本申请是申请日为2003年7月23日，申请号为03817707.2的、 发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明提供使用减少了肌醇六磷酸的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白 水解物的幼鱼苗用饲料。本发明还涉及该减少了肌醇六磷酸的低肌醇 六磷酸钙镁植物蛋白水解物的制造方法。
背景技术
以往，一直使用大豆原料(豆饼、豆乳、大豆蛋白等)作为养鱼 用饲料的蛋白原料。
此外，已知如果除去大豆中所含的肌醇六磷酸的话，能够提高饲 料的效率。
作为除去或者分解肌醇六磷酸的发明，已知(a)饲料(特开平11 -000164号公报、特开平8-205785号公报)、(b)脱脂大豆、豆腐 渣等大豆由来的饲料材料(特开平9-140334号公报)、(c)大豆蛋 白(本申请申请人的特开2000-300185号公报、特开4503002号公 报)和(d)豆乳(特开照59-166049号公报、本申请申请人的特开 2000-245340号公报)等。
但是，低肌醇六磷酸钙镁水解物还没有用在养鱼用饲料中。
一方面，本申请人一直在研究使用用酶水解大豆蛋白原料得到的 蛋白水解物作为养鱼用饲料。例如，特开平7-227223号公报中记载 的提高幼鱼苗的存活率的鱼饲料的发明、特开平8-51937号公报中 记载的发明等。此外，为了进一步提高幼鱼苗的存活率，对大豆蛋白 水解物的改良也进行了研究。
另一方面，关于大豆蛋白水解物，本申请申请人公开了用于肾病 患者的、以树脂除去肌醇六磷酸的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物 (特开平8-092123号公报)。
再一方面，已知接种曲菌使大豆蛋白发酵，进行蛋白分解和肌醇 六磷酸酶处理，来制造低肌醇六磷酸钙镁蛋白水解物(特开平9- 023822号公报)。
其它方面，有以下发明，即酶处理大豆蛋白原料时，由于使用粗 酶，蛋白分解酶和肌醇六磷酸酶起相同的作用，或者将蛋白酶分解和 肌醇六磷酸酶处理结合的发明，但是没有公开，也没有教导酶分解的 大豆蛋白用于养鱼中等的内容(特开昭51-125300号公报、特开2000 -51706号公报等)。
如上所述，本申请人在不断研究在养鱼用饲料中使用大豆蛋白水 解物，也一直在研究低肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物，但并不知道 将它们用在养鱼用饲料特别是幼鱼苗中。
另外，除去大豆的肌醇六磷酸的方法包括(1)在使用盐的水提大 豆蛋白的过程中除去肌醇六磷酸的方法(特开平8-173052号公报、 特开平9-121780号公报等)、(2)用肌醇六磷酸酶等分解肌醇六磷 酸的方法、(3)用树脂等吸附除去的方法(特开2001-163800号公 报)等，与(1)和(3)的方法相比，(2)的方法的工序不复杂，在 工业上是有利的。
此外，关于该(2)用肌醇六磷酸酶等分解肌醇六磷酸的方法的对 象，(a)熟知的是作为饲料等用途的大豆、脱脂大豆等、(b)也已知 豆乳、大豆分离蛋白等几种，但关于(c)植物蛋白水解物混合物不 太知道。
已知例如(a)饲料(特开平11-000164号公报、特开平8-205785 号公报)、(b)脱脂大豆、豆腐渣等大豆由来的饲料材料(特开平9- 140334号公报)、大豆蛋白(本申请申请人的特开2000-300185号公 报、特开4503002号公报)和豆乳(特开昭59-166049号公报、本 申请申请人的特开2000-245340号公报)等。
但是，关于(c)低肌醇六磷酸钙酶植物蛋白水解物却不为人所知， 在本申请申请人的特开平8-092123号公报中公开了使用树脂的方 法。
另外，在特开平9-023822号公报中，公开了接种曲菌使大豆分 离蛋白发酵，同时进行酶分解和肌醇六磷酸酶处理，得到肌醇六磷酸 含量低的肽生成物的方法。
但是，还没有如本发明所述的使肌醇六磷酸在检测界限以下的方 法。
发明内容
本发明人等在进行研究中发现，为了使用植物蛋白水解物作为消 化吸收功能不够发达的小鱼、鱼苗、出生后成活的鱼用的饲料，肽生 成物是不够充分的，需要消化吸收性优异且肌醇六磷酸含量极少的植 物蛋白水解物。因此，本发明的目的在于得到肌醇六磷酸含量极少的 低肌醇六磷酸植物蛋白水解物，特别优选得到肌醇六磷酸在检测界限 以下的低肌醇六磷酸植物蛋白水解物。
进一步的目的在于使用这种低肌醇六磷酸植物蛋白水解物的鱼苗 用饲料。
本发明人等通过不断悉心研究，结果发现通过减少在饲料中使用 的大豆蛋白水解物所含的肌醇六磷酸，可以提高幼鱼苗的存活率，可 以促进鱼苗的生长发育，从而完成了本发明。
另外，通过以下发现，得到低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物。
也就是说，本申请人先完成了通过树脂处理得到的低肌醇六磷酸 钙镁蛋白水解物(特开平8-092123号公报)，但为了使肌醇六磷酸 含量在检测界限以下，树脂处理很麻烦。
另一方面，本申请人用肌醇六磷酸酶处理大豆蛋白，制造低肌醇 六磷酸大豆蛋白(特开2000-300185号公报)，但只酶解该低肌醇六 磷酸大豆蛋白，也难于得到肌醇六磷酸含量非常低，即在检测界限以 下的大豆蛋白水解物。
因此，进一步悉心研究，发现首先将大豆蛋白酶解至特定的分子 量范围，之后进行肌醇六磷酸酶处理，可以得到肌醇六磷酸非常少(检 测界限以下)的大豆蛋白水解物。
还发现在酶解大豆蛋白时，从大豆原料水提取大豆蛋白后，如果 不进行干燥就进行酶解的话，先进行肌醇六磷酸酶处理，然后进行酶 解，也能除去肌醇六磷酸至检测界限以下。
令人更加意外的是，这些肌醇六磷酸含量在检测界限以下即肌醇 六磷酸含量这样极其少的大豆蛋白水解物与只经过酶解的大豆蛋白水 解物相比，风味优异。
本发明是基于这些发现完成的。
也就是说，本发明的幼鱼苗用饲料，其特征在于在饲料原料中含 有肌醇六磷酸含量为0.05重量％或以下(以干燥固形物计)的低肌醇 六磷酸钙镁植物蛋白水解物。
平均分子量是200～10000的植物蛋白水解物是比较合适的低肌醇 六磷酸钙镁植物蛋白水解物。
另外，本发明还涉及低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物的制造方 法，其特征在于包括(a)用蛋白分解酶分解蛋白质的工序和(b)用 分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸的工序。
用蛋白分解酶分解蛋白后，优选用分解肌醇六磷酸的酶分解肌醇 六磷酸。
优选用分解肌醇六磷酸的酶分解未干燥的蛋白后，用蛋白分解酶 分解蛋白质。
分解肌醇六磷酸的酶优选肌醇六磷酸酶。
肌醇六磷酸酶处理的pH优选为6～9。
低肌醇六磷酸钙镁蛋白水解物的平均分子量优选为200～10000。
低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物中的肌醇六磷酸含量优选以干 燥固形物计，用钒钼酸吸光光度法(检测界限5mg/100g)不能检测出 肌醇六磷酸。
实施发明的最佳方式
首先就幼鱼苗用饲料进行说明。
本发明的用于幼鱼苗用饲料的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物 以干燥固形物计的肌醇六磷酸含量为0.05重量％或以下，优选0.01 重量％或以下，更优选0.004重量％或以下(检测界限以下)比较合 适。
植物蛋白水解物中所含的肌醇六磷酸的量越少，幼鱼苗的存活率 越高，是优选的。另外，具有促进鱼苗的成长、赋予粪便粘性、防止 水由于粪便变浑浊的效果。
本发明的用于幼鱼苗用饲料中的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解 物的平均分子量为200～10000(优选300～5000)比较合适。分子量 大的低肌醇六磷酸钙镁蛋白水解物提高促进幼鱼苗的生长发育的效果 和存活率的效果差，若分子量减少直至成为氨基酸的话，饲料的渗透 压升高，变得易于溶解，作为饲料不合适。
只要是养鱼用饲料，分子量比较大的大豆蛋白水解物也可以，但 养的鱼是幼鱼苗的话，平均分子量小的比较好，尤其是刚从卵孵化的 小鱼，优选分子量小的寡肽混合物。
本发明的饲料，作为其组成，含有蛋白成分40～70重量％，优选 约50～60重量％比较合适。
本发明的饲料含有低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物1重量％～ 30重量％，优选3～25重量％比较合适。通常，用上述低肌醇六磷酸 植物蛋白水解物取代本发明饲料中的蛋白成分的3重量％以上，优选 10～80重量％比较合适。取代比例增加的话，该饲料的颗粒化变得困 难。
本发明饲料中低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物少的话，没有提 高幼鱼苗的存活率和鱼苗的成长率的效果，过多的话，会引起生长障 碍，因此是不优选的。这是加吉鱼、比目鱼等养殖种苗生产困难的鱼 共同具有的，与其它鱼的养殖不同。
另外，作为低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物以外的蛋白质成分， 可以合并使用南极磷虾、鱼类加工产品、鸡蛋加工品、牛奶制品、明 胶、鱼粉、鱼介类提取物、酵母提取物、鱼卵提取物。
本发明的饲料除含有上述低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物、其 它蛋白质之外，还可以含有碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质、n- 3高度不饱和脂肪酸和大豆卵磷脂等磷脂。
n-3高度不饱和脂肪酸是比目鱼等海水鱼所必须的脂肪酸，大豆 卵磷脂等饲料性磷脂是幼鱼苗的养殖所必需的成分，因此可以含在本 发明的饲料中。
本发明的饲料的形式优选保持鱼易于摄取的粒径、浮游性、沉降 速度且在水中营养素不溶出，在消化道中被消化吸收这样的形式，特 别用于比目鱼和虾等小鱼时，优选通过微胶囊化等，制成微粒饲料。
将平均分子量200～10000的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物微 胶囊化的方法可以采用例如将水解物的水溶液喷雾干燥的方法。另 外，也可以根据需要，为了调节对海水的溶出性、浮游性、分散性， 在喷雾前也可以添加油脂，喷雾后，添加硬化油脂后，搅拌并涂覆等 来制备。
本发明的饲料可以根据幼鱼苗的日龄，在幼鱼苗期，与生物饲料 结合或者单独，以30分～1小时间隔，适量给料。
以下描述用于如上幼鱼苗的饲料的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水 解物的一个制造方法。
(植物蛋白原料)
本发明所用的植物蛋白可以使用公知的植物蛋白，谷物、油脂原 料的蛋白获得容易，特别是大豆蛋白工业上可以大量生产，因此是优 选的蛋白原料之一。
下面说明使用含有若干肌醇六磷酸的大豆蛋白的例子，但该方法 也是可以应用在其它植物蛋白中的方法。
用于制造本发明的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物的大豆蛋白 原料可以包括豆乳(也包括脱脂豆乳。以下同)、浓缩豆乳、浓缩大 豆蛋白、大豆分离蛋白、脱脂大豆等、只要包含大豆蛋白即可。
脱脂大豆优选没有蛋白变性或者轻度蛋白变性的经加工处理的所 谓低变性脱脂大豆，不受品种、产地等限定。一般来说，把正己烷作 为提取溶剂进行低温提取处理的脱脂大豆作为原料比较合适，特别是 NSI(氮可溶系数)为60以上，优选80以上的低变性脱脂大豆比较 好。
(大豆蛋白的酶解)
大豆蛋白的酶解方法可以在含水溶液(大豆蛋白浆料或者溶液) 中使用酶水解大豆蛋白。
例如，在使用低变性大豆蛋白的场合，用于酶处理的大豆蛋白溶 液的浓度为1重量％～30重量％，优选5～15重量％，较优选8～12 重量％比较合适。该浓度低对酶解也无碍，但产率降低，是不优选的。
用于本发明的蛋白分解酶(蛋白酶)可以单独或者合并使用来源 于动物、植物或者微生物的胞外蛋白酶或者胞内蛋白酶。具体地可以 使用丝氨酸蛋白酶(动物由来的胰蛋白酶、糜蛋白酶、微生物由来的 枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶等)、硫醇蛋白酶(植物由来的木瓜蛋白酶、 无花果蛋白酶、波萝蛋白酶等)、羧基蛋白酶(动物由来的胃蛋白酶 等)。进一步具体地为米曲酶起源的“プロチンFN”(大和化成株制)、 灰色链酶菌起源的“アクチナ-ゼ”(科研制药株制)、来自地衣芽孢 杆菌的“アルカラ-ゼ”(ノボ社制)、来自枯草杆菌的“プロチンA” (大和化成株制)。另外，作为含有胞内蛋白酶的酶，可以举出天野 制药(株)制的“プロテア一ゼS”、大和化成(株)制的“プロチン AC-10”和“ビオプラ-ゼ(ナガゼ生化学工业株式会社)等，作为 含有胞外和胞内蛋白酶的蛋白分解酶，可以举出天野制药(株)制的 “プロテア一ゼM”。
本发明的水解条件因使用的蛋白分解酶的种类多少不同，一般说 来，优选在该蛋白分解酶的作用pH范围、作用温度、最佳反应时间 下，使用足量的酶以水解大豆蛋白。在同时考虑脂质代谢改善剂和限 制盐分的食物(例如经饲管营养食物等)的用途的场合，如果pH为 5～10，优选pH6～9，可以减少中和生成的盐，因而是优选的。
对于水解的程度，平均分子量为200～10000，优选300～5000比 较合适。可以根据目的和用途来调节水解的程度。例如，在食料和饲 料的场合，比较大的分子量也无妨，在用作养鱼用饲料的场合和用作 幼鱼苗用饲料的场合，优选易于消化的低分子量，适合的平均分子量 为200～5000，较优选为200～2000。
(用肌醇六磷酸分解酶分解肌醇六磷酸)
作为用于本发明的分解肌醇六磷酸的酶，可以使用来自小麦和马 铃薯等植物的酶，或者来自肠管等动物内脏的酶、来自细菌、酵母、 真菌、放线菌等微生物的且具有肌醇六磷酸分解活性的肌醇六磷酸酶 和磷酸酶等酶。
作为分解肌醇六磷酸的酶，肌醇六磷酸酶和磷酸酶比较合适，较 优选肌醇六磷酸酶。肌醇六磷酸酶可以使用曲霉属、根霉属、酵母属、 毛霉属、地丝菌属等各种具有产肌醇六磷酸酶能力的菌株。优选来自 曲霉属的酶比较合适，较优选的曲霉属(Aspergillus)：可选自来自无 花果曲霉(Aspergillus ficuum)的肌醇六磷酸酶、来自黑曲霉 (Aspergillus niger)的肌醇六磷酸酶和土曲酶(Aspergillus terreus) 的肌醇六磷酸酶。为了把大豆中的肌醇六磷酸分解为肌醇，需要切断 酯基，进行切断的酶是肌醇六磷酸酶。
另外，也可以使用作为酸性磷酸酶的真菌类由来的酸性磷酸酶。 也就是说，可以选自无花果曲霉(Aspergillus ficuum)由来的酸性磷 酸酶、黑曲霉(Aspergillus niger)由来的酸性磷酸酶和土曲酶 (Aspergillus terreus)由来的酸性磷酸酶。
酶处理的肌醇六磷酸的分解反应可以在非常温和的条件下实施， 因此对蛋白质的影响极其小。例如，本发明的酶反应在30～60℃下进 行0.1～30小时即可。
在本发明中，肌醇六磷酸分解反应时的pH特别重要，在pH6～9， 优选6.2～8.5，进一步6.2～7实施比较好。在低于pH6.0下处理的大 豆蛋白其溶解性降低，风味变差，是不优选的。另外，pH超过9.0， 风味也变差，也不是优选的。在上述pH范围内分解肌醇六磷酸，可 以更好地制造减少了肌醇六磷酸的大豆蛋白。
因而，在本发明中适合使用的酶优选在pH6以上的中性乃至碱性 pH范围可以分解肌醇六磷酸和肌醇六磷酸盐的酶，对其来源没有特 别的限定，可以使用上述酶。
可以在无论粉末状、液体状的形式下使用酶，相对于大豆蛋白中 的粗蛋白重量，以0.01～10重量％，优选0.05～2重量％，更优选0.1～ 1重量％进行添另而实施，但作为酶效价，添加0.1～100U/g粗大豆 蛋白、优选0.5～20U/g粗大豆蛋白，较优选1～10U/g粗大豆蛋白的 肌醇六磷酸酶比较好。另外，对于酶活性，在37℃，使由0.5ml含4mM 肌醇六磷酸钠的0.2Mtris-HCl缓冲液(pH6.5)、0.4ml蒸馏水和0.1ml 酶液组成的反应液反应30分钟，加入1.0ml 10％TCA并停止反应。 用Fiske-Subbarow方法对该反应液中的无机磷酸含量进行定量。在 上述条件下，把在1分钟内使1μmol的无机磷酸游离的酶量作为1个 单位(U)。
在本发明中，只要包括用蛋白分解酶分解蛋白质的工序和用分解 肌醇六磷酸的酶分解肌醇六磷酸的工序，其顺序无论什么样的组合均 可，经过这些工序，可以使低肌醇六磷酸钙镁化，即植物蛋白水解物 中的肌醇六磷酸含量以干燥固形物计为0.5％或以下，优选0.2％或以 下。而且，为了使肌醇六磷酸含量在检测界限5mg/100g以下，在酶 分解蛋白质后，进行肌醇六磷酸酶处理，对于制造低肌醇六磷酸钙镁 植物蛋白水解物是较优选的。另一方面，对蛋白质进行肌醇六磷酸酶 处理后，即使酶解蛋白质，也难于使肌醇六磷酸含量在检测界限 5mg/100g以下。但是，如果在使用前述未变性大豆蛋白的场合，使前 述肌醇六磷酸酶作用于该大豆蛋白溶液(没有粉末干燥)分解肌醇六 磷酸后，进行前述的蛋白酶分解，可以得到肌醇六磷酸含量在检测界 限以下的所需低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物。
如上得到的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物的平均分子量为 200～10000，优选300～5000比较合适。
另外，肌醇六磷酸含量以低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物的干 燥固形物计，用钒钼酸吸光光度法(检测界限5mg/100g)，检测为0.5 ％或以下，优选没有检测出肌醇六磷酸。
(实施例)
下面通过实施例说明本发明的实施方式。
首先，对饲料进行说明。
〔制造例1〕(低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物的制造)
往10重量份脱脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，搅拌提 取30分钟后，用离心分离机分离豆腐渣和豆乳，用硫酸将豆乳调节 至pH4.5后，通过离心分离等，分离成等电点沉淀蛋白质和乳清蛋白 质后，相对于等电点沉淀蛋白质，加4倍水后，用NaOH调节至pH6.0， 制备8％浓度的大豆蛋白溶液50重量份。
将该大豆蛋白溶液加热至50℃，添加新日本化学工业(株)制的 0.04重量份肌醇六磷酸酶分解酶“スミチ-ムPHY”，使之反应60分 钟。在150℃将该反应液杀菌7秒后，冷却至50℃，用NaOH调节至 pH7.0，添加天野制药(株)制的0.16重量份“プロテア一ゼM”， 使之反应5小时。调节至pH6.5，在150℃杀菌7秒后，立即用喷雾 干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，没有检测出(检测界限5mg/100g)。平均分子量用电泳 法测定的结果约500。
〔制造例2〕(没有除去肌醇六磷酸的大豆蛋白水解物的制造)
把100重量份(以下为“份”)大豆分离蛋白(不二制油(株)制 的“フジプロ-R”)制成pH7的5％水溶液，用プロチンFN(大和 化成(株)制：曲霉属起源)1份，在50℃酶解5小时后，在70℃加 热30分钟使酶失活，将冷却后离心分离得到的上清液喷雾干燥，来 制造大豆蛋白水解物。另外，该水解物的TCA(三氯醋酸)可溶率(15 ％TCA可溶氮/全氮的值乘以100的值)为100，且平均分子量为676。
〔实施例1和对比例1〕
·实施例1
从预备饲养水槽将38日龄的比目鱼移至300尾宛100L实验水槽 中，准备5个这样的槽，作为实验水槽。在实验期间，海水的温度保 持在17℃。
作为实验饲料，在表1的比目鱼养殖饲料中，如表1所示，添加 0、2.5、5.0、10.0、20.0重量份酪蛋白代替和上述制造例1一样制造 的低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物，用常规方法制成微粒饲料。实验饲 料组成示于表1中。单位为重量份。第5组为对照组。
从39龄开始实验，从上午9时开始，每1小时给料，给料8次， 直至16时，在17时，给予アルテミア作为生物饲料，每天给料9次。 饲料量随着日龄的增长，把养殖饲料定为0.31g～0.50g/次/鱼，把アル テミア定为55～80只/次/鱼。
实验开始后14天，测定约50尾52龄的幼鱼苗的体长、存活尾 数、色素异常率。
·对比例1
作为实验饲料，使用和上述制造例2一样制造的没有除去肌醇六 磷酸的大豆蛋白水解物，用和实施例1一样的方法，养殖比目鱼。
(表1) 成分 1组 2组 3组 4组 5组 白色鱼鱼糜 30.0 30.0 30.0 30.0 30.0 酪蛋白 11.3 20.6 25.3 27.7 30.0 大豆蛋白水解物 20.0 10.0 5.0 2.5 0.0 糊精 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 维生素混合物 5.3 5.3 5.3 5.3 5.3 矿物质混合物 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 明太鱼鱼肝油 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 n-3高度不饱和脂肪酸 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 大豆卵磷脂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 纤维素 0.9 1.6 1.9 2.0 2.2 酪蛋白 8.0 8.0 8.0 8.0 8.0 合计 100 100 100 100 100
实施例1和对比例1的结果如表2所示。
(表2)52日龄测定结果 实施例1：除去肌醇六磷酸 对比例1：没有除去肌醇六磷酸 组 N 平均体长 (mm) 存活数 组 N 平均体长 (mm) 存活数 1 48 18.11 252 1 52 17.91 194 2 54 17.89 271 2 49 18.18 215 3 50 17.56 244 3 49 17.43 200 4 54 17.36 230 4 54 17.31 195 5 52 17.15 189 5 53 17.01 194
从实施例1的结果可知，添加了低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物的 1～4组与作为对照的5组相比较，生长均得到促进，特别是在1～3 组没有发现显著差别。即使对于存活数，与5组相比，在1～4组可 以看到良好的倾向。另外，色素异常率各组没有差别，在给予大豆蛋 白水解物的组，也没有发现异常。
另外，与下述比较例1相比较，肌醇六磷酸含量低的大豆蛋白水 解物(寡肽混合物)的存活率也显著上升。
〔制造例3〕
将100重量份大豆分离蛋白(不二制油(株)制“ニュ-フジプ ロ-R”)溶解在水900份中，往其中加入2份蛋白质分解酶(大和化 成株式会社制“プロチン”)，在50℃培养5小时后，用离心分离 (5000rpm×30分钟)除去不溶物，进一步在80℃加热30分钟，使 酶失活和杀菌，进行冷冻干燥，得到酶分解物(SH)。
往直径1.4cm的柱中填充丙烯酸类弱碱性阴离子交换树脂(住友 化学工业(株)制“KA890”)直至高度15cm(树脂容积23cm3)，通 入50ml 5％苛性钠液和500ml离子交换水，进行洗涤。
另一方面，用离子交换水溶解上述酶解物，用10％盐酸调节pH 至4.5，用离子交换水调节以使最终蛋白浓度达到10％。
以51ml/hr从填充KA890并洗涤的柱的上部通入上述调制液，从 柱的下部分离获得洗脱的处理液。
通入酶解液，收集其量最终为1219ml(作为蛋白量为121.9g，每 1ml树脂为5.3g)的酶解液，即肌醇六磷酸完全被树脂吸附除去的洗 脱液，冷冻干燥，得到低磷含量的酶解物(SHR)。用穆罕默德等人 的方法(Cereal Chem.63.475.1986)测定肌醇六磷酸含量。其结果没 有检测出肌醇六磷酸(检测界限0.005重量％)。
〔实施例2和对比例2〕
用在制造例3中得到的低肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物和在制 造例2中得到的没有除去肌醇六磷酸的大豆蛋白水解物，孵化来自母 虾的受精卵，用预备饲养至水蚤幼虫l期的饲料，进行饲养实验。
饲养条件如表3所示，在1升烧杯中收入100尾水蚤幼虫1期， 用微粒饲料在室温下饲养。试验饲料的组成如表4所示。
作为试验饲料，往表4的对虾养殖饲料中分别添加10.0重量份酪 蛋白(对照)来代替和制造例3和制造例2一样制造的各大豆蛋白水 解物，用常规方法制成微粒饲料。
另外，以幼苗的生长指数(Growth index：达到成长期)和存活 率判断添加效果。结果如表5所示。
(表3)对虾幼苗的饲养条件 条件 内容 幼苗(饲养开始时) 饲养时间 饲养密度 水温 饲养水 换水 给料频率 水蚤幼虫1期 达到后期幼体前 100尾/罐(1L) 室温(25～27℃) pH8.4±0.2 100％/天 2次/天 饲料粒子大小 水蚤幼虫1期 糠虾幼体期 后期幼体 53μm 125μm 250μm 摄饵率(mg饲料/幼苗/天) 幼苗1期 0.16 糠虾幼体期 0.20 后幼苗 0.24
(表4)试验饲料组成 成分/组 对照 制造例3 制造例2 酪蛋白 42.8 32.8 32.8 L-精氨酸HCl 2.4 2.4 2.4 低肌醇六磷酸大豆蛋 白水解物 0.0 10.0 10.0 葡萄糖 5.5 5.5 5.5 蔗糖 10.0 10.0 10.0 α-淀粉 4.0 4.0 4.0 鳕鱼鱼肝油 4.0 4.0 4.0 ω3-HUFA※1 0.5 0.5 0.5 大豆卵磷脂 3.0 3.0 3.0 胆固醇 1.0 1.0 1.0 矿物质混合物 8.6 8.6 8.6 维生素混合物 3.0 3.0 3.0 葡萄糖胺HCl 0.8 0.8 0.8 柠檬酸钠 0.3 0.3 0.3 琥珀酸钠 0.3 0.3 0.3 鹿角菜胶 5.0 5.0 5.0 纤维素 8.8 8.8 8.8 合计 100.0 100.0 100.0
※1(20∶5ω3)∶(22∶6ω3)＝3∶2
(表5)对虾幼苗的饲养实验的结果 组 第11天的体长 (mm) 存活率(％) 生长指数 (第11天) 对照 4.56±0.27 79.5 6.9 制造例3 4.68±0.25 91.2 7.7 制造例2 4.66±0.26 83.5 7.4
·生长指数(Growth index)＝(1n1+2n2+3n3+4n4+5n5+6n6+7n7) /N(条件是，N＝n1+n2+…+n7)
·n1、n2、n3、n4、n5、n6和n7表示水蚤幼虫1期、水蚤幼虫2 期、水蚤幼虫3期、糠虾幼体1期、糠虾幼体2期、糠虾幼体3 期和后期幼体1幼苗的尾数
该结果发现，后期幼体的体长(第11天测定的)在制造例3的低 肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物添加区与无添加区或者制造例2的大 豆蛋白水解物添加区之间没有差别，但发现低肌醇六磷酸大豆蛋白水 解物添加区在存活率、生长指数方面有良好的倾向。
〔实施例3〕
将生后第70～80天的比目鱼移到20L实验水槽中，每个区20尾， 准备3个这样的水槽，进行饲养实验。实验期间，饲养水温保持在18 ℃。
作为实验饲料，将市售的比目鱼饲料((株)ヒガシマル制的EP 饲料、种苗用S-6)调制成基料。也就是将市售的饲料加热，进行涂 覆使在上述制造例1中制造的低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物和在制造 例2中制造的未经肌醇六磷酸酶处理的大豆蛋白水解物与其粘附后， 干燥制成实验饲料。市售饲料的组成和添加了大豆蛋白水解物的实验 饲料的组成示于表6中。
(表6) (市售饲料的组成) 75.5％鱼粉、磷虾糜 12.7％小麦粉、淀粉、玉米粉 11.8％饲料用酵母、精制鱼油、大豆卵磷脂、酵母提取物、 磷酸二氢钙、微量元素、维生素 (添加大豆蛋白水解物的饲料的组成) 67.5％鱼粉、磷虾糜 10％大豆蛋白水解物 11.7％小麦粉、淀粉、玉米粉 10.8％饲料用酵母、精制鱼油、大豆卵磷脂、酵母提取物、 磷酸二氢钙、微量元素、维生素 (添加低肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物的饲料的组成) 67.5％鱼粉、磷虾糜 10％低肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物 11.7％小麦粉、淀粉、玉米粉 10.8％饲料用酵母、精制鱼油、大豆卵磷脂、酵母提取物、 磷酸二氢钙、微量元素、维生素
用全长平均80.3mm、鱼体重4.4g、体重/全长＝55.5mg/mm的鱼 苗开始实验，给料从上午9时开始，每6个小时给料，每天给4次。 实验开始后经过10天、20天后，测定幼鱼苗60尾的体长、鱼体重， 从测定结果算出体重/全长。
(表7)测定开始第0天(试验鱼数60尾) 对照区 大豆蛋白 水解物 低植酸钙镁大豆 蛋白水解物 平均体长(mm) 最大 最小 81.4 90 73 79.0 88 72 80.4 90 71 平均体重(g) 最大 最小 4.49 6.5 2.9 4.26 6.2 3.1 4.54 6.0 3.1 平均体重/体长(mg/mm) 最大 最小 55.2 72.2 39.7 53.9(-1.3) 70.5(-1.7) 43.1(+3.4) 56.5(+1.3) 66.7(-5.5) 43.7(+4.0)
备注：()内相对于对照区的增减
(表8)测定开始第10天(试验鱼数60尾，存活率60尾) 对照区 大豆蛋白 水解物 低植酸钙镁大豆 蛋白水解物 平均体长(mm) 最大 最小 86.1 95 73 82.5 95 74 86.4 101 71 平均体重(g) 最大 最小 4.99 6.8 2.7 4.57 7.3 4.1 5.31 8.2 3.2 平均体重/体长(mg/mm) 最大 最小 57.9 71.6 37.0 55.4(-2.5) 76.8(+5.2) 43.2(+6.2) 61.5(+3.6) 81.2(+9.6) 53.9(+16.9)
备注：()内相对于对照区的增减
(表9)测定开始第20天(试验鱼数60尾，存活率60尾) 对照区 大豆蛋白 水解物 低植酸钙镁大豆 蛋白水解物 平均体长(mm) 最大 最小 94.0 106 76 89.3 106 78 93.4 101 81 平均体重(g) 最大 最小 7.02 10.6 3.3 6.05 10.9 3.9 6.97 11.8 5.3 平均体重(mg/mm) 最大 最小 74.7 100.0 43.4 67.7(-10.0) 102.8(+2.8) 50.0(+6.6) 74.6(-0.1) 106.3(+6.3) 65.4(+22.0)
备注：()内相对于对照区的增减
从该结果发现，与对照组区、添加大豆蛋白水解物相比较，在低 肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物添加区，在第10天，以平均体重/体 长(mg/mm)计的生长率高，具有促进生长的效果。进一步在第20 天，对于体重/体长(mg/mm)，也观察倒最大的固体。最小的与对照 区、添加大豆蛋白水解物相比，值也比较高，这大概是由于饲料集中 在固体大的鱼中，固体间的差异大，平均值与对照区没有太大区别。
(饲养过程)
饲养期间的水温、给料量、摄取状况记载如下。
粪便的状况，对照区给料后的粪便的状况为拉稀便，水槽的水浑 浊，与此相反，在大豆蛋白水解物和低肌醇六磷酸大钙镁豆蛋白水解 物添加区，粪便为保持形状的软便状，且水槽的水保持干净。而且， 低肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物的饲料，存在粪便粘稠，粪便多的 倾向。
(表10) 月日 日 数 水温 对象区 大豆蛋白水解物 低肌醇六磷酸大豆蛋白 水解物 给 料 量 摄取状况 存 活 数 给 料 量 摄取状况 存 活 数 给 料 量 摄取状况 存 活 数 4/2 1 17.7 0 20 0 20 0 20 4/3 2 18.0 8 不活泼，但 摄取 20 8 不活泼， 但摄取 20 8 不活泼， 但摄取 20 4/4 3 18.8 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4/5 4 18.3 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊摄 取好 20 4/6 5 18.3 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊摄 取好 20 4/7 6 18.4 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4/8 7 18.4 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4/9 8 18.4 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4/10 9 17.8 4 水浑浊，摄 取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4 不浑浊， 摄取好 20 4/11 10 18.3 5 水浑浊，摄 取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 4/12 11 18.5 5 水浑浊，摄 取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 4/13 12 18.5 5 水浑浊，摄 取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 5 不浑浊摄 取好 20 4/14 13 18.6 5 水浑浊，摄 取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 4/15 14 18.8 5 水浑浊，摄 取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 5 不浑浊， 摄取好 20 4/16 15 18.9 8 水浑浊，摄 20 8 不浑浊， 20 8 不浑浊， 20 取好 摄取好 摄取好 4/17 16 19.4 6 水浑浊，摄 取好 20 6 不浑浊， 摄取好 20 6 不浑浊， 摄取好 20 4/18 17 18.4 6 水浑浊，摄 取好 20 6 不浑浊， 摄取不好 20 6 不浑浊， 摄取不好 20 4/19 18 18.4 6 水浑浊，摄 取好 20 6 不浑浊， 摄取不好 20 6 不浑浊， 摄取不好 20 4/20 19 18.4 6 水浑浊，摄 取好 20 6 不浑浊， 摄取不好 20 6 不浑浊， 摄取不好 20 4/21 20 18.4 8 水浑浊，摄 取好 20 8 不浑浊， 摄取好 20 8 不浑浊， 摄取好 20
下面说明低肌醇六磷酸大豆蛋白水解物的实施例。
〔实施例4〕
往10kg脱脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，搅拌提取30 分钟后，用离心分离机分离豆腐渣和豆乳，用硫酸将豆乳调节至pH4.5 后，通过离心分离等，分离成等电点沉淀蛋白质和乳清蛋白质后，相 对于等电点沉淀蛋白质，加4倍水后，用NaOH调节至pH7.0，制备 50升8％浓度的大豆蛋白溶液。
往该大豆蛋白溶液中分别添加“プロテア一ゼS”和“プロテア 一ゼM”(天野制药(株)制)各160g，在50℃使之反应5小时，加 水分解(15％TCA可溶率85％)。然后，将pH调节至6.0，添加新 日本化学工业(株)制的40g肌醇六磷酸分解酶“スミチ-ムPHY”， 在50℃使之反应60分钟后，用NaOH调节至6.5，在150℃杀菌7秒 后，立即用喷雾干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，没有检测出(检测界限5mg/100g)，可以极好地低降低 肌醇六磷酸。
〔实施例5〕
往10kg脱脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，搅拌提取30 分钟后，用离心分离机分离豆腐渣和豆乳，用硫酸将豆乳调节至pH4.5 后，通过离心分离等，分离成等电点沉淀蛋白质和乳清蛋白质后，相 对于等电点沉淀蛋白质，加4倍水后，用NaOH调节至pH6.0，制备 50升8％浓度的大豆蛋白溶液。
将该大豆蛋白溶液加热至50℃，添加40g新日本化学工业(株) 制的肌醇六磷酸酶分解酶“スミチ-ムPHY”，使之反应60分钟后， 用NaOH调节至7.0，添加160g天野制药(株)制的“プロテア一ゼ M”，使之反应5小时。调节至pH6.5，在150℃杀菌7秒后，立即用 喷雾干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，没有检测出(检测界限5mg/100g)，可以极好地低降低 肌醇六磷酸。
〔实施例6〕
往10kg脱脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，搅拌提取30 分钟后，用离心分离机分离豆腐渣和豆乳，用硫酸将豆乳调节至pH4.5 后，通过离心分离等，分离成等电点沉淀蛋白质和乳清蛋白质后，相 对于等电点沉淀蛋白质，加4倍水后，用NaOH调节至pH6.0，制备 50升8％浓度的大豆蛋白溶液，立即用喷雾干燥机粉末干燥。
将该蛋白液调节为8％溶液，加热至50℃，添加40g新日本化学 工业(株)制的肌醇六磷酸酶分解酶“スミチ-ムPHY”，使之反应 60分钟后，用NaOH调节至7.0，添加160g天野制药(株)制的“プ ロテア一ゼM”，使之反应5小时。调节至pH6.5，在150℃杀菌7秒 后，立即用喷雾干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，肌醇六磷酸被降低至0.5％(检测界限5mg/100g)。
〔实施例7〕
往10kg脱脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，搅拌提取30 分钟后，用离心分离机分离豆腐渣和豆乳，用硫酸将豆乳调节至pH4.5 后，通过离心分离等，分离成等电点沉淀蛋白质和乳清蛋白质后，相 对于等电点沉淀蛋白质，加4倍水后，用NaOH调节至pH6.0，制备 50升8％浓度的大豆蛋白溶液。
将该大豆蛋白溶液加热至50℃，添加40g新日本化学工业(株) 制的肌醇六磷酸酶分解酶“スミチ-ムPHY”，使之反应60分钟后， 立即用喷雾干燥机粉末干燥。
将该溶液调节为8％溶液，用NaOH调节至7.0，添加160g天野 制药(株)制的“プロテア一ゼM”，使之反应5小时，在150℃杀菌 7秒后，立即用喷雾干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，肌醇六磷酸被降低至0.2％(检测界限5mg/100g)。
〔实施例8〕
往10kg脱脂大豆中加7倍的水，在50℃、pH7下，搅拌提取30 分钟后，用离心分离机分离豆腐渣和豆乳，用硫酸将豆乳调节至pH4.5 后，通过离心分离等，分离成等电点沉淀蛋白质和乳清蛋白质后，相 对于等电点沉淀蛋白质，加4倍水后，用NaOH调节至pH6.0，制备 50升8％浓度的大豆蛋白溶液。
将该蛋白液加热至50℃，添加40g新日本化学工业(株)制的肌 醇六磷酸酶分解酶“スミチ-ムPHY”，使之反应60分钟后，立即用 喷雾干燥机粉末干燥。
将该溶液调节为8％溶液，用NaOH调节至7.0，添加160g天野 制药(株)制的“プロテア一ゼM”，使之反应5小时(反应时pH6.2)， 之后，再添加40g新日本化学工业(株)制的肌醇六磷酸分解酶“ス ミチ-ムPHY”，使之反应60分钟后，在150℃杀菌7秒后，立即用 喷雾干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，肌醇六磷酸被降低至0.2％(检测界限5mg/100g)。
〔实施例9〕
把30kg粉末干燥的大豆分离蛋白(不二制油(株)制，“ニュ- フジプロ-R”)制成pH7.0的10％溶液，使之受1.2kg天野制药(株) 制的蛋白分解酶“プロテア一ゼS”和0.3kg天野制药(株)制的“プ ロテア一ゼM”的作用，在50℃水解5小时(15％TCA可溶率85％) 后，将pH调节至6.0，添加0.6kg新日本化学工业(株)制的肌醇六 磷酸酶分解酶“スミチ-ムPHY”，在45℃水解2小时。
在可连续处理的高速离心分离机中，将该分解液调整至100升/小 时的送液速度，分离除去产生的沉淀成分。将所得离心上清液(固形 物的收率为70％)调节至pH6.5，在150℃杀菌7秒后，立即用喷雾 干燥机粉末干燥。
用钒钼酸吸光光度法测定该粉末中的肌醇六磷酸(内消旋肌醇环 己酸)含量，没有检测出(检测界限5mg/100g)，可以极好地低降低 肌醇六磷酸。
工业实用性
通过将本发明的饲料给料，能够促进幼鱼苗的生长发育，大幅度 提高存活率。
特别是能够提高一般认为养鱼困难所在的幼鱼苗的存活率，能够 养殖以往一般认为养鱼困难的鱼。
另外，能够促进在某种程度上成长的鱼苗的生长发育，可以使粪 便粘稠，防止水浑浊，生长环境得以改善。
还有，低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物适合于这种饲养量是可 能的。
也就是说，根据本发明，肌醇六磷酸含量极少，而且用钒钼酸吸 光光度法检测为检测界限以下的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物是 可能的。另外，与树脂吸附法的低肌醇六磷酸钙镁大豆蛋白水解物相 比较，本发明方法的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物的风味优异(据 推测是因为肌醇六磷酸的分解物)。
另外，本发明的低肌醇六磷酸钙镁植物蛋白水解物的分子量小， 肌醇六磷酸极少，因此用于消化吸收功能不够发达的鱼苗和生后成活 的动物用饲料中时，消化吸收性优异，对促进钙等微量金属的吸收极 其有效。