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1、(10)授权公告号 CN 102988356 B (45)授权公告日 2014.08.27 CN 102988356 B (21)申请号 201310005484.4 (22)申请日 2013.01.08 A61K 31/403(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 1/00(2006.01) A61P 15/00(2006.01) A61P 11/00(2006.01) C07D 209/88(2006.01) C07D 209/94(2006.01) (73)专利权人 中国科学院昆明植物研究所 地址 650201 云南省昆明市蓝黑路 132 号 (72)发明人。
2、 谭宁华 宋卫武 曾广智 彭文文 (74)专利代理机构 昆明协立知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 53108 代理人 马晓青 CN 1332157 A,2002.01.23, EP 0246534 A2,1987.11.25, CN 102249976 A,2011.11.23, Manerat W 等 .Antitumoral alkaloids from Clausena lansium . Heterocycles .2010, Manerat W 等 .Antitumoral alkaloids from Clausena lansium . Heterocycles .2010。
3、, De-Yang Shen等. Bioactive constituents of Clausena lansium and a method for discrimination of aldose enantiomers . Phytochemistry .2012, De-Yang Shen等. Bioactive constituents of Clausena lansium and a method for discrimination of aldose enantiomers . Phytochemistry .2012, (54) 发明名称 以黄皮属植物中的咔唑生物碱为抗肿。
4、瘤活性 成分的药物组合物及其制备方法与应用 (57) 摘要 以咔唑生物碱 clausine D（1） 、 6-methoxyheptaphylline（2） 、 mafaicheenamine C（3） 或 claulansine G（4） 为活性成分的药物 组合物。 它们的制备方法， 它们在制备肿瘤细胞生 长抑制剂中的应用， 以及在制备抗肿瘤药物中的 应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 耿立冬 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 (10)授权公告号 CN 1029。
5、88356 B CN 102988356 B 1/1 页 2 1. 制 备 如 下 结 构 式 所 示 的 黄 皮 属 植 物 中 的 咔 唑 生 物 碱 clausine D(1)、 6-methoxyheptaphylline(2)、 mafaicheenamine C(3)、 claulansine G(4) 的方法， 取黄皮的根茎， 经干燥、 粉碎后， 用甲醇回流提取 3 次， 时间为每次 4 小时， 提取液经减 压浓缩得甲醇浸膏 ； 将甲醇浸膏加水混悬后， 依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取， 等体积 各萃取三次， 回收溶剂得到乙酸乙酯部分、 正丁醇部分和水部分 ； 将乙酸乙酯部分经硅胶。
6、 柱层析， 用 100:0,95:5,90:10 的氯仿 / 甲醇梯度洗脱， 薄层层析， 结合 TLC 检测方法， 根据 咔唑生物碱极性的不同合并为七个组分 Fr.1-Fr.7 ； 以下的每一步骤都须结合 TLC 检测方 法来进行分离纯化， Fr.2 用 60 目的聚酰胺拌样， 以甲醇和水做流动相经中压 MCI 柱层析 10-100梯度洗脱除去色素， 然后硅胶柱层析， 用9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯 度洗脱分离得到四个亚组分 Fr.2-1-Fr.2-4 ； Fr.2-2 再经硅胶柱层析以 9:1-7:3 石油醚 / 乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱分离得到四个亚组分 Fr.2-2-1-Fr。
7、.2-2-4 ； Fr.2-2-1 经两次硅 胶柱层析， 以9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱除去一部分杂质， 得到的样品浓 缩后再经 Waters OBD 制备柱 60乙腈 / 水等度洗脱纯化， 纯化出来的样品浓缩后再以丙 酮为溶剂重结晶得到化合物 6-methoxyheptaphylline(2) ； Fr.6 经硅胶柱层析， 以 9:1-7:3 石油醚 / 丙酮为洗脱剂梯度洗脱初步除去色素， 然后再经中压 MCI 柱层析， 以 10 -60甲 醇 / 水为流动相梯度洗脱进一步除去色素， 然后再用中压 RP-18 柱层析， 以 5 -70甲醇 / 水为流动相梯度洗脱得到四个亚组。
8、分 Fr.6-1-Fr.6-4 ； Fr.6-1 经硅胶柱层析， 以 20:1 氯 仿 / 丙酮为洗脱剂等度洗脱进一步分离得到三个亚组分 Fr.6-1-1-Fr.6-1-3 ； Fr.6-1-1 经 Sephadex LH-20 层析， 1:1 的氯仿 / 甲醇为洗脱剂等度洗脱得到的样品浓缩后再经硅胶柱 层析， 以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物claulansine G(4) ； Fr.6-1-2 经硅胶柱层析， 以 20:1 氯仿 / 乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱分离得到含有生物碱的样品， 再 经 Waters OBD 制备柱， 以 48的乙腈 / 含 0.6的三氟乙酸的水为洗。
9、脱剂等度洗脱得到化 合物 mafaicheenamine C(3) ； Fr.6-3 经硅胶柱层析， 以 9:1 石油醚 / 丙酮为洗脱剂等度洗 脱得到含有生物碱的样品， 该样品以丙酮为溶剂重结晶得到化合物 clausine D(1)。 权 利 要 求 书 CN 102988356 B 2 1/9 页 3 以黄皮属植物中的咔唑生物碱为抗肿瘤活性成分的药物组 合物及其制备方法与应用 技术领域 ： 0001 本发明属于药物技术领域， 具体地， 涉及以黄皮属植物中咔唑生物碱为活性成分 的药物组合物， 其制备方法， 其作为肿瘤细胞生长抑制剂， 其在制备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术 ： 0002 当今。
10、世界， 肿瘤严重威胁着人类的健康和生命， 其死亡率仅次于心血管疾病而位 居第二， 成为当今人类医学界一大难题。据世界卫生组织最近发表的报告， 在 28 个工业化 国家内， 男性癌症死亡率上升 55%， 女性上升 40%， 其中胃癌居首位， 其他依次为食道癌、 肝 癌、 子宫颈癌和肠癌等。 随着分子肿瘤学的发展， 人们发现细胞内促增殖系统成分的过度表 达与抑增殖系统成分的缺失均可引起细胞增殖失控而导致癌变。 随着生命科学研究的飞速 进展， 恶性肿瘤细胞内的信号转导、 细胞周期的调控、 细胞凋亡的诱导、 血管生成以及细胞 与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。 0003 目前抗肿瘤药物。
11、的来源主要包括植物、 动物、 微生物、 矿物和海洋生物的代谢产物 及其人工合成和人工修饰等产物。 根据其作用机理的不同， 抗肿瘤药物又可分为以下几类 ： （1） 细胞毒类抗肿瘤药 ；（2） 以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 ；（3） 肿瘤新生血 管生成抑制药物 ；（4） 肿瘤细胞诱导分化剂 ；（5） 细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂等。植 物来源的天然产物在当今抗肿瘤药物市场上扮演了重要角色， 由于植物来源抗肿瘤药物的 作用机制独特、 抗癌疗效显著， 如今在临床上已经逐步占据了主导地位， 达到 40% 的市场份 额， 但其资源来源和成本问题仍然困扰着这些药物的广泛推广和使用， 如临床使用的植物。
12、 来源的生物碱类型的抗肿瘤药物紫杉醇 （paclitaxel） 、 喜树碱 （camptothecin） 和长春碱 （vinblastine） 等均面临这些问题。 0004 目前已经报道的应用于抗肿瘤药物研究的天然产物包括多种结构类型， 除上述 提到的具有代表性的生物碱类化合物外， 还有萜类、 木脂素类和黄酮类等， 但是尚未见到 已经上市的咔唑生物碱类抗肿瘤药。咔唑类生物碱及其衍生物是一类重要的含氮芳杂环 化合物， 分子内含有较大的共轭体系和强的分子内电子转移， 这种特殊的刚性稠环结构 使咔唑生物碱类化合物表现出许多独特的生物活性， 例如 ： 细胞毒、 抗微生物、 抗氧化、 抗 结核、 抗艾滋。
13、、 乙酰胆碱酯酶抑制、 拓扑异构酶抑制等。目前已有一些合成出来的咔唑生 物碱类药物进入临床试验， 例如 ： Cephalon 公司的抗肿瘤新药 CEP-9722 已经进入临床二 期， 该药是一个合成的咔唑生物碱， 以多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 -1 和多聚腺苷二磷酸 核糖聚合酶 -2 为靶标， 该药经临床观察无明显的毒副作用 ； Cephalon 公司的另一个咔唑 类的抗肿瘤新药 CEP-11981 进入临床一期， 该药以 Tek 酪氨酸激酶受体和血管内皮生长 因子受体作为靶标。另外还有一些合成的咔唑生物碱类化合物体内外都表现出了良好的 研发前景， 例如中国医学科学院的 Hu LX 合成的咔唑生。
14、物碱类化合物 9-ethyl-N-(3,4,5- trimethoxyphenyl)-carbazole-3-sulfonamide 体外对肿瘤细胞株 MCF-7 的细胞毒活性 IC50达到 89nM， 而体内试验给药 100mg/kg， 肿瘤抑制率达到 75%， 而 LD50为 500mg/kg。参 说 明 书 CN 102988356 B 3 2/9 页 4 见 ： Hu LX, et al, Synthesis and structure-activity relationships of carbazole sulfonamides as a novel class of antimi。
15、totic agents against solid tumors, J. Med. Chem., 2006, 49, 6273-6282。Cephalon 公司的另一个咔唑生物碱类化合物 CEP-5214 对肿瘤细胞株 VEGF-R2 的体外 IC50达到 4nM， 体内给药 23.8mg/kg， 肿瘤抑制率 达到 70%， 没有观察到明显的毒副作用。参见 ： Gingrich DE, et al, A new class of potent vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors: Str。
16、ucture-activity relationships for a series of 9-alkoxymethyl-12-(3-hydroxy propyl)indeno2,1-apyrrolo3,4-ccarbazole-5-ones and the identification of CEP-5214 and its dimethylglycine ester prodrug clinical candidate CEP-7055, J. Med. Chem., 2003, 46, 5375-5388。另外也有一些来自天然的咔唑生物碱类化合物具有 良好的抗肿瘤活性， 可以作为抗肿瘤药。
17、物的先导物， 但截至目前仅限于文献报道或专利申 请， 尚未进入临床试验阶段， 例如 ： YH Taufiq-Yap 等从小叶臭黄皮中得到的咔唑生物碱类 化合物clausine-TY对肿瘤细胞株CEM-SS的IC50为8.2 g/mL。 参见 ： Taufiq-Yap YH, et al, A new cytotoxic carbazole alkaloid from Clausena excavate, Nat. Prod. Res., 2007, 21, 810-813。W Maneerat 等人从黄皮根部分离得到咔唑生物碱 mafaicheenamine E 对肿瘤细胞株 MCF-7 的 。
18、IC50达到 3.1 g/mL。参见 ： Maneerat W, et al. Carbazole alkaloids and coumarins from Clausena lansium roots, Phytochem. Lett., 2012, 5, 26-28。 T Thongthoom 等从Clausena harmandiana 根部分离得到的咔唑生物碱类化合 物 7-methoxymukonal 对肿瘤细胞株 MCF-7 和 KB 的 IC50分别达到 2.21g/mL 和 1.74g/ mL。 参见 ： Thongthoom T, et al. Biological acti。
19、vity of chemical constituents from Clausena harmandiana, Arch. Pharmacal Res., 2010, 33, 675-680。咔唑生物碱类化 合物在植物界分布广泛， 尤其以芸香科黄皮属植物中最为丰富。黄皮属植物在我国南方分 布广， 容易生长栽培， 资源丰富， 从黄皮属植物中分离到的咔唑生物碱类化合物含量大、 种 类多、 分离提取容易、 抗肿瘤活性强， 对咔唑生物碱进行抗肿瘤药物方面的研究有利于黄皮 属植物资源的综合开发利用。 0005 本专利中申请保护的四个咔唑生物碱类化合物具有较强的细胞毒活性， 目前尚未 发现有文献报道。 。
20、0006 黄皮属植物中的咔唑生物碱类化合物的提取分离有一定的特点， 该类天然产物主 要分布于植物的根和茎， 含色素， 化合物极性大多数中等偏小， 含量不同， 另外由于该类化 合物结构中含有较大的共轭体系， 因此紫外吸收比较强， 在分离纯化时可充分利用该特点。 现有技术中， 从黄皮属植物中分离咔唑生物碱类化合物已公开发表如下方法 ：（1） 20 世纪 80年代， 黄皮属植物Clausena harmandiana的根茎经正己烷回流提取， 用TLC检测， 经反复 硅胶柱层析分离得到咔唑生物碱 heptaphylline。参见 ： Wangboonskul JD, et al, Five Couma。
21、rins and a carbazole alkaloid from the root bark of Clausena harmandiana, J. Nat. Prod., 1984, 47, 1058-1059。其缺点是用正己烷提取样品不充分， 只利用 TLC 检测和硅胶柱层析进行分离得不到微量成分。 （2） 20 世纪 90 年代， 黄皮属植物 Clausena anisata 的茎由石油醚和乙醇分别提取， 然后用氯仿和乙酸乙酯分别萃取， 再经硅胶柱层 析， 分别以石油醚， 石油醚 / 二氯甲烷 1:1， 氯仿， 氯仿 / 甲醇 1:50 为洗脱剂反复硅胶柱层 析得到咔唑生物碱 cla。
22、usenol 和 clausenine。参见 ： Chakraborty A, et al, Clausenol 说 明 书 CN 102988356 B 4 3/9 页 5 and clausenine-Two carbazole alkaloids from Clausena anisata, Phytochemistry, 1995, 40, 295-298。其缺点是只用正相硅胶， 没有应用反相硅胶， 容易吸附微量样品。 （3）近年来， 黄皮属植物 Clausena anisata 的茎经干燥粉碎后分别由丙酮和甲醇进行 回流提取， 得到的浸膏经反复硅胶柱层析及 TLC 制备薄层板进行分离。
23、纯化得到咔唑生物 碱 furanoclausamine A 和 furanoclausamine B。参见 ： Ito C, et al. gamma-Lactone carbazoles from Clausena anisata, J. Nat. Prod., 2009, 72, 1202-1204。 该方法的 缺点是薄层制备板只适用于微量成分， 且容易吸附样品。 0007 以上几种方法侧重于使用正相硅胶， 反相硅胶几乎没有使用， 容易损失样品 ； 单一 的 TLC 检测方法灵敏度不够， 微量成分不容易检测， 没有充分利用咔唑生物碱紫外吸收强 的特点。 发明内容 ： 0008 针对现有技术。
24、存在的上述不足之处， 本发明的目的在于提供一类咔唑生物碱 ； 提 供制备该类化合物的方法， 该提取分离方法可控性和重现性好， 样品损失少， 成本较低， 操 作方便， 溶剂可以反复回收利用， 也适用于工业生产 ； 本发明的目的还在于提供以咔唑生物 碱类化合物为有效成分的药物组合物 ； 该类化合物作为肿瘤细胞生长抑制剂， 以及在制备 抗肿瘤药物中的应用。 0009 为了实现本发明的上述目的， 本发明提供了如下技术方案 ： 0010 药物组合物， 其中含有治疗有效量的如下结构式所示的黄皮属植物中的咔唑生物 碱 clausine D （1） 、 6-methoxyheptaphylline （2） 、。
25、 mafaicheenamine C （3） 和 claulansine G（4） 或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。 0011 0012 制备所述咔唑生物碱的方法， 取黄皮属植物的根茎， 经干燥、 粉碎后， 用甲醇回流 充分提取 ； 将甲醇浸膏加水混悬后， 依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取 ； 乙酸乙酯部分反 复用硅胶、 Sephadex LH-20、 MCI、 RP-18 和 HPLC 等各种层析柱分离纯化， 再结合 TLC 检测方 法即得到咔唑生物碱类化合物。 说 明 书 CN 102988356 B 5 4/9 页 6 0013 制 备 所 述 咔 唑 生 物 碱 clausin。
26、e D（1） 、 6-methoxyheptaphylline（2） 、 mafaicheenamine C（3） 和 claulansine G（4） 的方法， 取黄皮的根茎， 经干燥、 粉碎后， 用甲醇回流提取 3 次， 时间为每次 4 小时， 提取液经减压浓缩得甲醇浸膏 ； 将甲醇浸膏加水 混悬后， 依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取， 等体积各萃取三次， 回收溶剂得到乙酸乙酯部 分、 正丁醇部分和水部分 ； 将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析， 用 100:0, 95:5, 90:10 的氯仿 / 甲醇梯度洗脱， 薄层层析， 结合 TLC 检测方法， 根据咔唑生物碱极性的不同合并为七个组 分 Fr。
27、.1 - Fr.7 ； 以下的每一步骤都须结合 TLC 检测方法来进行分离纯化 ； Fr.2 用 60 目的 聚酰胺拌样， 以甲醇和水做流动相经中压 MCI 柱层析 10%-100% 梯度洗脱除去色素， 然后硅 胶柱层析， 用 9:1-7:3 石油醚 / 乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱分离得到四个亚组分 Fr.2-1 - Fr.2-4 ； Fr.2-2 再经硅胶柱层析以 9:1-7:3 石油醚 / 乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱分离 得到四个亚组分 Fr.2-2-1 - Fr.2-2-4。Fr.2-2-1 经两次硅胶柱层析， 以 9:1-7:3 石油醚 / 乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱除去一部分杂质， 得到的。
28、样品浓缩后再经 Waters OBD 制备 柱 60% 乙腈 / 水等度洗脱纯化， 纯化出来的样品浓缩后再以丙酮为溶剂重结晶得到化合物 6-methoxyheptaphylline（2） 。 Fr.6 经硅胶柱层析， 以 9:1-7:3 石油醚 / 丙酮为洗脱剂 梯度洗脱初步除去色素， 然后再经中压 MCI 柱层析， 以 10%-60% 甲醇 / 水为流动相梯度洗脱 进一步除去色素， 然后再用中压 RP-18 柱层析， 以 5%-70% 甲醇 / 水为流动相梯度洗脱得到 四个亚组分 Fr.6-1 - Fr.6-4。Fr.6-1 经硅胶柱层析， 以 20:1 氯仿 / 丙酮为洗脱剂等度洗 脱进一。
29、步分离得到三个亚组分 Fr.6-1-1 - Fr.6-1-3。Fr.6-1-1 经 Sephadex LH-20 层析， 1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂等度洗脱得到的样品浓缩后再经硅胶柱层析， 以9:1石油醚/丙 酮为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物 claulansine G （4） ； Fr.6-1-2 经硅胶柱层析， 以 20:1 氯仿 / 乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱分离得到含有生物碱的样品， 再经 Waters OBD 制备柱， 以 48% 的乙腈 / 水 （含 0.6% 的三氟乙酸） 为洗脱剂等度洗脱得到化合物 mafaicheenamine C（3） ； Fr.6-3 经硅胶柱层析， 以 9。
30、:1 石油醚 / 丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样 品， 该样品以丙酮为溶剂重结晶得到化合物 clausine D（1） 。 0014 0015 以所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐为有效成分的肿瘤细胞生长抑制剂。 说 明 书 CN 102988356 B 6 5/9 页 7 0016 抗肿瘤药物组合物， 其中含有治疗有效量所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的 盐和药学上可接受的载体。 0017 所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备肿瘤细胞生长抑制剂中的应用。 0018 所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗抗肿瘤相关疾病的药物中 的应用。 0019 所述的咔唑生物碱或其药。
31、理学上容许的盐在制备胃癌、 宫颈癌、 肺癌细胞生长抑 制剂中的应用。 0020 所述的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐在制备治疗胃癌、 宫颈癌、 肺癌的药物 中的应用。 0021 本发明对云南产的芸香科黄皮属植物黄皮进行系统的咔唑生物碱成分研究， 利用 多种分离纯化手段， 包括正反相硅胶柱层析、 Sephadex LH-20 凝胶层析、 HPLC 半制备等， 从 中获得了一系列咔唑生物碱。之后， 对所有咔唑生物碱类成分在三种肿瘤细胞 ： 人胃癌细 胞 BGC-823、 人宫颈癌细胞 HeLa 和人非小细胞肺癌细胞 A549 模型上检测细胞生长增殖情 况。发现其中 clausine D（1） 、 。
32、6-methoxyheptaphylline（2） 、 mafaicheenamine C（3） 和 claulansine G（4） 为新的肿瘤细胞生长抑制剂， 可用于制备抗肿瘤药物。 0022 本发明的所述芸香科黄皮属植物中的咔唑生物碱或其药理学上容许的盐， 可以列 举例如与盐酸、 硝酸、 硫酸、 磷酸、 氢溴酸等无机酸， 或者马来酸、 富马酸、 酒石酸、 乳酸、 柠檬 酸、 乙酸、 甲磺酸、 对 - 苯甲磺酸、 己二酸、 棕榈酸、 单宁酸等有机酸， 锂， 钠、 钾等碱金属， 钙、 镁等碱土金属， 赖氨酸等碱性氨基酸成的盐。 0023 本发明所述的治疗抗肿瘤相关疾病的药物组合物， 由黄皮属。
33、植物中的咔唑生物碱 与药学上可接受的载体制备的药物剂型包括片剂、 胶囊、 口服液、 针剂、 注射用冻干剂或粉 针剂等。由于黄皮属植物中的咔唑生物碱可从黄皮以及同属植物中提取分离， 而片剂、 胶 囊、 口服液、 针剂、 注射用冻干剂或粉针剂等药物剂型的制备也是本领域的常规知识。因此 由黄皮属植物中的咔唑生物碱与相应载体制备的各种药物剂型也能够由本领域技术人员 实现。 0024 上文中所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体， 例如 ： 稀释剂、 赋形剂如水等， 填充剂如淀粉、 蔗糖等 ； 黏合剂如纤维素衍生物、 藻酸盐、 明胶和聚乙烯吡咯 烷酮 ； 湿润剂如甘油 ； 崩解剂如琼脂、 碳。
34、酸钙和碳酸氢钠 ； 吸收促进剂如季铵化合物 ； 表面 活性剂如十六烷醇 ； 吸附载体如高岭土和皂黏土 ； 润滑剂如滑石粉、 硬脂酸钙和硬脂酸镁、 以及聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、 甜味剂等。 0025 本发明化合物可以以组合物的形式通过口服、 鼻吸入、 直肠或肠胃外给药的方式 施用于需要这种治疗的患者。 用于口服时， 可将其制成常规的固体制剂如片剂、 粉剂、 粒剂、 胶囊等， 制成液体制剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、 酏剂等 ； 用于肠胃外给药 时， 可将其制成注射用的溶液、 水或油性悬浮剂等。 本发明药物组合物的各种剂型可以按照 药学领域的常规生产方法制备。。
35、例如使活性成分与一种或多种载体混合， 然后将其制成所 需的剂型。 0026 本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1%99.5%的活性成分， 最优选含有重 量比为 0.5% 95% 的活性成分。 0027 本发明化合物的施用量可根据用药途径、 患者的年龄、 体重、 所治疗的疾病的类型 说 明 书 CN 102988356 B 7 6/9 页 8 和严重程度等变化， 其日剂量可以是 0.01 10 mg/kg 体重， 优选 0.1 5 mg/kg 体重。可 以一次或多次施用。 0028 本发明黄皮属植物中的咔唑生物碱提取方法的优点在于， 首先提取分离思路具有 新颖性， 成功利用色谱层析技术将植物。
36、根茎中色素和黄皮属植物中的咔唑生物碱分离。概 括地说， 先利用中压 MCI 离子交换树脂除去样品中大部分色素， 使样品颜色变浅， 然后再利 用中压 RP-18 反相柱将样品根据极性不同分段， 之后再利用硅胶柱层析进一步分离纯化， 最后利用咔唑生物碱苯环共轭系统紫外吸收强的特点用 HPLC 半制备柱纯化， 也可利用部 分咔唑生物碱容易结晶的特点通过重结晶进行分离纯化。 因此该提取分离方法可控性和重 现性好， 样品损失少， 成本较低， 操作方便， 溶剂可以反复回收利用， 也适用于工业生产。 附图说明 ： 0029 图 1 为本发明的黄皮属植物中的咔唑生物碱的制备方法流程图 ； 0030 图 2 为。
37、本发明的黄皮属植物中的咔唑生物碱 clausine D（1） 肿瘤细胞毒活性实 验。 具体实施方式 ： 0031 下面结合附图， 用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以 此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。 0032 实施例 1 ： 0033 黄皮属植物中的咔唑生物碱 clausine D（1） 、 6-methoxyheptaphylline（2） 、 mafaicheenamine C（3） 和 claulansine G（4） 的制备方法及其结构鉴定 ： 0034 取黄皮的根茎27 kg， 经干燥、 粉碎后， 用甲醇回流提取3次 （1。
38、00 L 3次） ， 时间 为4 h， 提取液经减压浓缩得甲醇浸膏800 g ； 将甲醇浸膏加水混悬后， 依次用乙酸乙酯和正 丁醇充分萃取， 等体积各萃取三次 (30 L 3 次 )， 回收溶剂得到乙酸乙酯部分 406 g、 正 丁醇部分158 g和水部分236 g。 将乙酸乙酯部分经硅胶柱层析， 用100:0, 95:5, 90:10的 氯仿 / 甲醇梯度洗脱， 薄层层析， 结合 TLC 检测方法， 根据咔唑生物碱极性的不同合并为七 个组分Fr.1 - Fr.7 ； 以下的每一步骤都须结合TLC检测方法来进行分离纯化。 Fr.2 （38 g） 用 60 目的聚酰胺拌样， 以甲醇和水做流动相经。
39、中压 MCI 柱层析 10%-100% 梯度洗脱除去色 素得到含有生物碱的样品 （26 g） ， 然后硅胶柱层析， 用9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂 梯度洗脱分离得到四个亚组分Fr.2-1 - Fr.2-4。 Fr.2-2 （12 g） 再经硅胶柱层析以9:1-7:3 石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱分离得到四个亚组分Fr.2-2-1 - Fr.2-2-4。 Fr.2-2-1 （3.8 g） 经两次硅胶柱层析， 以 9:1-7:3 石油醚 / 乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱得到含有生 物碱的样品 （138 mg） ， 得到的样品浓缩后再经 Waters OBD 制备柱 60% 乙腈 / 水等。
40、度洗脱 纯化， 纯化出来的样品浓缩后再以丙酮为溶剂重结晶得到化合物 6-methoxyheptaphylline （2） （38 mg） 。Fr.6（123 g） 经硅胶柱层析， 以 9:1-7:3 石油醚 / 丙酮为洗脱剂梯度洗脱 初步除去色素合并生物碱部分得到样品 （88.5 g） ， 然后再经中压MCI柱层析， 以10%-60%甲 醇 / 水为流动相梯度洗脱进一步除去色素合并生物碱部分得到样品 （63.4 g） ， 然后再用中 压RP-18柱层析， 以5%-70%甲醇/水为流动相梯度洗脱分为四个亚组分Fr.6-1 - Fr.6-4。 Fr.6-1（18.1 g） 经硅胶柱层析， 以 20。
41、:1 氯仿 / 丙酮为洗脱剂等度洗脱进一步分离得到三 说 明 书 CN 102988356 B 8 7/9 页 9 个亚组分 Fr.6-1-1 - Fr.6-1-3。Fr.6-1-1 （332 mg） 经 Sephadex LH-20 层析， 1:1 的氯仿 / 甲醇为洗脱剂等度洗脱之后合并生物碱部分得到样品 （185 mg） ， 再经硅胶柱层析， 以 9:1 石油醚 / 丙酮为洗脱剂等度洗脱分离得到化合物 claulansine G（4） （25 mg） 。Fr.6-1-2 （584 mg） 经硅胶柱层析， 以20:1氯仿/乙酸乙酯为洗脱剂等度洗脱分离得到的含生物碱样 品 （97 mg） ，。
42、 再经 Waters OBD 制备柱， 以 48% 的乙腈 / 水 （含 0.6% 的三氟乙酸） 为洗脱剂等 度洗脱得到化合物 mafaicheenamine C（3） （11 mg） 。Fr.6-3（6.72 g） 经反复硅胶柱层 析， 以9:1石油醚/丙酮为洗脱剂等度洗脱得到含有生物碱的样品 （1.18 g） ， 该样品以丙酮 为溶剂重结晶得到化合物 clausine D（1） （432 mg） 。 0035 通过 1D-NMR、 2D-NMR 及 MS 对上述得到的化合物的结构进行解析， 并参照文献 报道的波谱数据将其结构分别鉴定为 clausine D（1） 、 6-methoxyhe。
43、ptaphylline（2） 、 mafaicheenamine C （3） 和 claulansine G （4） 。分别参见 ：（1） Wu TS, et al, Clausine-D and -F, two new 4-prenylcarbazole alkaloids from Clausena excavata, Chem. Pharm. Bull., 1992, 40, 1069-1071 ；（2） Joshi BS, et al, 6-Methoxyheptaphylline, a new carbazole alkaloid from Clausena-indica OLIV,。
44、 Indian J. Chem., 1972, 10, 1123-1124 ；（3） Maneerat W, et al, Antitumoral alkaloids from Clausena lansium, Heterocycles, 2010, 81, 1261 ；（4） Liu H, et al, Carbazole alkaloids from the stems of Clausena lansium, J. Nat. Prod., 2012, 75, 677-682。 0036 0037 0038 实施例 2 ： 0039 本发明 clausine D（1） 、 6-metho。
45、xyheptaphylline（2） 、 mafaicheenamine C（3） 和 claulansine G（4） 在肿瘤细胞 BGC-823、 HeLa 和 A549 上的细胞毒性实验结果。实验原 理、 方法和结果如下 ： 0040 实 验 原 理 ： 药 物 与 细 胞 共 培 养 后 检 测 肿 瘤 细 胞 存 活 率。 磺 酰 罗 丹 明 B （Sulforhodamine B， SRB） 是一种水溶性蛋白染料， 其分子中的磺酸基阴离子， 在弱酸性环 境下与细胞内蛋白质的碱性氨基酸结合， 用碱性溶液溶解细胞内的 SRB 并测其吸光值， 由 SRB 的含量即可得知细胞内的蛋白质含量。
46、， 并以此代表细胞存活率。 说 明 书 CN 102988356 B 9 8/9 页 10 0041 实验方法 ：（1） 接种细胞 ： 用含 10胎牛血清的培养液将以上三种肿瘤细胞配成 单个细胞悬浮液， 以每孔 5103个细胞接种到 96 孔板上。 （2） 化合物处理 ： 细胞贴壁后， 加 入待测化合物溶液， 继续培养 48 或 72 小时。 （3） 固定、 染色与测定 ： 加入预冷的三氯乙酸 溶液固定细胞， 之后用 SRB 溶液染色活细胞， 最后加入 Tris 溶液溶解 SRB， 560nm 检测吸光 值。 （4） 记录结果， 以浓度为横坐标， 细胞存活率为纵坐标绘制曲线， 应用 Reed 。
47、and Muench 法计算化合物的 IC50值。 0042 实验结果 ： 0043 表 1 咔唑生物碱 1-4 对三种肿瘤细胞生长的半数抑制浓度 0044 0045 实验结果表明， 化合物 1-4 均具有肿瘤细胞毒活性， 其中 clausine D（1） 的活性 在 BGC-823 和 HeLa 细胞上与阳性对照紫杉醇活性相当。 0046 实施例 3 ： 0047 实施例 1 所得化合物 1-4， 加入 4% 的硫酸乙醇溶液， PH = 4， 过滤， 干燥， 制成硫酸 盐化合物 1-4。 0048 实施例 4 ： 0049 实施例 1 所得化合物 1-4， 加入 4% 的盐酸溶液， PH =。
48、 4， 过滤， 干燥， 制成盐酸盐化 合物 1-4。 0050 实施例 5 ： 0051 实施例 1 所得化合物 1-4， 加入 4% 的酒石酸溶液， PH = 4， 过滤， 干燥， 制成酒石酸 盐化合物 1-4。 0052 实施例 6 ： 0053 实施例 1 所得化合物 1-4， 加入 4% 的柠檬酸溶液， PH = 4， 过滤， 干燥， 制成柠檬酸 盐化合物 1-4。 0054 实施例 7 ： 0055 片剂 ： 实施例 1 所得化合物 1-4 或实施例 3-6 所得的盐 10 mg， 乳糖 180 mg， 淀粉 55 mg， 硬脂酸镁 5 mg。 0056 制备方法 ： 将化合物或其盐。
49、、 乳糖和淀粉混和， 用水均匀湿润、 把湿润后的混合物 过筛并干燥， 再过筛， 加入硬脂酸镁， 然后将混合物压片， 每片重 250 mg， 化合物含量为 10 mg。 0057 实施例 8 ： 0058 安瓿剂 ： 实施例 1 所得化合物 1-4 或实施例 3-6 所得的盐 2 mg， 氯化钠 10 mg。 0059 制备方法 ： 将化合物或其盐和氯化钠溶解于适量的注射用水中， 过滤所得溶液， 在 说 明 书 CN 102988356 B 10 9/9 页 11 无菌条件下装入安瓿瓶中。 0060 实施例 9 ： 0061 注射用冻干剂 ： 实施例1所得化合物1-4或实施例3-6所得的盐 10 mg， 碳酸氢钠 2 mg， 甘露醇 252 mg。 0062 制备方法 ： 将碳酸氢钠、 甘露醇， 加注射用水溶解， 加活性碳吸附 30 min 除热原， 过滤除去活性碳， 在滤液中加入化合物或其盐， 超声处理使溶解， 用 1 N 盐酸调节 PH 为 5.。