肽，艾塞那肽为人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的类似物，是GLP-1的受体激动剂，与GLP-1具有相同的生理功能， 艾塞那肽在体外显示可以结合并活化已知的人类GLP-1受体。这就意味着通过 包括cAMP和/或其他细胞内信号传导机制使葡萄糖依赖性胰岛素合成及胰岛β 细胞在体内分泌胰岛素增加。在葡萄糖浓度升高的情况下，艾塞那肽可促进胰 岛素从β细胞中释放。体内给药后艾塞那肽模拟GLP-1的某种抗高血糖药作用。
2.保护剂
保护剂的作用是防止生物活性物(例如艾塞那肽)在制备微球的过程中活 性降低，一方面有助于蛋白的稳定，防止蛋白在微球内部形成多聚体而无法释 放，另一方面可以减小药物突释作用。
本发明可以选用的保护剂主要有糖、糖醇类：主要是小分子的糖。例如： 蔗糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、麦芽糖、肌糖、绵白糖、菊糖、右 旋糖苷、麦芽糖糊精、甘露醇等；蛋白类：人血白蛋白、纤维蛋白等；高分子 稳定剂：明胶、阿拉伯胶、桃胶、黄原胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟 丙基纤维素、卡波姆、聚维酮、葡聚糖；锌盐类：醋酸锌、碳酸锌、硫酸锌、 氯化锌。本发明选用的保护剂为上述中的一种或几种。
3.聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸
本发明中所用到的高分子聚物合由本领域技术人员综合考虑聚合物的降解 率、物理性质、端基化学等确定的。聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸的分子量 及组成影响生物活性多肽药物从微球中的释放。聚乳酸-羟基乙酸共聚物中乙交 酯∶丙交酯＝25∶75～90∶10，所述聚乳酸-羟基乳酸共聚物的分子量为2000～65000， 特性粘数为0.1～0.5。聚乳酸的分子量为4000～50000。聚乳酸-羟基乙酸共聚物、 聚乳酸可以是端基封闭、未封闭(端羧基)及经过其他基团修饰的(例如 MPEG-PLGA、MPEG-PLGA)。聚合物采用端羧基PLGA(末端未封闭)或 MPEG-PLGA时，所得微球比采用端基封闭PLGA具有更低的突释率。
本发明的多肽药物缓释微球制备方法采取O/O法，将聚乳酸-羟基乙酸共聚 物和保护剂、多肽药物共同溶解在有机溶剂中，形成完全均一的混合溶液，混 合溶液加入到油相(植物油)形成乳液。制备过程中连续相为油相，杜绝了复 乳法制备过程中药物向外水相扩散的问题，提高了药物包埋率，药物包埋率在 60％～95％。多肽药物和保护剂均匀地包埋在聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球内。生 物活性多肽药物通过微球表面孔隙和随着微球的聚合物材料在体内降解缓慢释 放出来，释放时间可长达一周至数月，体外释放试验结果表明释放符合近似零 级释放。
本发明的多肽药物缓释微球制剂的制备方法只需要乳化、挥发有机溶剂即 可得到规整的微球和在微球中均匀分布的药物，工序简单，操作简单，制备重 复性好，批次之间无显著差别，得到的微球粒径均一、分布窄、粒径可控， 微球表面圆整，微球突释率低。
本发明制备的艾塞那肽缓/利拉鲁肽释微球，微球之间无粘连和团聚，微球 无破裂，药物释放平稳、持续，药物活性在体内释放期间保持在90％以上，可 适用于治疗Ⅱ型糖尿病和控制体重。
附图说明
图1为实施例4艾塞那肽缓释微球的扫描电镜照片；
图2为实施例2艾塞那肽缓释微球体外累计释放曲线；
图3为实施例4、14缓释微球制剂体外累计释放曲线；
图4为实施例4、14缓释微球制剂给药后第1天血糖浓度-时间曲线图；
图5为实施例4、14缓释微球制剂给药后第5天血糖浓度-时间曲线图；
图6为实施例4、14缓释微球制剂给药后第10天血糖浓度-时间曲线图；
图7为实施例4、14缓释微球制剂给药后第15天血糖浓度-时间曲线图；
图8为实施例4、14缓释微球制剂给药后第20天血糖浓度-时间曲线图；
图9为实施例4、14缓释微球制剂给药后第30天血糖浓度-时间曲线图；
图10为实施例4、14的艾塞那肽及利拉鲁肽缓释微球在体内时间-血药浓度 图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种艾塞那肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量15000，乙交酯∶丙交酯＝75∶25， 端羧基)溶于5ml无水乙酸中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；
(2)称取50mg艾塞那肽，30mg蔗糖溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与步骤(2)的艾塞那肽溶液混 合，用磁力搅拌器搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含2wt％卵磷脂的液体石蜡，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相均质乳化处理5-15min形成O/O型 乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLGA微球，把 收集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到艾塞那肽缓释微球，微球粒径在5～30 微米范围内，载药量4.12％，包封率89.17％。
实施例2
除PLGA由端羧基PLGA替换为端基封闭PLGA外，具体步骤同实施例1， 得到艾塞那肽缓释微球粒径在5～30微米范围内，载药量4.58％，包封率90.49％。
实施例3
除PLGA由MPEG-PLGA替换为端基封闭PLGA外，具体步骤同实施例1， 得到艾塞那肽缓释微球粒径在5～30微米范围内，载药量4.22％，包封率88.45％。
实施例1、2、3比较，聚合物采用端羧基PLGA(末端未封闭)或MPEG-PLGA 时，所得微球比采用端基封闭PLGA具有更低的突释率，端基封闭PLGA分子 是烷基末端，而未封闭的则是羧基末端，MPEG-PLGA具有PEG链，后两者聚 合物具有更佳亲水性。由于烷基末端的存在，端基封闭PLGA在有机溶剂中溶 解性能好，在微球制备过程中蛋白颗粒易迁移到微球表面，造成了较高的突释 效应，然而由于亲水性差，在释放过程中水分摄取率低，微球骨架降解缓慢， 而端羧基PLGA和MPEG-PLGA亲水性高，生物降解速度快。
实施例4
一种艾塞那肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量15000，乙交酯∶丙交酯＝75∶25) 溶于5ml乙酸中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；
(2)称取80mg艾塞那肽，30mg人血白蛋白溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与步骤(2)的艾塞那肽溶液混 合，用磁力搅拌器搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含2wt％卵磷脂的花生油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相均质乳化，均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLGA微球，把 收集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到艾塞那肽缓释微球，微球粒径在20～50 微米范围内，载药量7.18％，包封率94.14％。
与实施例1相比，除油相由液体石蜡变为花生油外，其他条件不变，微球 粒径明显变大，这是由于花生油的粘度大于液体石蜡，形成乳滴更大，用大豆 油、芝麻油、玉米油、棉籽油、甲基硅油等粘度大于液体石蜡的油相时，可得 到相同结果。
实施例5
具体步骤同实施例4，除步骤4中卵磷脂的含量由2％降为0.5％，得到艾塞 那肽缓释微球粒径在40～100微米范围内，载药量4.25％，包封率83.23％。
实施例6
具体步骤同实施例4，除步骤4中卵磷脂的含量由2％变为5％，得到艾塞那 肽缓释微球粒径在20～60微米范围内，载药量7.32％，包封率92.16％。
与实施例4相比，增加卵磷脂含量，微球粒径减小，减少卵磷脂含量，微 球粒径增大。从上述实施例得出稳定剂卵磷脂的含量优选在0.5～3％可得到符合 粒径范围的微球。
实施例7
具体步骤同实施例4，除步骤4中花生油含量由50mL降为10mL，得到艾 塞那肽缓释微球粒径在60～100微米范围内，载药量3.14％，包封率67.13％。
实施例8
具体步骤同实施例4，除步骤4中花生油含量由50mL增加为200mL，得到 艾塞那肽缓释微球粒径在30～60微米范围内，载药量6.54％，包封率93.63％。 从上述实施例得出，油相与药物、保护剂溶液体积比较小时，形成乳液两相稳 定性较差，微球粒径分布不均匀，油相用量过多，生产成本增加，优选的油相 与混合液的比例在5～10∶1。
实施例9
具体步骤同实施例4，除步骤1中溶剂由乙酸变为乙腈，得到艾塞那肽缓释 微球粒径在30～60微米范围内，载药量5.36％，包封率73.26％。
实施例10
一种艾塞那肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量5000，乙交酯∶丙交酯＝25∶75) 溶于5ml无水乙酸中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；
(2)称取50mg艾塞那肽，30mg明胶溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与步骤(2)的艾塞那肽溶液混 合，用磁力搅拌器搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含2wt％span80的花生油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLGA微球，把 收集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到艾塞那肽缓释微球，微球粒径在30～60 微米范围内，载药量3.89％，包封率85.20％。
实施例11
一种艾塞那肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量65000，乙交酯∶丙交酯＝85∶15) 溶于5ml无水乙酸中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；
(2)称取50mg艾塞那肽，30mg碳酸锌溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与步骤(2)的艾塞那肽溶液混 合，用磁力搅拌器搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含2wt％span60的玉米油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相混合均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLGA微球，把 收集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到艾塞那肽缓释微球，微球粒径在30～60 微米范围内，载药量3.93％，包封率86.60％。
实施例12
一种艾塞那肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量15000，乙交酯∶丙交酯＝90∶10) 溶于5ml无水乙酸中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；
(2)称取80mg艾塞那肽，65mg醋酸锌溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与步骤(2)的艾塞那肽溶液混 合，用磁力搅拌器搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含1wt％卵磷脂的大豆油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相机械搅拌，均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLGA微球，把 收集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到艾塞那肽缓释微球，微球粒径在30～60 微米范围内，载药量6.34％，包封率84.89％。
实施例13
一种艾塞那肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.5g聚乳酸(分子量15000)溶于5ml无水乙酸中，形成聚乳酸溶液；
(2)称取50mg艾塞那肽，20mg硫酸锌溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸溶液与步骤(2)的艾塞那肽溶液混合，用磁力搅拌器 搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含0.5wt％卵磷脂的芝麻油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相机械搅拌，均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLA微球，把收 集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到艾塞那肽缓释微球，微球粒径在30～80 微米范围内，载药量8.14％，包封率82.34％。
实施例14
一种利拉鲁肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量15000，乙交酯∶丙交酯＝75∶25) 溶于5ml无水乙酸中，形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；
(2)称取50mg艾塞那肽，10mg氯化锌溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液与步骤(2)的利拉鲁肽溶液混 合，用磁力搅拌器搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含2wt％卵磷脂的大豆油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相混合均质均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLGA微球，把 收集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到利拉鲁肽缓释微球，微球粒径在30～60 微米范围内，载药量4.49％，包封率93.54％。
实施例15
一种利拉鲁肽缓释微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1.0g聚乳酸(端羧基PLA，分子量50000)溶于5ml无水乙酸中，形 成聚乳酸共聚物溶液；
(2)称取150mg利拉鲁肽肽，50mg甘露糖溶于0.5mL无菌水中；
(3)将步骤(1)的聚乳酸溶液与步骤(2)的利拉鲁肽溶液混合，用磁力搅拌器 搅拌至形成完全均一、澄清、透明的混合液，作为有机相；
(4)配制50ml含2wt％卵磷脂的花生油，作为油相；
(5)将步骤(3)的混合液与步骤(4)的油相混合均质形成O/O型乳液；
(6)搅拌挥发步骤(5)的乳液除去乙酸；待有机溶剂完全挥发干净后，离心收 集微球，加入环己烷洗涤，除去微球中残留的有机溶剂，得到PLA微球，把收 集到的微球放入冷冻干燥机干燥，得到利拉鲁肽缓释微球，微球粒径在30～60 微米范围内，载药量9.18％，包封率84.73％。
实施例16
除由MPEG-PLA替换PLA外，具体操作步骤同实施例13，微球粒径在30～60 微米范围内，载药量9.87％，包封率91.73％。
从上述实施例得出，通过选用不同的油相、两相比例及稳定剂含量，可以 得到不同粒径的微球，粒径范围在5～100纳米间。本发明的缓释微球粒径优选 在20～50微米间，用液体石蜡做油相时，得到微球粒径较小，小于20微米。采 用植物油(花生油、大豆油、芝麻油等)能得到粒径较大的微球，粒径范围在 20～100微米间。稳定剂的含量选择在2％左右，优选卵磷脂。
微球粒径分布测定：
微球粒径分布用马尔文激光粒度测定仪(Mastersizer 2000，Malvern)进行测 定。称取5mg微球冻干粉，加入到50mL纯化水中，用漩涡振荡器震荡5min， 使微球分散均匀，采用激光粒度测定仪进行测定。粒径分布系数通过下式得出：
CV = ( Σ i = 1 n ( di - dave ) 2 N ) 1 / 2 / d ave × 100 % ]]>
di为单个微球的粒径，dave为微球平均粒径，N为微球的总数，N＞300. 微球形态观察：
微球的形态、表面特性用SEM来观察。用取样棒把微球冻干粉末轻涂于贴 在样品台上的导电胶上。真空条件下喷金(120s)后，用扫描电子显微镜观察 (S-3700N日本)。实施例4得到的微球的形态如图1所示，微球表面圆整。
微球载药量和包封率的测定
采用文献中报道的NaOH-SDS法来测定微球的载药量和包封率，具体操作 如下：准确称量10mg微球，用1ml 0.1mol·L-1NaOH(含5％SDS)溶液混悬， 在100rpm、37℃水浴摇床中震荡24h，8000rpm离心10min，取上清液，高效液 相色谱法测定上清液中的艾塞那肽含量。
艾塞那肽/利拉鲁肽活性测定：
通过ELISA方法检测艾塞那肽/利拉鲁肽的活性，按照活性GLP-1(7-36) 特异性酶免试剂盒(美国/EDI)说明书方法测定。
艾塞那肽/利拉鲁肽体外初始释放测定：
将上述实施例制备的艾塞那肽/利拉鲁肽缓释微球进行体外释放的测定，测 定方法为分别称取50mg微球置于10mL离心管中，释放介质为pH7.4的磷酸缓 冲液(含0.02％的叠氮化钠作为抑菌剂，0.05％的土温80作为润湿剂)，置于温 度37℃±0.5℃条件下放置1h，1h后，取出样品，接着5000rpm离心15min，取 出上清液，HPLC测定上清液中艾塞那肽/利拉鲁肽浓度，计算出释放百分比。 表1列出了使用不同实施例的多肽药物微球制剂的体外突释及药物活性保留。 表2为不同实施例各组分含量。
表1
从表1中，本发明制备的缓释微球粒径在5～100nm间，体外药物的突释率 大多在5％以下，粒径分布系数在10～30间，药物的活性保留在92％以上。油相 的粘度对微球粒径影响较大，用粘度较大的液体石蜡时，得到的微球粒径较小； 相反的，采用低粘度油相时(花生油等植物油)可以得到粒径较大微球。
表2
从表2中看出，本发明制备的多肽药物缓释微球，药物含量在3～10％间， 保护剂的含量在0.5～6％，可生物降解高分子聚合物在85％～95％间。
艾塞那肽缓释微球体外释放的测定：
将上述实施例2、4、14制备的艾塞那肽缓释微球进行体外释放的测定，测 定方法为将50mg微球置于10mL离心管中，释放介质为pH7.4的磷酸缓冲液(含 0.02％的叠氮化钠作为抑菌剂，0.05％的土温80作为润湿剂)，置于恒温水浴摇 床中，在震荡速度100rpm，温度37℃±0.5℃条件下进行微球的体外释放测定。 实施例2分别在1、2、3、4、5、6、7天，实施例4、14分别在第1、2、4、8、 12、16、20、30天取出0.5mL释放介质用高效液相色谱法测定药物的含量，并 补充新鲜的释放介质。从图2、3中可以看出，实施例2、4、14的缓释微球具 有很好的缓释效果。通过使用不同分子量、组成的聚乳酸-羟基乙酸共聚物制成 的缓释微球制剂，释放时间可以从一周至长达一月。
动物实验：
血糖浓度检测
取SD大鼠16只，雌性，体重200g左右。随机分为药物组和空白对照组， 药物组皮下注射适量实施例4、实施例14制备得到的微球，空白组皮下注射等 量生理盐水。分别于给药后的第1、5、10、15、20、30天腹腔注射18mmol/kg的 葡萄糖，注射前每鼠先取空白血样，然后在注射后的5、10、30、60min取血， 测定注射前后的血糖浓度。葡萄糖的测定参照葡萄糖测定试剂盒(广州阳普医 疗科技有限公司)说明书进行。制作时间和血糖浓度的曲线图。结果见图4-9， 从图中可以看出，注射葡萄糖后，10min后药物组血糖浓度(实施例4，实施例 14)均较对照组显著降低，说明30天后血液中还存在药物，微球具有明显的缓 释作用。
体内释放：
SD大鼠随机分为三组，分别皮下注射实施例4、14的适量微球，分别于给 药后的第1、2、3、4、6、8、10、12、15、18、22、26、30天尾静脉取血，立 刻将血液置于抗凝管中，15000g离心3min，将血浆转移至干净的离心管中，-80 冻存，以备检测。血浆中的艾塞那肽含量采用酶联免疫法检测，检测方法按照 大鼠胰高血糖素样肽1(GLP-1)ELISA检测试剂盒(上海雅吉生物生物科技有 限公司)说明书进行。
实验结果如图10所示，由图10可以看出，实施例4，14制剂在开始有一个 较低的突释，然后在5-30天内维持一个相对稳定的血药浓度。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。