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1、(10)申请公布号 CN 102988467 A (43)申请公布日 2013.03.27 CN 102988467 A *CN102988467A* (21)申请号 201110274642.7 (22)申请日 2011.09.16 A61K 36/481(2006.01) A61P 1/16(2006.01) (71)申请人 上海中医药大学附属曙光医院 地址 200021 上海市卢湾区普安路 185 号 (72)发明人 徐列明 张展 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 王函 (54) 发明名称 黄芪总甙在制备抑制肝星状细胞迁移的药物 中的应用 (57)。
2、 摘要 本发明公开了黄芪总甙在制备抑制肝星状细 胞迁移的药物中的应用。本发明设计了以 PDGF 诱导的人肝星状细胞株 (LX-2) 迁移的筛选平台， 发现 10-4mol/L 10-7mol/L 的黄芪总甙均可抑制 PDGF 诱导的肝星状细胞 (HSC) 的迁移。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 黄芪总甙在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述黄芪总甙抑制肝星状细胞迁。
3、移的有效 浓度为 10-4mol/L 10-7mol/L。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述黄芪总甙抑制肝星状细胞迁移的有效 浓度为 10-6mol/L。 权 利 要 求 书 CN 102988467 A 2 1/6 页 3 黄芪总甙在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应用 技术领域 0001 本发明属中药领域， 具体涉及黄芪总甙在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中的应 用。 背景技术 0002 黄芪总甙又名黄芪总苷， 是黄芪中提取出来的主要成分， 含黄酮类成分毛蕊异黄 酮 (calycosin)、 3- 羟基 -9， 10- 二甲氧基紫檀烷， 还含黄芪皂甙 I、 V、 III。
4、(astragaloside I、 V、 III)。有抗病毒 (II 型人疱疹病毒、 乙肝病毒 )、 保肝、 抑制肝癌细胞株的增殖和诱导 其凋亡、 改善心脏功能、 抗炎镇痛等作用。黄芪总甙的动物实验研究表明， 能明显抑制中性 粒细胞的增生和降低炎症关节局部的细胞因子， 如白细胞介素 -1 和一氧化氮的水平， 减轻 一氧化氮引起的软骨细胞凋亡等， 而且毒性低， 副作用小。 黄芪总甙的基本生物学作用为免 疫调节， 这方面的工作除完成一般免疫指标的测定外， 还进行了有关作用机制的研究， 包括 对 T 细胞、 B 细胞、 杀伤细胞、 肿瘤坏死因子、 白细胞介素、 过氧化物、 一氧化氮等细胞及体液 因子。
5、的作用， 结果表明黄芪总甙为一优秀的免疫调节剂， 某些方面超过人参皂甙， 在此基础 上完成或正在进行与某些疾病有关的药效学试验 ： 例如关节炎 ： 完成 14 个模型的研究， 结 果表明 ： 黄芪总甙与同类西药比， 不仅有抗炎镇痛作用， 而且黄芪总甙治疗风湿性、 类风湿 性关节炎具有疗效好、 起效快、 不良反应少等优点。柏长青等研究发现黄芪、 党参提取物浓 度达到40(V/V)能够抑制NCI-H446诱导的血管内皮细胞(ECV-304)迁移， 并且具有显著 的量效关系。 0003 各种肝脏疾病， 如慢性乙型肝炎、 慢性丙型肝炎， 酒精性或非酒精性脂肪性肝病， 自身免疫性肝病， 药物性肝病， 慢。
6、性血吸虫病以及一些代谢性或先天性慢性肝病都可通过 肝纤维化发展成肝硬化。 0004 肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell， HSC)在肝纤维化的发生发展中起着关键作 用。在肝脏炎症状态下， HSC 经多种细胞因子如血小板衍生生长因子 (PDGF) 和转化生长因 子1(TGF-1)的激活， 活化为肌成纤维细胞并大量增殖， 表达-平滑肌肌动蛋白、 合成 分泌大量细胞外基质， 细胞可以收缩， 亦可从 Disse 腔内向肝细胞坏死区域迁移聚集。肝纤 维化进程中， HSC 所表现出的迁移特性， 可导致炎症区域活化的 HSC 数目增多， 而加重病灶 局部的纤维化程度， 促使疾病进展。所以。
7、， 如能抑制 HSC 在肝损伤时向炎症区域迁移， 就可 能干扰或减轻肝纤维化的进程， 达到抗肝纤维化的目的。 0005 而 HSC 的迁移受到多种细胞因子和细胞外基质成分的调控， 如， PDGF、 TGF-1 等 ； 其中 PDGF 是最强的促进 HSC 增殖迁移的刺激因子。为此， 本发明设计了以 PDGF 诱导的人 肝星状细胞株(LX-2)迁移的筛选平台， 筛选出黄芪总甙抑制HSC迁移的适宜浓度及其最佳 的工作浓度。目前， 对黄芪总甙在抑制肝星状细胞迁移中的作用尚未见相关报道。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题在于提供黄芪总甙的新用途。 说 明 书 CN 102988467 A 3。
8、 2/6 页 4 0007 为解决上述技术问题， 本发明提供黄芪总甙在制备抑制肝星状细胞迁移的药物中 的应用。 0008 所述黄芪总甙抑制肝星状细胞迁移的有效浓度为 10-4mol/L 10-7mol/L， 优选为 10-6mol/L。 0009 本发明设计了以 PDGF 诱导的人肝星状细胞株 (LX-2) 迁移的筛选平台， 筛选出黄 芪总甙抑制 HSC 迁移的适宜浓度及其最佳的工作浓度。实验证明 ： 10-4mol/L、 10-5mol/L、 10-6mol/L和10-7mol/L 4个浓度梯度的黄芪总甙均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移。 10-4mol/ L 组、 10-5mol/L 组。
9、、 10-6mol/L 组抑制作用相似无统计学差异， 10-7mol/L 抑制作用较弱且与 其它 3 组间有显著差异 (P 均 0.05)。在与迁移同等条件下培养细胞时发现， 10-4mol/L 组 部分胞体回缩成卵圆形， 其余 3 组较正常组细胞形态无任何改变。遵从药物筛选原则， 排除 10-4mol/L 黄芪总甙， 选择有统计学差异中的低浓度者， 即抑制迁移效率最佳者 ； 因此， 选择 黄芪总甙最佳药物浓度为 10-6mol/L。从而本发明验证了 10-4mol/L 10-7mol/L 的黄芪总 甙均可抑制 PDGF 诱导的肝星状细胞 (HSC) 的迁移， 从而可干扰或减轻肝纤维化的进程，。
10、 达 到抗肝纤维化的效果， 即本发明验证了黄芪总甙可用于制备抑制肝星状细胞迁移的药物。 附图说明 0010 图 1 是本发明试验例中细胞迁移杯 (Transwell) 的示意图 ； 细胞迁移杯为一个可 放置在孔板里的小杯子， 其关键部分就是杯底层一张半透膜 ( 一般是聚碳酸酯膜 ) 此膜有 密度均一的许多微孔， 孔径为 8.0m。将 Transwell 放入 24 孔培养板中形成 Transwell 与 培养板的双腔系统， Transwell 内称上室， 培养板内称下室， 上下层培养液以半透膜相隔。 将细胞种在上室内， 由于聚碳酸酯膜有通透性， 下层培养液中的成分可以影响到上室内的 细胞， 上。
11、层中的细胞亦可迁移至下层， 从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、 运动 等的影响。 0011 图2是本发明试验例中不同浓度黄芪总甙对LX-2迁移和形态学的影响示意图 ； 图 2A 表示对 PDGF 诱导的人 LX-2 迁移的抑制 ( 苏木素染色， 200) ； 图 2B 表示对 LX-2 形态 的影响， 200。 具体实施方式 ： 0012 以下通过试验例对本发明黄芪总甙的药理活性试验及结果作进一步的阐述 ： 0013 试验例 ： 0014 一、 材料与方法 0015 ( 一 ) 材料 0016 黄芪总甙 ： Astragaloside， 分子式(C41H68O51)， 分子量785， 。
12、纯度95(by高效液 相色谱法 HPLC)， 购自于南京泽朗医药科技有限公司。 0017 人肝星状细胞株 LX-2， 其制备方法为 ： 约 15g 重正常人肝脏组织先后经链酶蛋白 酶和胶原酶消化后， 由 8.2 Nycodenz 离心分离得肝星状细胞 (HSC)。细胞用含 10胎牛 血清的M199培养液培养。 当细胞长满培养皿后， 用胰蛋白酶和EDTA消化传代， 每7-10传代 一次。当 HSC 培养传到 4 代， 将 SV40T- 抗原 DNA 转染入 HSC， 获得细胞株 LX-1。该细胞用 含10胎牛血清的DMEM培养液培养7代后， 与原代细胞相比形态发生明显变化， 增殖加快。 说 明 。
13、书 CN 102988467 A 4 3/6 页 5 LX-2 是以含 1胎牛血清的 DMEM 培养液培养半年后筛选得到的耐低血清 (2胎牛血清 ) 培养的细胞株(具体参见L Xu， A Y Hui， E Albanis， M J Arthur， S M O Byrne， WS Blaner， P Mukherjee， S L Friedman， F J Eng.Human hepatic stellate cell lines， LX-1and LX-2 ： new tools for analysis of hepatic fibrosis Gut 2005 ； 54 ： 142-151.。
14、)。 0018 0.1 I 型胶原溶液 (Col I， lot 107K2331)( 美国 sigma 公司 )。 0019 PDGF( 血小板衍生生长因子 )， 分子量 12.4kDa， Cat.No.220BB， 纯度 97 (SDS PAGE) 购于 R&D Systems， Inc。 0020 ( 二 ) 方法 0021 1. 黄芪总甙浓度配制 ： 0022 黄芪总甙取 20mg。 0023 黄芪总甙溶于 2.5ml DMSO( 二甲基亚砜 ) 中， 成 10-2mol/L 储存液。 0024 将上述黄芪总甙储存液均分别经 0.45m 滤膜过滤除菌， 以含 3 FBS 的 DMEM 培。
15、 养基依次稀释为 10-4mol/L， 10-5mol/L， 10-6mol/L， 10-7mol/L 共 4 个浓度梯度。 0025 2. 细胞迁移筛选实验 ( 采用如图 1 所示的细胞迁移杯 ) 0026 (1) 细胞培养与药物孵育 ： 0027 将 LX-2 用含 10 FBS DMEM 在 100mm 的培养皿中培养至细胞密度达到 80左 右。于迁移实验开始前 24h， 将细胞按表 1 或表 2 分组， 每组 1 皿并将培养液更换为 3 FBSDMEM。于迁移实验开始 12h 前， 按照分组情况加入培养液或相应药物的浓度进行孵育， 药物孵育时间为 12h。 0028 表 1. 黄芪总甙。
16、筛选实验细胞分组和孵育用药 0029 0030 表 2. 黄芪总甙的最佳浓度统一筛选实验细胞分组和孵育用药 0031 0032 (2) 以 I 型胶原包被细胞迁移杯半透膜 ： 0033 将 I 型胶原用 DMEM 以 1 100 稀释至 10g/ml(Col I 溶液 )。取 24 孔板， 加入 Col I 溶液 600l/ 孔 ； 用无菌镊子取细胞迁移杯放入加有 Col I 溶液的培养孔内， 在每个 细胞迁移杯内加入 Col I 溶液 400l。放入恒温箱， 37， 45min。 0034 (3) 接种细胞 ： 说 明 书 CN 102988467 A 5 4/6 页 6 0035 从恒温箱。
17、中取出孵育培养 24h 的 LX-2， 用胰蛋白酶传代细胞后， 用含 3 FBS 的 DMEM 重悬细胞并调整细胞数为 2 4105个 /ml。取出己包被 Col I 溶液的细胞迁移杯， 吸弃细胞迁移杯内液体并用 DMEM 清洗 2 次， 移入另一 24 孔板 ( 每孔预加 0.5ml 含 3 FBS 的 DMEM)。每个细胞迁移杯内加入 300l 细胞悬液， 放入 CO2培养箱， 37， 1h。 0036 (4) 药物配制与添加 ： 0037 PDGF 的添加 ： 将接种有 LX-2 的细胞迁移杯取出， 吸弃上层培养液后移入另一 24 孔板， 并依照表 1 或表 2 加药 ( 每组 3 孔 。
18、) ； 含 PDGF 各组中加入 PDGF 并使其终浓度为 10ng/ml。 0038 黄芪总甙筛选 ： 将黄芪总甙依照表 3 加药 ( 每组 3 孔 )。本实验重复 3 次。 0039 表 3 黄芪总甙筛选实验药物添加表 0040 0041 黄芪总甙的最佳浓度统一筛选 ： 以含 3 FBS 的 DMEM 配制 ； 筛选出的黄芪总甙 的最佳浓度， 依照表 4 加药 ( 每组 3 孔 )。本实验重复 3 次。 0042 表 4 黄芪总甙的最佳浓度统一筛选实验药物添加表 0043 0044 (5) 细胞培养 ： 0045 将加入各相应药物的培养装置放入 CO2培养箱， 37， 6h。 0046 (。
19、6) 细胞固定与染色 ： 0047 取出细胞迁移杯， PBS 清洗 2 次 ； 医用消毒棉签轻轻擦去细胞迁移杯底部半透膜内 侧面未迁移的细胞， PBS 清洗 2 次 ； 将其放入盛有 4多聚甲醛的 24 孔板内固定 10min， PBS 清洗 1 次 ； 放入盛有苏木素的 24 孔板染色 10min， PBS 清洗 2 次 ； 放入盛有 100酒精 24 孔 板中固定 1min ； 室温自然晾干。用手术刀片小心将半透膜自细胞迁移杯底部取下， 置于载 说 明 书 CN 102988467 A 6 5/6 页 7 玻片上， 中性树胶封片。 0048 (7) 细胞计数 ： 0049 200 倍显微镜。
20、下观察细胞， 由上至下取 5 个视野计数。 0050 (8) 统计学方法 ： 0051 将每样本 5 个视野细胞数相加， 求得均数。用 SPSS13.0 统计软件进行数据分析处 理， 结果以表示， 采用单因素方差分析， Q 检验。 0052 (9) 药物筛选原则 ： 0053 选择对细胞生长和形态无影响的黄芪总甙浓度。 0054 在满足上条规定的前提下， 选择同一黄芪总甙同批迁移试验中迁移细胞数量少 而有统计学差异的浓度低者， 即抑制迁移效率最佳者。如各浓度间迁移细胞数量无统计学 差异， 则选择抑制迁移效果最佳者， 即迁移细胞数量绝对值最小者。 0055 在筛选出的黄芪总甙最佳浓度的同批迁移实。
21、验结果中， 选择有统计学差异抑制 率最高者。 0056 3. 细胞生长和形态观察实验 0057 在 24 孔板中培养 LX-2， 培养条件、 时间和药物添加均同上述各细胞迁移筛选实 验。各实验均重复 3 次。 0058 二、 结果 0059 黄芪总甙抑制 PDGF 致细胞迁移的浓度筛选实验结果如图 2 所示， 与空白组相比， PDGF 组可有效诱导 LX-2 迁移， 其差异有统计学意义 (P 0.05)。10-4mol/L、 10-5mol/L、 10-6mol/L和10-7mol/L 4个浓度的黄芪总甙均可抑制PDGF诱导的LX-2迁移(P均0.05)。 10-4mol/L 组、 10-5m。
22、ol/L 组、 10-6mol/L 组抑制作用相似无统计学差异， 10-7mol/L 抑制作用较 弱且与其它 3 组间有显著差异 (P 均 0.05)( 见表 5， 图 2A)。在与迁移同等条件下培养细 胞时发现， 10-4mol/L组部分胞体回缩成卵圆形， 其余3组较正常组细胞形态无任何改变(见 图 2B)。遵从药物筛选原则， 排除 10-4mol/L 黄芪总甙， 选择有统计学差异中的低浓度者， 即 抑制迁移效率最佳者 ； 因此， 选择黄芪总甙最佳药物浓度为 10-6mol/L。 0060 表 5 黄芪总甙抑制细胞迁移的数量比较 0061 0062 与空白组比较， * ： P 0.05 ； 。
23、与 PDGF 组比较， # ： P 0.05 ； 0063 与 10-6mol/L 黄芪总甙组比较， ： P 0.05 0064 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述 ： 说 明 书 CN 102988467 A 7 6/6 页 8 0065 实施例 1 0066 按本领域技术人员公知的方法将本发明黄芪总甙制成片剂。黄芪总甙片剂， 每片 含黄芪总甙 20mg， 微晶纤维素 15mg， 微粉硅胶 15mg， 硬脂酸镁 0.5mg， 乳糖 8mg。用法 ： 每次 1 片， 每日 2-3 次， 每周用药 5-6 天， 每 3-4 周为一疗程。 0067 实施例 2 0068 按本领域技术人员公知的方。
24、法将本发明黄芪总甙制成胶囊剂。黄芪总甙胶囊剂， 每粒含黄芪总甙 20mg， 微晶纤维素 15mg， 乳糖 10mg。用法 ： 每次 1 粒， 每日 2-3 次， 每周用 药 5-6 天， 每 3-4 周为一疗程。 0069 实施例 3 0070 按本领域技术人员公知的方法将本发明黄芪总甙制成颗粒剂。黄芪总甙颗粒剂， 每袋含黄芪总甙 20mg， 微晶纤维素 15mg， 微粉硅胶 15mg， 硬脂酸 0.5mg， 乳糖 8mg。用法 ： 每 次 1 袋， 每日 2-3 次， 每周用药 5-6 天， 每 3-4 周为一疗程。 0071 实施例 4 0072 按本领域技术人员公知的方法将本发明黄芪总甙制成注射剂。黄芪总甙注射剂， 每支含黄芪总甙 70mg。用法 ： 每次 1 支， 每日 1 次， 每周用药 5-6 天， 每 3-4 周为一疗程。 说 明 书 CN 102988467 A 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102988467 A 9 2/2 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102988467 A 10 。