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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711220158.X (22)申请日 2017.11.23 (71)申请人 许文胜 地址 300071 天津市南开区南开大学西南 村54号楼1门 (72)发明人 许文胜 (74)专利代理机构 天津欣达睿诚知识产权代理 事务所(普通合伙) 12216 代理人 李欣 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 丹参脱毒苗的工厂化繁育方法 (57)摘要 本发明涉及丹参脱毒苗的工厂化繁育方法， 特别是品质退化严重、 产量降低、 资源稀缺丹参 野。
2、生种、 栽培种或变异种的工厂化繁育方法， 属 于植物品种繁育技术领域。 本发明提供一种丹参 脱毒苗工厂化繁育方法， 包括： (1)选取丹参嫩叶 或茎尖进行脱毒处理； (2)丹参嫩叶或茎尖在初 始诱导增殖培养基中培养； (3)丹参愈伤组织在 分化培养基中的分化培养； (4)丹参幼苗在根诱 导培养基中的根诱导培养； (5)丹参幼苗的炼苗； (6)丹参幼苗的大田移栽。 本发明能够实现优良 丹参品种(系)或株系及珍惜濒危丹参资源的快 速、 工厂化繁育。 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 CN 107810855 A 2018.03.20 CN 107810855 A 1.一种丹参脱毒苗工厂化繁育方。
3、法， 其特征在于由以下步骤组成： (1)选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理； (2)丹参嫩叶或茎尖在初始诱导增殖培养基中培养； (3)丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养； (4)丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养； (5)丹参幼苗的炼苗； (6)丹参幼苗的大田移栽。 2.根据权利要求1所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(1) 选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理的方法是： 选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理； 所述步骤(2)丹参嫩叶或茎尖在初始诱导增殖培养基中培养的方法是： 将脱毒处理的 丹参嫩叶或茎尖置于初始增殖培养基中， 242组培室中， 光照培养2030天进行脱分化 增殖。
4、培养， 光强度为15003000Lx， 光照周期1618h(光)/68h(暗)获得丹参愈伤组织； 所述步骤(3)丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养的方法是： 将获得的丹参愈伤 组织切割成0.20.3cm2小块置于诱导培养基中进行诱导分化培养， 培养条件为： 242， 光照时间为18hh， 获得分化的丹参幼苗； 所述步骤(4)丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养的方法是： 将获得的丹参幼苗 转移至根诱导分化培养基中进行根诱导培养， 培养条件： 242， 光照时间为18h； 所述步骤(5)丹参幼苗的炼苗方法是： 丹参幼苗根长至57厘米， 叶片48个时将培养 瓶打开， 进行一级炼苗处理34天； 将。
5、经过一级炼苗处理的丹参幼苗， 从培养基中移出， 用 水冲洗除掉幼苗植株上带有的培养基， 将其移栽至营养土 蛭石(4 12 1体积比)的混合 土中， 置于202温室大棚中， 大棚湿度5070， 进行二级炼苗处理1218天； 所述步骤(6)丹参幼苗的大田移栽的方法是： 将在温室中复壮的丹参幼苗连同结合的 混合土一起移栽置大田中； 移栽当天浇足水， 后期田间管理同常规种苗。 3.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(1) 中的脱毒处理方法为依次用7075酒精漂洗3050秒， 无菌水漂洗12分钟， 0.1升汞 处理漂洗810分钟， 无菌水漂洗45次， 每次12分钟。
6、。 4.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(1) 中嫩叶为最靠近丹参茎端分生区， 新长出的第12片叶片； 茎尖为丹参茎最端部的分生区， 长度为0.20.4cm。 5.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(2) 中所述的初始增殖培养基组成为1/2MS培养基、 2030g/L白糖、 5.57g/L琼脂粉、 0.5 1mg/L 6-BA、 0.10.3mg/L NAA， pH值5.86.0； 丹参嫩叶或茎尖的脱分化增殖培养组成为 1/2MS、 2030g/L白糖、 5.57g/L琼脂粉、 1.02mg/L 6-BA， pH。
7、值5.86.0。 6.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(3) 中的诱导培养基组成为1/2MS培养基、 2040g/L白糖、 5.58g/L琼脂粉、 0.10.3mg/L IBA， pH值5.86.0； 愈伤组织大小约为0.31.2cm3， 颜色为浅黄或淡绿色， 切割成大小为 0.20.3cm3的小块。 7.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(3) 中的根诱导分化培养基组成为1/2MS、 2030g/L白糖、 5.57g/L琼脂、 0.51.0mg/L IBA， 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 10781。
8、0855 A 2 pH值5.86.0； 丹参幼苗根诱导分化条件为242， 光照1618小时。 8.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(5) 进行一级炼苗处理的丹参幼苗根长度为57厘米， 具有48片叶片。 9.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(5) 中丹参幼苗一级炼苗条件为， 温度242， 湿度5070， 光照1618小时； 丹参幼苗二级 炼苗条件为， 温度202， 湿度5070， 光照1618小时/天。 10.根据权利要求2所述的一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 其特征在于： 所述步骤(6) 丹参幼苗大田移栽方法为。
9、， 将二级炼苗后的丹参幼苗在温室中从穴盘中逐棵取出， 连同结 合的混合土一起移栽置大田中， 移栽当天浇足水后用干土将根覆盖并将植株扶直， 后期田 间管理同常规种苗。 11.丹参脱毒苗工厂化繁育用初始增殖培养基， 其特征在于： 组成为1/2MS、 2030g/L 白糖、 5.57g/L琼脂粉、 0.31mg/L 6-BA、 0.10.3mg/L NAA， pH值5.86.0。 12.丹参脱毒苗工厂化繁育用丹参嫩叶或茎尖的脱分化增殖培养基： 其特征在于： 组成 为1/2MS、 2030g/L白糖、 5.57g/L琼脂粉、 1.02mg/L 6-BA， pH值5.86.0。 13.丹参脱毒苗工厂化繁。
10、育用诱导培养基， 其特征在于组成为1/2MS、 2030g/L白糖、 5.57g/L琼脂、 0.10.3mg/L NAA， pH值5.86.0。 14.丹参脱毒苗工厂化繁育用根诱导分化培养基， 其特征在于： 组成为1/2MS、 2030g/ L白糖、 5.57g/L琼脂粉、 0.51mg/L IBA， pH值5.86.0。 15.丹参脱毒苗工厂化繁育用培养基， 其特征在于包括权利要求11至14所述的培养基 中的一种或几种。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 107810855 A 3 丹参脱毒苗的工厂化繁育方法 技术领域 0001 本发明涉及丹参脱毒苗的工厂化繁育方法， 特别是品质退化。
11、严重、 产量降低、 资源 稀缺丹参野生种、 栽培种或变异种的工厂化繁育方法， 属于植物品种繁育技术领域。 背景技术 0002 丹参(Salvia miltiorrhza Bunge)是大宗中药材之一， 具有显著的活血化瘀功 效， 被广泛用于治疗冠心病、 心绞痛、 缺血性中风等疾病。 目前我国以丹参为原料生产的复 方中药有100多种， 涉及的企业百余家， 对优质丹参药材的需求量巨大。 但由于常年采挖， 丹 参野生资源日益减少。 目前市场供应的丹参主要以栽培种为主， 但在丹参主产区， 由于种苗 生活力退化、 重茬等因素影响， 致使丹参的产量非常不稳定。 发明内容 0003 本发明要解决的技术问题是。
12、提供一种高效、 快速的工厂化丹参脱毒种苗繁育方 法。 0004 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0005 一种丹参脱毒苗工厂化繁育方法， 由以下步骤组成： 0006 (1)选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理； 0007 (2)丹参嫩叶或茎尖在初始诱导增殖培养基中培养； 0008 (3)丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养； 0009 (4)丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养； 0010 (5)丹参幼苗的炼苗； 0011 (6)丹参幼苗的大田移栽。 0012 所述步骤(1)选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理的方法是： 选取丹参嫩叶或茎尖 进行脱毒处理。 0013 所述步骤(2)丹参嫩叶或茎。
13、尖在初始诱导增殖培养基中培养的方法是： 将脱毒处 理的丹参嫩叶或茎尖置于初始增殖培养基中， 242(优选25)无菌室中， 光照培养20 30天(优选25天)进行脱分化增殖培养， 光强度为10003000Lx(优选1000Lx)， 光照周期2- 3h(光)/2221h(暗)(优选1h(光)/22h(暗)获得丹参愈伤组织； 0014 所述步骤(3)丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养的方法是： 将获得的丹参 愈伤组织切割成0.20.3cm2(优选0.25cm2)小块置于诱导培养基中进行诱导分化培养， 培 养条件为： 242(优选25)， 光照时间为1618h小时(优选18小时)， 获得分化的丹参幼。
14、 苗； 0015 所述步骤(4)丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养的方法是： 将获得的丹参 幼苗转移至根诱导分化培养基中进行根诱导培养， 培养条件： 242(优选2325)， 光 照时间为1618h小时(优选18小时)； 0016 所述步骤(5)丹参幼苗的炼苗方法是： 丹参幼苗根长至23厘米， 叶片68片时将 说 明 书 1/7 页 4 CN 107810855 A 4 培养瓶打开， 进行一级炼苗处理34天(优选3天)； 将经过一级炼苗处理的丹参幼苗， 从培 养基中移出， 用水冲洗除掉幼苗植株上带有的培养基， 将其移栽至营养土： 蛭石(4 12 1 体积比， 优选3 1体积比)的混合土中， 。
15、置于242(优选25)温室大棚中， 大棚湿度50 70(优选60)， 进行二级炼苗处理1218天(优选15天)； 0017 所述步骤(6)丹参幼苗的大田移栽的方法是： 将在温室中复壮的丹参幼苗连同结 合的混合土一起移栽置大田中； 移栽当天浇足水， 后期田间管理同常规种苗。 0018 进一步优选的丹参脱毒苗工厂化繁育方法如下： 0019 所述步骤(1)中的脱毒处理方法为依次用7075酒精漂洗3050秒， 无菌水漂 洗12分钟， 0.1升汞处理漂洗810分钟， 无菌水漂洗45次， 每次12分钟。 0020 优选的， 所述步骤(1)中的脱毒处理方法为依次用75酒精漂洗30秒， 无菌水漂洗 1分钟， 。
16、0.1升汞处理漂洗8分钟， 无菌水漂洗5次， 每次1分钟。 0021 所述步骤(1)中嫩叶为最靠近丹参茎端分生区， 新长出的第12片叶片； 茎尖为丹 参茎最端部的分生区， 长度为0.20.4cm。 0022 优选的， 所述步骤(1)中嫩叶为最靠近丹参茎端分生区， 新长出的第23片叶片； 茎尖为丹参茎最端部的分生区， 长度为0.3cm。 0023 所述步骤(2)中所述的初始增殖培养基组成为1/2MS培养基、 2040g/L白糖、 5.5 7g/L琼脂粉、 0.31mg/L 6一BA(6-苄氨基嘌呤)、 0.10.3mg/L NAA(1-萘乙酸)， pH值 5.86.0； 丹参嫩叶或茎尖的脱分化增。
17、殖培养组成为1/2MS、 2040g/L白糖、 57g/L琼脂、 12mg/L6-BA， pH值5.86.0。 0024 优选的， 所述步骤(2)中所述的初始增殖培养基的组成为1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L 琼脂粉、 0.5mg/L 6-BA、 0.2mg/LNAA， pH值5.8。 0025 优选的， 所述步骤(2)中的丹参嫩叶或茎尖的脱分化增殖培养基的组成为1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 1mg/L 6-BA， Ph值5.8。 0026 所述步骤(3)中的诱导培养基组成为1/2MS、 2040g/L白糖、 57g/L琼脂、 0.1 0.3mg/L NAA， pH值。
18、5.86.0； 愈伤组织大小约为0.81.2cm3， 颜色为浅黄或淡绿色， 切割 成大小为0.20.3cm3的小块。 0027 优选的， 所述步骤(3)中的根诱导培养基组成为1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 1.0mg/L IBA(吲哚丁酸)， pH值5.8。 0028 优选的， 所述步骤(3)中的愈伤组织大小约为1cm3， 颜色为浅黄或淡绿色， 切割成 大小为0.25cm3的小块。 0029 所述步骤(3)中的根诱导分化培养基组成为1/2MS、 2040g/L白糖、 48g/L琼脂、 0.51mg/L IBA， pH值5.86； 丹参幼苗根诱导分化条件为232， 光照610小时。
19、。 0030 所述步骤(4)丹参幼苗根诱导分化条件为23， 光照18小时。 0031 所述步骤(5)进行一级炼苗处理的丹参幼苗根长度为56厘米， 具有48片叶片。 0032 所述步骤(5)中丹参幼苗一级炼苗条件为， 温度202， 湿度5065， 光照14 18小时； 丹参幼苗二级炼苗条件为， 温度242， 湿度5065， 光照1618小时/天。 0033 优选的， 所述步骤(5)中丹参幼苗一级炼苗条件为， 温度20， 湿度60， 光照18小 时/天。 0034 优选的， 所述步骤(5)中丹参幼苗二级炼苗条件为， 温度25， 湿度60， 光照18小 说 明 书 2/7 页 5 CN 107810。
20、855 A 5 时/天。 0035 所述步骤(6)丹参幼苗大田移栽方法为， 将二级炼苗后的丹参幼苗在温室中从穴 盘中逐棵取出， 连同结合的混合土一起移栽置大田中， 移栽当天浇足水后用干土将根覆盖 并将植株扶直， 后期田间管理同常规种苗。 0036 本发明的第二个方面， 提供了一种用于丹参脱毒苗工厂化繁育的培养基， 包括但 不限于初始增殖培养基、 嫩叶或茎尖的脱分化增殖培养基、 诱导培养基和根诱导分化培养 基中的一种或几种。 0037 丹参脱毒苗工厂化繁育用初始增殖培养基， 组成为1/2MS、 2040g/L白糖、 57g/ L琼脂粉、 0.31mg/L 6-BA、 0.10.3mg/L NAA。
21、， pH值5.86.0。 优选组成为1/2MS、 30g/L白 糖、 6g/L琼脂粉、 0.5mg/L 6-BA、 0.2mg/L NAA， pH值5.8。 0038 丹参脱毒苗工厂化繁育用丹参嫩叶或茎尖的脱分化增殖培养基： 组成为1/2MS、 20 40g/L白糖、 58g/L琼脂粉、 0.52mg/L 6-BA， pH值5.86.0。 优选组成为1/2MS、 30g/L 白糖、 6g/L琼脂粉、 1mg/L 6-BA， pH值5.8。 0039 丹参脱毒苗工厂化繁育用诱导培养基， 组成为1/2MS、 2040g/L白糖、 58g/L琼 脂、 0.10.3mg/L IBA， pH值56。 优。
22、选组成为1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 0.2mg/L NAA， pH值5.8。 0040 丹参脱毒苗工厂化繁育用根诱导分化培养基， 组成为1/2MS、 2040g/L白糖、 4 8g/L琼脂、 0.51mg/L IBA， pH值5.86.0。 优选的组成为1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 0.2mg/L IBA， pH值5.8。 0041 丹参脱毒苗工厂化繁育用培养基， 包括上述培养基中的一种或几种。 根据繁育阶 段的操作需要， 可以单独选择其中的一种单独使用或选择多种组合使用。 0042 本发明是采用高度优化的初始诱导增殖培养基对丹参无菌嫩叶或茎尖进行脱分 化。
23、及诱导增殖培养， 获得脱毒且具有进一步分化能力的丹参愈伤组织。 采用该培养基可以 大幅度提高丹参营养器官(叶片)的脱分化形成愈伤组织的能力。 将获得的丹参愈伤组织转 移到优化的高效分化培养基中， 进行愈伤诱导增殖培养， 获得分化丹参株系。 将获得的分化 的丹参株系转移到根诱导培养基中， 进行丹参幼苗的根诱导生长。 本发明优化建立的分化 培养基可以显著提高丹参愈伤组织的再分化形成外植体的能力； 优化建立的根诱导培养基 可以显著提高丹参外植体的根生成能力， 使其根系更发达， 提高移栽成活率。 这其中各个培 养基配方中激素的浓度及激素间的配伍使用对丹参营养器官脱分化、 愈伤组织再分化、 根 形成至关。
24、重要。 0043 将具有24片叶片及根系的丹参幼苗经开瓶炼苗、 温室移栽炼苗后进行大田种 植。 通过该方法， 可以利用一个茎尖或一个嫩叶实现优质丹参资源的快速、 高效无限次种苗 繁育， 满足种植户对优质种苗的需求， 且可以极大程度上降低育种成本。 可以实现丹参脱毒 种苗的快速繁殖， 提高丹参产量， 对于确保丹参种苗供给， 提高丹参亩产量具有重要价值。 0044 传统的指丹参育苗生产周期约34个月。 通过实施本发明， 苗出圃时间大幅缩短， 一般2个月可以出圃， 并且该本发明不受生长季节的限制， 可实现一年多次随时供苗。 该方 法具有成活率高、 脱毒率高的优点， 成活率达95以上， 脱毒率达100。
25、， 具有很好的技术效 果和推广前景。 通过实施本发明， 通过脱毒处理， 将离体材料的部分病毒钝化， 减少病毒的 危害， 可有效防治丹参病毒、 疫病等发生， 保障丹参药材品质优良。 本发明能够实现优良丹 说 明 书 3/7 页 6 CN 107810855 A 6 参品种(系)或株系及珍惜濒危丹参资源的快速、 工厂化、 规模化、 集约化地繁殖生产。 附图说明 0045 图1为丹参嫩叶、 茎尖在初始增殖培养基中脱分化、 增殖形成愈伤组织 0046 图2为丹参愈伤组织在分化培养基中的诱导分化培养形成不定芽、 苗 0047 图3为丹参幼苗在根诱导培养基中的诱导根分化培养 0048 图4为丹参幼苗的一级。
26、炼苗处理 0049 图5为丹参幼苗的二级炼苗处理 0050 图6为丹参幼苗的大田移栽 0051 图7为丹参后期生长情况 0052 图8为丹参移植于整好的土地中 具体实施方式 0053 实施例1 0054 一、 材料 0055 1.丹参： 三倍体丹参(由南开大学染色体实验室培育， .三倍体丹参的培育及其可 持续利用研究， 中草药， 2012年2月， 第43卷第2期， 375-379) 0056 2.升汞： 购于上海生物工程有限公司 0057 3.初始增殖培养基： 1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 0.5mg/L 6-BA、 0.2mg/L NAA， pH 值5.8。 按重量/体积比。
27、配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0058 4.脱分化增殖培养基： 为1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 1mg/L 6-BA， pH值5.8。 按重 量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0059 5.诱导培养基： 1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 0.2mg/L NaA， pH值5.8。 溶剂为水。 0060 6.根诱导分化培养基为： 1/2MS、 30g/L白糖、 6g/L琼脂、 0.5mg/L IBA， pH值5.8。 按 重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0061 二、 方法 0062 1.选取丹参嫩叶或茎尖进。
28、行脱毒处理： 选取丹参最靠近丹参茎端分生区的新长出 的第12片叶片或丹参茎最端部的分生区长度为0.3cm的茎尖进行脱毒处理。 脱毒处理方 法为依次用75酒精漂洗30秒， 无菌水漂洗1分钟， 0.1升汞处理漂洗10分钟， 无菌水漂洗 5次， 每次1分钟。 0063 2.丹参嫩叶或茎尖在初始诱导增殖培养基中培养： 将脱毒处理的丹参嫩叶或茎尖 置于初始增殖培养基中， 25无菌室中， 光照培养25天进行脱分化增殖培养， 光强度为 2000Lx光照周期2(光)/22h(暗)获得丹参愈伤组织。 0064 3.丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养： 将获得的丹参愈伤组织(大小约为 1cm3， 颜色为浅黄或淡。
29、绿色)切割成0.25cm3的小块， 置于诱导培养基中进行诱导分化培养， 培养条件为： 25， 光照时间为18小时， 获得分化的丹参幼苗。 0065 4.丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养： 将获得的丹参幼苗转移至根诱导分 化培养基中进行根诱导培养， 培养条件： 23， 光照时间为18小时。 0066 5.丹参幼苗的炼苗： 丹参幼苗根长至46厘米， 叶片68片时将培养瓶打开， 进行 说 明 书 4/7 页 7 CN 107810855 A 7 一级炼苗处理3天， 一级炼苗条件为， 温度23， 湿度60， 光照16小时/天。 将经过一级炼苗 处理的丹参幼苗， 从培养基中移出， 用水冲洗除掉幼苗植。
30、株根部带有的培养基， 将其移栽至 营养土： 蛭石(3 1体积比)的混合土中， 置于25温室大棚中， 大棚湿度60， 光照18小时/ 天， 进行二级炼苗处理15天。 0067 6.丹参幼苗大田移栽方法为， 将二级炼苗后的幼苗从穴盘中逐棵取出， 移植于整 好的土地中， 浇足水后用土将根覆盖并将植株扶直。 0068 三、 结果 0069 选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理， 并在在初始诱导增殖培养基中培养获得丹参 愈伤组织(图1， 图2)， 愈伤组织形成率为100， 脱毒率为100， 其愈伤组织较之传统培养 基提高30以上。 丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养获得分化的丹参幼苗及不定 芽， 其再分化能。
31、力为98(图3)。 丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养， 其根诱导率可 高达97(图4)。 丹参幼苗的炼苗： 丹参幼苗根长至23厘米， 叶片68片时将培养瓶打开， 进行一级炼苗处理3天， 一级炼苗成活率为95(图5)。 将经过一级炼苗处理的丹参幼苗， 从 培养基中移出， 用水冲洗除掉幼苗植株根部带有的培养基， 将其移栽至营养土： 蛭石(3 1体 积比)的混合土中， 置于25温室大棚中， 大棚湿度60， 光照18小时/天， 进行二级炼苗处 理15天， 在此过程中幼苗成活率为95以上。 将二级炼苗后的幼苗从穴盘中逐棵取出， 移植 于整好的土地中(图6图8)， 浇足水后用土将根覆盖并将植株扶直， 。
32、大田种植成活率为 93以上。 0070 实施例2 0071 一、 材料 0072 1.丹参： 三倍体丹参(由南开大学染色体实验室培育， (由南开大学染色体实验室 培育， .三倍体丹参的培育及其可持续利用研究， 中草药， 2012年2月， 第43卷第2期， 375- 379) 0073 2.升汞： 购于上海生物工程有限公司 0074 3.初始增殖培养基： 1/2MS、 25g/L白糖、 6g/L琼脂粉、 0.5mg/L 6-BA、 0.2mg/L IBA， pH值5.8。 按重量/体积比配制， 溶剂为水。 并用22 m微孔滤膜过滤及经常规高压灭菌后使 用。 0075 4.脱分化增殖培养基： 为1。
33、/2MS、 25/L白糖、 6.5g/L琼脂粉、 1mg/L 6-BA， pH值5.8。 按重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0076 5.诱导培养基： 1/2MS、 25g/L白糖、 6.5g/L琼脂粉、 0.2mg/L IBA， pH值5.8。 溶剂为 水。 0077 6.根诱导分化培养基为： 1/2MS、 25g/L白糖、 6.5g/L琼脂、 0.5mg/L IBA， pH值5.8。 按重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0078 二、 方法 0079 1.选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理： 选取丹参最靠近丹参茎端分生区的新长出 的第12片叶片或丹。
34、参茎最端部的分生区长度为0.3cm的茎尖进行脱毒处理。 脱毒处理方 法为依次用75酒精漂洗30秒， 无菌水漂洗2分钟， 0.1升汞处理漂洗10分钟， 无菌水漂洗 5次， 每次2分钟。 0080 2.丹参嫩叶或茎尖在初始诱导增殖培养基中培养： 将脱毒处理的丹参嫩叶或茎尖 说 明 书 5/7 页 8 CN 107810855 A 8 置于初始增殖培养基中， 25无菌室中， 光照培养25天进行脱分化增殖培养， 光强度为 2500Lx光照周期18h(光)/6h(暗)获得丹参愈伤组织。 0081 3.丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养： 将获得的丹参愈伤组织(大小约为 1cm3， 颜色为浅黄或淡绿色)。
35、切割成0.2cm3的小块， 置于诱导培养基中进行诱导分化培养， 培 养条件为： 23， 光照时间为18小时， 获得分化的丹参幼苗。 0082 4.丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养： 将获得的丹参幼苗转移至根诱导分 化培养基中进行根诱导培养， 培养条件： 25， 光照时间为18小时。 0083 5.丹参幼苗的炼苗： 丹参幼苗根长至46厘米， 叶片68片时将培养瓶打开， 进行 一级炼苗处理3天， 一级炼苗条件为， 温度25， 湿度50， 光照16小时/天。 将经过一级炼苗 处理的丹参幼苗， 从培养基中移出， 用水冲洗除掉幼苗植株根部带有的培养基， 将其移栽至 营养土： 蛭石(2 1体积比)的混。
36、合土中， 置于25温室大棚中， 大棚湿度60， 光照16小时/ 天， 进行二级炼苗处理15天。 0084 6.丹参幼苗大田移栽方法为， 将二级炼苗后的幼苗从穴盘中逐棵取出， 移植于整 好的土地中， 浇足水后用土将根覆盖并将植株扶直。 0085 三、 结果 0086 选取丹参嫩叶或茎尖进行脱毒处理， 并在在初始诱导增殖培养基中培养获得丹参 愈伤组织， 愈伤组织形成率为100， 脱毒率为100， 其愈伤组织较之传统培养基提高30 以上。 丹参愈伤组织在分化培养基中的分化培养获得分化的丹参幼苗及不定芽， 其再分化 能力为98。 丹参幼苗在根诱导培养基中的根诱导培养， 其根诱导率可高达97。 丹参幼苗。
37、 的炼苗： 丹参幼苗根长至46厘米， 叶片68个时将培养瓶打开， 进行一级炼苗处理7天， 一 级炼苗成活率为95。 二级炼苗处理， 幼苗成活率为95以上。 大田种植成活率为93以 上。 0087 实施例3丹参脱毒苗工厂化繁育用培养基 0088 由下述培养基中的一种或多种组成： 0089 1.初始增殖培养基： 1/2MS、 30g/L白糖、 6.2g/L琼脂粉、 0.5mg/L 6-BA、 0.2mg/ LNAA， pH值5.8。 按重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0090 2.脱分化增殖培养基： 为1/2MS、 30g/L白糖、 6.2g/L琼脂、 1mg/L 6-BA。
38、， pH值5.8。 按 重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0091 3.诱导培养基： 1/2MS、 30g/L白糖、 6.2g/L琼脂粉、 0.2mg/L NAA， pH值5.8。 溶剂为 水。 0092 4.根诱导分化培养基为： 1/2MS、 30g/L白糖、 6.2g/L琼脂、 0.2mg/L IBA， pH值5.8。 按重量/体积比配制， 并用22 m微孔滤膜过滤及经常规高压灭菌后使用。 溶剂为水。 0093 实施例4丹参脱毒苗工厂化繁育用培养基 0094 由下述培养基中的一种或多种组成： 0095 1.初始增殖培养基： 1/2MS、 20g/L白糖、 5.5g/L。
39、琼脂、 0.3mg/L6-BA、 0.1mg/L IBA， pH值5.0。 溶剂为水。 1/2MS、 20g/L白糖、 58g/L琼脂、 0.31mg/L 6-BA、 0.10.3mg/L NAA， pH值5.86.0 0096 2.脱分化增殖培养基： 为1/2MS、 20g/L白糖、 6.0g/L琼脂粉、 0.5mg/L 6-BA， pH值 5.8。 按重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 1/2MS、 2040g/L白糖、 5 说 明 书 6/7 页 9 CN 107810855 A 9 8g/L琼脂、 0.52mg/L 6-BA， pH值56。 0097 3.诱导培养基。
40、： 1/2MS、 20g/L白糖、 6g/L琼脂粉、 0.1mg/L NAA， pH值5.8。 溶剂为水。 诱导培养基组成为1/2MS、 20/L白糖、 58g/L琼脂、 0.10.3mg/L IBA， pH值56 0098 4.根诱导分化培养基为： 1/2MS、 30g/L白糖、 6.2g/L琼脂粉、 0.5mg/L IBA， pH值 5.8。 按重量/体积比配制， 经常规高压灭菌后使用。 溶剂为水。 1/2MS、 25g/L白糖、 7g/L琼脂 粉、 0.7mg/L IBA， pH值6.0 0099 实施例5丹参脱毒苗工厂化繁育用培养基 0100 由下述培养基中的一种或多种组成： 0101。
41、 1.初始增殖培养基： 1/2MS、 40g/L白糖、 7.5g/L琼脂粉、 1mg/L 6-BA、 0.5mg/LNAA， pH值6.0。 溶剂为水。 0102 2.脱分化增殖培养基： 为1/2MS、 40g/L白糖、 8g/L琼脂粉、 2mg/L 6-BA， pH值6.0。 按 重量/体积比配制， 溶剂为水。 经常规高压灭菌后使用。 0103 3.诱导培养基： 1/2MS、 40g/L白糖、 7g/L琼脂、 0.5mg/L NAA， pH值6。 溶剂为水。 0104 4.根诱导分化培养基为： 1/2MS、 20g/L白糖、 8g/L琼脂、 2mg/L IBA， pH值6.0。 按重 量/体积比配制， 经常规高压灭菌后使用。 溶剂为水。 说 明 书 7/7 页 10 CN 107810855 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 11 CN 107810855 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/4 页 12 CN 107810855 A 12 图5 图6 说 明 书 附 图 3/4 页 13 CN 107810855 A 13 图7 图8 说 明 书 附 图 4/4 页 14 CN 107810855 A 14 。