一种耐高温棉花杂交种的选育方法
技术领域
本发明涉及一种耐高温棉花杂交种的选育方法，专用于耐高温棉花杂交品种 的选育，属于农作物抗逆育种领域。
背景技术
全球气候变暖已经引起了农业学家们的广泛关注。根据预计，到本世纪下叶 气温将升高1.4～5.8℃，而且极端气候如高温、干旱等将会更加频繁发生。随着全 球气候的变暖，高温胁迫已成为影响作物生产的一个重要因素。模拟结果表明， 如不采取措施，到本世纪后半期，我国的小麦、水稻、玉米等几种主要农作物产 量最多可能下降37％。在我国棉花种植区域，特别是长江流域棉区，周期性的高 于35℃的热害在7至8月份期间经常发生，此时棉花正处于盛花期和结铃期，从而 影响授粉受精，导致蕾铃脱落，并严重影响结铃率和皮棉产量。为了稳定棉花产 量，适应当前的植棉环境和将来变暖的气候条件，选育耐高温的棉花品种已成为 迫切的育种目标。
研究者们曾将在田间或人工气候室中棉株结铃的高度(Feaster CV and Turcotte EL(1985).Use of heat tolerance in cotton breeding.In：National Cotton Council of America，ed.Proceedings of the Beltwide Cotton Conference.National Cotton Council， Memphis，TN.364-366)、生殖阶段的铃重和结铃率等农艺性状(Brown PW and Zeiher CA(1998).Varietal response to heat stress during reproductive development.In： National Cotton Council of America，ed.Proceedings of the Beltwide Cotton Conference.National Cotton Council，Memphis，TN.1451-1452)以及叶片的气孔导度 (Lu ZM，et al(1998).Stomatal conductance predicts yields in irrigated Pima cotton and bread wheat grown at high temperatures.J Exp Bot 49，453-460)和细胞膜热稳定 性(Rahman H，et al(2004).Heat tolerance of upland cotton during the fruiting stage evaluated using cellular membrane thermostability.Field Crops Res 85，149-158)作为 棉花耐高温特性的筛选指标。这些筛选方法要么依赖于高温逆境条件，要么通过 测定生理指标进行间接的选择。然而，在实际的育种工作中，田间自然的高温胁 迫常常难以预期发生，在人工温室中的选育结果往往与实际不符，而且还增加了 育种成本；通过测定气孔导度和细胞膜热稳定性进行的间接筛选与棉花产量关系 不密切，这些耐热生理指标表现高的，产量性状不一定表现好，而这些生理指标 在棉花的不同生育时期和不同的部位有变化，育种者不好掌握，还需要特定的测 定仪器。也有研究者提出以室内离体花粉的萌发率和生长长度的不同来区分耐高 温和敏感型棉花(Kakani VG，et al.(2005).Differences in in vitro pollen germination and pollen tube growth of cotton cultivars in response to high temperature.Ann Bot 96， 59-67)，这种筛选方法虽然不需要温室设施条件，但离体花粉在培养基上的萌发 率和生长状况不能直接反映田间棉花花粉的授粉受精和结铃性状，因而在实际的 应用中仅有离体花粉培养实验是远远不够的，另外该方法需要比较复杂的数据处 理过程，在应用中一般的操作者难以掌握。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的选育耐高温杂交棉花品种的方法，培育出结铃 性强、高产和适应性强的耐高温棉花杂交种，解决我国长江流域杂交棉花种植区 域在7月至8月份期间经常出现高温逆境而导致蕾铃脱落，并严重影响皮棉产量和 品质的问题，以增强品种的适应性，并稳定棉花产量。
本发明提供的技术方案是：一种耐高温棉花杂交种的选育方法，步骤如下：
1)选择亲本，并在田间栽培，进行杂交，获得棉花杂交种F1；
2)按随机区组试验设计种植所述棉花杂交种F1，在田问调查单株结铃数和成 铃率；
3)室内离体花粉培养测定所述棉花杂交种F1的花粉萌发率和花粉管生长长度；
4)采用主成分分析方法进行筛选，根据第2)步和第3)步获得的结果进行主 成分分析，然后以主成分分析后的第一和第二主分量数值即PC1和PC2对所测定的 棉花杂交种F1进行筛选，
其中，PC1和PC2均为正值，所测定的杂交种为耐高温品种，
PC1和PC2均为负值，所测定的杂交种为高温敏感型品种，
PC1为正值而PC2为负值，所测定的杂交种为中等耐高温品种，
PC1为负值而PC2为正值，所测定的杂交种为中等敏感型品种。
上述的选育方法，其中所述第1)步选择的亲本是苏棉12号、中棉12号、苏棉 16号和J011分别与新优棉68和K-79杂交。当然，在应用该发明的方法时，亲本可 以选自任何具有高产、优质和抗病虫等性状的亲本材料。
所述的选育方法，其中所述第2)步调查单株结铃数和成铃率分别于盛花期和 结铃期(长江流域棉区的时间为7月下旬和8月下旬)调查两次，分别获得盛花期 和结铃期平均单株结铃数和成铃率，用于第4)步的主成分分析方法的筛选。
所述的选育方法，其中所述第3)步的室内离体花粉培养在20℃～40℃范围多 个温度条件下测定，获得不同温度培育条件下的平均花粉萌发率和平均花粉管长 度，并以其中最高花粉萌发率和最长花粉管生长长度用于第4)步主成分分析。
所述的选育方法，其中所述的不同温度条件分别是20℃、25℃、28℃、30℃、 35℃和40℃。
所述的选育方法，其中第4)步所述的主成分分析的具体方法是(参见唐启义， 冯明光著《实用统计分析及其DPS数据处理系统》，科学出版社，2002年5月，第 19章多因素分析)：首先组成观测样本矩阵X为：
X = x 11 x 12 · · · x 1 p x 21 x 22 · · · x 2 p · · · · · · · · · · · · x n 1 x n 2 · · · x np ]]>
其中n为样本数即配制的棉花杂交种F1的数目，p为变量数即盛花期单株平均结铃 数和成铃率、结铃期单株平均结铃数和成铃率、最高花粉萌发率和最长花粉管生 长长度共6个变量；然后将观测样本矩阵中的原始数据进行标准化处理，即对样本 集中元素xik作
x ik = x ik - x ‾ k S k ]]>(i＝1，2，…，n；k＝1，2，…，p) 变换后获得标准化矩阵V，其中 x ‾ k = 1 n Σ i = 1 n x ik , ]]> S k 2 = 1 n - 1 Σ i = 1 n ( x ik - x ‾ k ) 2 , ]]>并计算矩阵V的相 关系数矩阵(协方差矩阵)R：
R = r 11 r 12 · · · r 1 p r 21 r 22 · · · r 2 p · · · · · · · · · · · · r p 1 r p 2 · · · r pp ; ]]>
最后计算特征值和特征向量，通过雅可比(Jacobi)方法求解特征方程|λI-R| ＝0(I为单位阵)，得出p个非负的特征值λi(i＝1，2，…，p)，按其大小排列， 即λ1≥λ2≥……≥λi≥λp，特征值是各主成份的方差，特征向量矩阵U可以通过 方程|R-λI|U＝0求得；若令F＝UTV(UT为U的转置矩阵)，就可以得到各 个样本的主成分分析因子得分系数矩阵F，矩阵中fik(i＝1，2，…，n；k＝1，2，…，p) 即为第i个样本的第k主分量数值。上述主成分分析过程可以借助于SPSS、SAS 和DPS等软件系统实现。
所述的选育方法，其中第3)步所述的室内离体花粉培养测定过程是：按照 100ml培养基中含有2g琼脂，30g蔗糖，5.3mg KNO3，51.7mg MnSO4，10.3mg H3BO3和10.3mg MgSO4·7H2O的配方，将配好的培养基煮沸后倒入直径为6cm的培养皿 中，每个培养皿10ml；在棉花初花到盛花时期，于早晨7:00～8:00分别摘取所述田 间种植的各个杂交种F1刚开放的新鲜花朵，带回室内等花药开裂后用手轻弹花药， 使花粉均匀落在培养基的表面，每个培养皿500～800粒花粉；盖上培养皿盖，并 留缝隙以保证培养皿内相对湿度约50％左右，将培养皿分别放置在温度为20℃、25 ℃、28℃、30℃、35℃和40℃的生长培养箱中黑暗条件下培养，每个温度处理中 各杂交种重复3次；培养24h后，计数花粉的萌发率，测定花粉管的生长长度；以 花粉管长度超过花粉粒直径作为花粉粒萌发的标准；计算每个视野中的萌发率， 每个培养皿观察10个视野，并统计平均萌发率；每个培养皿随机测定20个萌发的 花粉管长度，计算平均花粉管长度。
本发明提供的耐高温棉花杂交种的选育方法具有如下优点和积极效果：
1)直接从杂交组合中进行筛选，增加了棉花亲本配组的自由度。棉花的耐高 温特性是一个比较复杂的综合性状，其遗传机制尚不清楚。在棉花杂种优势利用 中，可以广泛配组，选择任何具有高产、优质和抗病虫等优良性状的亲本材料自 由地配制杂交组合，在田间品系比较试验的同时采用该发明的技术方案就可以对 所配制的杂交种进行耐高温特性的测试，确定所配制的杂交组合对高温逆境的耐 性程度，筛选出既耐高温，又具有高产、优质或抗病虫等性状的适应性强的棉花 杂交品种，从而减少因高温逆境导致的减产，保证了育种家选育的杂交品种在省 级或国家级区域试验以及生产应用中的稳产性，增强育种的选择效果。
2)将室内离体花粉培养和田问棉花结铃性状相结合，既能反映温度对花粉萌 发和花粉管生长(花粉育性)的影响，又能了解棉株的结铃性状，从而将耐高温 特性与产量性状很好的结合起来。该筛选方法筛选出的耐高温品种在自然高温和 人工高温逆境下的花粉育性正常，几乎没有空瘪花粉粒，结铃性强，而高温敏感 型品种则空瘪花粉粒的比率在30％以上，蕾铃脱离严重，因而筛选结果与实际表 现相符，筛选方法准确性高。
3)不需要温室设施提供高温逆境，整个操作方法简单，一般的育种者容易掌 握，实用性强；一般只需要一次筛选，可以不经过多年多点试验，从而缩短了选 育时间，并节约了成本。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明，但并不是对本发明的限制， 仅仅作示例说明。
2004年以常规棉品种苏棉12号、中棉12号、苏棉16号和J011(湘杂棉2号自交 后代系谱法选育的品系)为母本分别与转Bt基因抗虫棉花品系新优棉68(常规抗 虫棉鲁棉研22号自交后代中的优质选系)和K-79(以常规转Bt基因抗虫棉GK-12 进行连续多代的系统选择而获得的结铃性强、抗虫性好的高产品系)配制了8个杂 交组合(名称见表1)。2005年将8个杂交种F1按随机区组设计进行田问试验，小区 面积为10m2，每个组合重复3～5次(在本实施例中重复3次)，种植密度为每亩1500 株，田问管理按照当地的抗虫杂交棉花品种的栽培管理方式进行。每个小区随机 选10株棉株，在7月25日盛花期间和8月25日结铃期间分两次调查各小区的单株结 铃数和成铃率，得到小区的平均单株结铃数和成铃率后，通过简单的方差分析获 得每个棉花杂交种F1的平均单株结铃数和成铃率(表1)。
在2005年7月1日到5日的早晨7:00～8:00分别摘取田间种植的各个杂交种刚开 放的新鲜花朵，并带回室内稍稍风干。然后，按照100ml培养基中含有2g琼脂，30g 蔗糖，5.3mg KNO3，51.7mg MnSO4，10.3mg H3BO3和10.3mg MgSO4·7H2O的配 方，将配好的培养基煮沸后倒入直径为6cm的培养皿中，每个培养皿约10ml，每天 做一个温度处理，共配制24个含有培养基的培养皿(若有足够恒温培养箱的条件， 可以每天做2～5个温度处理)。等培养基完全冷却凝固后，用手轻弹花药，使花 粉均匀落在培养基的表面，每个培养皿约500～800粒花粉(1～2朵花)。盖上培养 皿盖，并留缝隙以保证培养皿内相对湿度在50％左右，将培养皿分别放置在温度为 20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃的生长培养箱中黑暗条件下培养，每个温 度处理中各杂交种重复3次。在培养的第二天上午10:00左右开始用光学显微镜计 数花粉的萌发率，测微尺测定花粉管的生长长度。计算每个视野中的萌发率，每 个培养皿观察10个视野，并统计平均萌发率。每个培养皿随机测定20个萌发的花 粉管长度，计算平均花粉管长度，各个杂交种花粉粒最高的萌发率和花粉管生长 长度结果见表1。
表1不同棉花杂交组合的单株结铃数、成铃率、最高花粉萌发率和最长花粉管生长长度
父、母本杂交组合 (母本×父本) 棉花杂交 种名称 7月25日 8月25日 最高花 粉萌发 率 最长花粉 管生长长 度 结铃数 成铃率 (％) 结铃 数 成铃率 (％) 苏棉12号×新优棉68 JL01 10.6 71.8 31.2 65.1 41.7 488 中棉12号×新优棉68 JL02 11 55.5 25 53.9 48.9 518 苏棉16号×新优棉68 JL03 9 63.2 27.2 51.4 39.6 508 J011×新优棉68 JL04 10 62.3 30 66.8 43 615 苏棉12号×K-79 JL05 9.8 61.5 24.7 53.7 46.5 539 中棉12号×K-79 JL06 14 81.9 34.5 75.6 58.5 660 苏棉16号×K-79 JL07 12 67.5 28.6 62.3 45.2 576 J011×K-79 JL08 11.4 64.5 29.5 60.4 35.6 545
对表1中8个杂交种的单株结铃数和成铃率、最高花粉萌发率和最长花粉管生 长长度共6个变量进行主成分分析。将表1中的观测数据组成8×6的样本矩阵，通 过标准化变换后，并计算出该标准化矩阵的相关系数矩阵(见表2)，然后计算出 相关系数矩阵的特征值、特征向量以及各个样本的主成分分析因子得分系数矩阵 (分别列于表3、4和5)。
表2相关系数矩阵
X(1) X(2) X(3) X(4) X(5) X(6) X(1) 1.00000 0.70788 0.65730 0.74398 0.66010 0.65724 X(2) 0.70788 1.00000 0.89235 0.82192 0.48174 0.52629 X(3) 0.65730 0.89235 1.00000 0.92843 0.30438 0.59135 X(4) 0.74398 0.82192 0.92843 1.00000 0.48857 0.75018 X(5) 0.66010 0.48174 0.30438 0.48857 1.00000 0.61009 X(6) 0.65724 0.52629 0.59135 0.75018 0.61009 1.00000
注：X(1)、X(2)、X(3)、X(4)、X(5)和X(6)分别为7月25日的单株平均结铃数和成铃率、8月25日 的单株平均结铃数和成铃率、最高花粉萌发率以及最长花粉管生长长度。
表3相关系数矩阵的特征值及主成分贡献率
主成分 特征值 百分率％ PC1 4.31166 71.9 PC2 0.88222 14.7 PC3 0.43086 7.1 PC4 0.24539 4.1 PC5 0.10618 1.8 PC6 0.02369 0.4
表4相关系统矩阵的特征向量表
PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 X(1) 0.41912 0.20090 0.28515 -0.83650 0.04618 0.02809 X(2) 0.42574 -0.29896 0.42208 0.30712 0.59191 -0.32640 X(3) 0.42461 -0.48030 -0.02671 0.10347 -0.17477 0.73964 X(4) 0.45473 -0.21361 -0.21087 0.05153 -0.62084 -0.56128 X(5) 0.32329 0.71336 0.32878 0.43794 -0.23922 0.17172 X(6) 0.38922 0.29167 -0.76633 0.02799 0.41749 0.03301
表5各个棉花杂交组合的主成分分析因子得分系数矩阵表
棉花杂交 种名称 PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 JL01 0.13934 -1.48656 0.92489 0.31124 -0.41838 -0.10423 JL02 -1.63669 1.47662 0.38766 -0.37466 -0.46646 0.14894 JL03 -2.15650 -0.47105 0.14728 0.51967 0.42845 0.23812 JL04 0.33401 -0.21882 -1.49901 0.39068 -0.33279 -0.00456 JL05 -1.66435 0.96929 0.08019 0.40273 0.25705 -0.24687 JL06 4.87009 0.54950 0.27148 0.17725 0.14719 0.09772 JL07 0.57606 0.23118 -0.00878 -0.49950 0.21076 -0.16678 JL08 -0.46196 -1.05015 -0.30372 -0.92740 0.17417 0.03766
注：表3、4和5中的PC1、PC2、PC3、PC4、PC5和PC6分别表示第一、二、三、四、五和六主分量。
表6主成分分析后不同棉花杂交组合的第一和第二主分量值以及对高温的耐性
棉花杂交种名称 PC1 PC2 类型 JL01 0.13934 -1.48656 中等耐高温型 JL02 -1.63669 1.47662 中等敏感型 JL03 -2.15650 -0.47105 敏感型 JL04 0.33401 -0.21882 中等耐高温型 JL05 -1.66435 0.96929 中等敏感型 JL06 4.87009 0.54950 耐高温型 JL07 0.57606 0.23118 耐高温型 JL08 -0.46196 -1.05015 敏感型
表5中列出了各个杂交组合的第一到第六主分量的数值，根据PC1和PC2的正负 值，可以从8个棉花杂交组合中判断出杂交组合“JL06”和“JL07”属于耐高温型 的棉花(见表6)。其中“JL06”不但耐高温特性强，而且还表现出较强的杂种优 势，具有以下主要特点：
1)高温逆境时段花粉育性正常，蕾铃脱落少，结铃性强。2005年在长江流域 棉区于7～8月期间出现了多次连续多天最高气温超过35℃的高温天气，此时正值 棉花进入盛花期和结铃期，许多棉花品种出现花药空瘪和花粉量减少的现象，蕾 铃脱落非常严重。高温时段，采用显微镜对自交授粉后的柱头上的花粉粒进行连 续的观察表明，试验中的杂交组合“JL06”的花柱上空瘪和形状不规则的花粉粒 数量很少，而其它组合特别是敏感型的杂交种中有30％以上的空瘪和形状不规则 的花粉粒；田间结铃性状调查结果显示，“JL06”在高温时段的成铃率仍然在70 ％以上，单株结铃数也是最高的，而敏感型杂交组合由于高温导致花粉育性不正 常使得授粉受精受到影响，从而蕾铃脱落严重，单株结铃数减少。
2)适应性强，产量高。“JL06”参加2006年湖南省棉花杂交种的区试，在湖 南常德、华容、安乡和长沙地区均表现出很好的结铃性，单株平均结铃数为46.9 个，平均籽棉产量为346kg/亩，比对照现有推广杂交棉品种“湘杂棉8号”增产4.5％。 另外，在湖北、江西和安徽等省进行的多点多地区示范试验结果也表明，该杂交 品种的结铃性好，在棉株上的分布均匀，单株结铃数都超过45个，大面积示范产 量均在300kg/亩左右，可见产量高而且稳定，表现出适应性强的特点。
3)综合性状优良。“JL06”综合了双亲“J011”和“K-79”的优点，生长优 势强，株型好，生长稳健，铃大(单铃籽棉重6.5g)，纤维品质优良，对棉铃虫 具有很好的抗性，具有较强的杂种优势。