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1、(10)授权公告号 CN 101444187 B (45)授权公告日 2012.01.18 CN 101444187 B *CN101444187B* (21)申请号 200810239943.4 (22)申请日 2008.12.15 A01H 4/00(2006.01) A01G 31/00(2006.01) C12N 5/04(2006.01) (73)专利权人 北京林业大学 地址 100083 北京市海淀区清华东路 35 号 (72)发明人 罗晓芳 蒋湘宁 李莹 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 艾丽皎 . 小红枫的组织培养研究 .西南师 范。
2、大学学报 ( 自然科学版 ) .2008,( 第 03 期 ), 张艳红等 . 红枫杜鹃的组培快繁与规模化生 产 .植物生理学通讯 .2008,( 第 03 期 ), 李桂琴等 . 红枫增殖生长培养基配方研 究 .生物技术通讯 .2006,( 第 02 期 ), 宗树斌等 . 美国红枫的组织培养研究 .山 东林业科技 .2006,( 第 01 期 ), (54) 发明名称 美国红枫的繁殖方法 (57) 摘要 本发明公开了一种美国红枫的繁殖方法。该 方法， 包括下述步骤 ： 1) 将美国红枫当年生的带 节茎段或茎尖接种于启动培养基上进行启动培 养， 得到生出腋芽或顶芽 ； 2) 将步骤 1) 得。
3、到的腋 芽或顶芽置于增殖培养基上进行增殖培养得到不 定芽 ； 3)将步骤2)得到的不定芽置于生根培养基 上进行生根诱导培养， 得到美国红枫幼苗。 本发明 的方法其他无性繁殖方法相比， 具有所需试验材 料较易获得、 环境条件可控误差小、 生长快、 周期 短、 另外离体组织培养还可以连续运转、 周年试验 生产等优点， 更主要的是组织培养材料来源单一， 无性系遗传特性一致， 保证了美国红枫固有的优 良特性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 岑喆鑫 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 CN 101444187 B1。
4、/1 页 2 1. 美国红枫的繁殖方法， 包括下述步骤 ： 1) 将美国红枫当年生的带节茎段或茎尖接种于启动培养基上进行启动培养， 得到腋芽 或顶芽 ； 2) 将步骤 1) 得到的腋芽或顶芽置于增殖培养基上进行增殖培养得到不定芽 ； 3) 将步骤 2) 得到的不定芽置于生根培养基上进行生根诱导培养， 得到美国红枫生根 苗 ； 所述启动培养基是在MS培养基中添加1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤， 0.1mg/L萘乙酸， 30g/L 糖， 调节PH为6.0-6.2得到的固体培养基 ； 所述增殖培养基为在MS培养基中添加0.008mg/ L 噻本隆， 30g/L 糖， 调节 PH 为 6.0-6.2 。
5、得到的固体培养基 ； 所述生根培养基为在 1/2MS 培 养基中添加 0.1mg/L 吲哚乙酸， 20g/L 糖， 调节 PH 为 6.0-6.2 得到的固体培养基。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述启动培养、 增殖培养或生根诱导培养 是在封口的培养瓶中进行 ； 所述芽诱导培养、 增殖培养或生根诱导培养的培养瓶放置于温 度为 20 25， 空气相对湿度为 60-80光照强度 2000-3000lx， 光照时间为 14-16 小时 / 天的条件下。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述启动培养的时间为 20-30 天， 所 述增殖培养的时间。
6、为 30-40 天， 所述生根诱导培养的时间为 20-30 天。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述方法中， 还包括将美国红枫幼苗进行 移栽 ； 所述移栽的方法是将生根培养得到的美国红枫幼苗经炼苗后移至珍珠岩、 蛭石和草 炭土按照体积比为 1 2 2 的比例混合得到的混合物基质上， 覆塑料棚， 使棚内温度为保 证白天温度 20-30， 夜间最低温度不低于 15， 湿度为 60-80， 日光下培养 5-7 天， 然后 在3-10天内逐步掀开塑料棚使小苗逐步适应温度15-25， 湿度50-70的条件， 再在该环 境下继续培养 30 天。 权 利 要 求 书 CN 10144。
7、4187 B1/4 页 3 美国红枫的繁殖方法 技术领域 0001 本发明涉及一种美国红枫的繁殖方法， 特别涉及一种美国红枫的组织培养快速繁 殖方法。 背景技术 0002 美国红枫， 又名北美红枫， 为其商品名， 学名红花槭， 拉丁名 Acer palmatumvar. atropurpureum(Vanh).Schwe， 槭树科槭树属， 鸡爪槭的变种， 原产于北美洲， 是一种著名的 观赏性彩叶植物。 0003 美国红枫与其它彩叶植物一样， 既可以进行有性繁殖， 也可以进行无性繁殖。 0004 美国红枫有性生殖， 即种子繁殖， 虽然方法简便易行， 繁殖系数大。但是生长周期 长， 开花结果晚， 。
8、最重要的是由于彩叶植物大多数都是来自自然界的变异， 而非正常的生理 表现， 色彩性状很难稳定的遗传下去。 美国红枫采用有性生殖进行繁育， 容易产生种质的变 异退化， 导致叶片色彩的消失。 0005 无性繁殖包括扦插繁殖、 嫁接繁殖和离体组织培养三种。对于美国红枫的扦插繁 殖来讲， 虽然可以达到产苗量大、 成苗快、 开花早的目的， 而且也能较好的保持原品种的固 有优良特性， 但是美国红枫是外来树种， 国内没有大量的成树可以提供充足的繁殖材料， 而 且美国红枫扦插不易生根， 既便生根， 扦插苗的根系也较差， 很难形成主根， 寿命较短， 抗性 较差。 0006 目前， 市场上对美国红枫的繁殖方法主要。
9、是采用嫁接繁殖， 嫁接繁殖主要以青枫 作为砧木， 但是青枫的生长速度慢， 大量繁殖美国红枫的前提就是要大量的繁殖青枫， 这样 对于大规模的生产需要就产生了一定的局限性。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种美国红枫的繁殖方法。 0008 本发明所提供的美国红枫的繁殖方法， 包括下述步骤 ： 0009 1) 将美国红枫当年生的带节茎段或茎尖接种于启动培养基上进行启动培养， 得到 生出腋芽或者顶芽 ； 0010 2) 将步骤 1) 得到的腋芽或顶芽置于增殖培养基上进行增殖培养得到不定芽 ； 0011 3) 将步骤 2) 得到的不定芽置于生根培养基上进行生根诱导培养， 得到美国红枫 幼苗 ； 。
10、0012 所 述 启 动 培 养 基 是 在 MS 培 养 基 中 添 加 0.8-1.2mg/L 6- 苄 基 腺 嘌 呤， 0.08-0.12mg/L 萘乙酸， 20-40g/L 糖得到的固体培养基 ； 所述增殖培养基为在 MS 培养基中 添加0.005-0.01mg/L噻本隆， 25-35g/L糖， 得到的固体培养基 ； 所述生根培养基为在1/2MS 培养基中添加 0.08-0.13mg/L 吲哚乙酸， 18-25g/L 糖， 得到的固体培养基。 0013 所述启动培养基优选为在 MS 培养基添加 1.0mg/L 6- 苄基腺嘌呤 (6-BA)， ， 附加 0.1mg/L 萘乙酸 (NA。
11、A)， 30g/L 糖， 调节 PH 到 6.0-6.2 得到的固体培养基 ； 所述增殖培养基 说 明 书 CN 101444187 B2/4 页 4 优选为在 MS 培养基中添加 0.005-0.01mg/L 噻本隆 (TDZ)， 30g/L 糖， 调节 PH 为 6.0-6.2 得 到的固体培养基 ； 所述生根培养基优选为在 1/2MS 培养基中添加 0.1mg/L 吲哚丁酸 (IBA)， 20g/L 糖， 调节 PH 为 6.0-6.2 得到的固体培养基。各种培养基中所用的糖可为蔗糖、 葡萄 糖、 白沙糖或绵白糖。 0014 所述方法中， 所述启动培养、 增殖培养或生根诱导培养是在封口的。
12、培养瓶中进行 ； 所述芽诱导培养、 增殖培养或生根诱导培养的的培养瓶放置于温度为 20 25， 空气相对 湿度为 60-80， 光照强度 2000-30001x， 光照时间为 14-16 小时 / 天的条件下。 0015 所述方法中， 所述启动培养的时间为 20-30 天， 所述增殖培养的时间为 30-40 天， 所述生根诱导培养的时间为 20-30 天。 0016 所述方法中， 还包括将美国红枫幼苗进行移栽 ； 所述移栽的方法是在每年的三月 上旬到四月中旬将生根培养得到的美国红枫幼苗经炼苗后移至珍珠岩、 蛭石和草炭土按照 体积比为 1 2 2 的比例混合得到的混合物基质上， 覆塑料棚保温保湿。
13、， 保证棚内温度白 天温度 20-30， 夜间最低温度不低于 15， 湿度不低于 60-80， 培养 5-7 天， 然后在 3-10 天内逐步掀开塑料棚使小苗， 使小苗慢慢适应温度 15-25， 湿度 50-70的环境条件， 在 此条件下继续培养 30 天， 后即可移入大田栽植。 0017 本发明的方法与其他无性繁殖方法相比， 具有所需试验材料较易获得、 环境条件 可控误差小、 生长快、 周期短、 另外离体组织培养还可以连续运转、 周年试验生产等优点， 更 主要的是组织培养材料来源单一， 无性系遗传特性一致， 保证了美国红枫固有的优良特性。 附图说明 0018 图 1 为启动培养过程中得到的腋。
14、芽的照片 0019 图 2 为增殖培养过程中不定芽的分化和生长照片 0020 图 3 为生根培养得到的美国红枫的幼苗的照片 0021 图 4 为移栽过程得到的美国红枫苗的照片 具体实施方式 0022 下述实施例中的方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 0023 实施例 1、 美国红枫的组织培养 0024 1、 外植体处理及启动培养 0025 1) 外植体取材 ： 当年生茎段或茎尖 0026 2) 外植体灭菌方法 ： 用毛笔蘸肥皂水轻轻刷洗枝条。将刷洗后的枝条放入烧杯 中， 用流水冲洗 30min 左右， 后转入超净工作台， 移至无菌瓶中， 用 70的酒精表面灭菌 30s， 无菌水冲洗 ； 1。
15、 NaClO 溶液灭菌 2min， 无菌水冲洗， 再用 1 NaClO 溶液灭菌 2min， 无 菌水冲洗至少 3 次 ； 每次冲洗时间不少于 3min。冲洗后切去植物材料与灭菌药液接触的伤 口， 截取 1-2cm 左右带节茎段或茎尖用于组织培养。 0027 2、 美国红枫的组织培养 0028 1) 启动培养 0029 以步骤 1 得到的带节茎段或茎尖为外植体， 将其接种于装有 20ml 启动培养基的 200ml 培养瓶中， 每瓶启动培养基上接种一个茎段或茎尖， 用聚丙烯塑料瓶盖封口， 置于组 说 明 书 CN 101444187 B3/4 页 5 培室中进行启动培养， 组培室的条件控制在温度。
16、 25， 空气相对湿度为 70， 采用日光灯 照明， 光照强度 2800lx， 光照时间为 14 小时 / 天。 0030 经过实验筛选得到的最优的启动培养基为在 MS 培养基中加入 6- 苄基腺嘌呤 (6-BA)1.0mg/L， 萘乙酸 (NAA)0.1mg/L， 30g/L 绵白糖， 6g/L 琼脂， 调节 PH 为 6.0-6.2， 在 1.06kg/cm3压力下 (121 ) 下灭菌 15min， 冷却后得到的固体培养基。 0031 结果表明， 启动培养3-5天带节茎段腋芽萌动、 茎尖开始伸长， 20-30天长至2cm左 右， 出芽率 87 ( 出芽率接种外植体总数 - 污染数 - 死。
17、亡数 / 接种总数 100 )。启动 培养过程中芽的生长照片如图 1 所示， 图 1 为带节茎段接种 30 天的腋芽生长状况照片。 0032 MS 培养基成分为 ： 大量元素 ： 硝酸钾 1900mg/L、 硝酸铵 1650mg/L、 磷酸二氢钾 170mg/L、 硫酸镁370mg/L、 氯化钙440mg/L， 微量元素 ： 碘化钾0.83mg/L、 硼酸6.2mg/L、 硫酸 锰22.3mg/L、 硫酸锌8.6mg/L、 钼酸钠0.25mg/L、 硫酸铜0.025mg/L、 氯化钴0.025mg/L， 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 37.3mg/L、 硫酸亚铁 27.8mg/L， 有机成分 ： 肌。
18、醇 100mg/L、 甘氨酸 2mg/L、 盐酸硫胺素 0.1mg/L、 盐酸吡哆醇 0.5mg/L、 烟酸 0.5mg/L。 0033 2) 增殖培养 0034 当步骤 1) 得到的外植体的腋芽或顶芽长 2cm 左右时取下接入装有 40ml 增殖培养 基的 200ml 培养瓶中， 每瓶增殖培养基上接种 3-5 个腋芽或顶芽， 用聚丙烯塑料瓶盖封口， 置于与步骤 1) 所述相同条件的组培室中进行增殖培养。 0035 增殖培养基为在 MS 基本培养基中添加 0.008mg/L 塞苯隆 (TDZ)， 30g/L 绵白糖， 6g/L 琼脂， 调节 PH 值至 6.0-6.2， 在 1.06kg/cm。
19、3压力下 (121 ) 下灭菌 15min， 冷却后得 到的固体培养基。 0036 增殖培养结果表明， 增殖培养 7-10 天接种的腋芽或顶芽基部开始有愈伤组织出 现， 继续培养到 15-20 天在愈伤组织上可见不定芽分化， 培养 40 天不定芽长到 3-5cm， 分化 率为 100 ( 分化率分化出不定芽的腋芽及顶芽数 / 接种的腋芽或顶芽总数 100 )， 平均增殖系数为 5.8( 增值系数分化的不定芽总数 / 接种的腋芽及顶芽总数 100 )。 部分增殖培养过程中不定芽的分化和生长照片如图 2 所示， 图 2 为增殖培养 40 天情况。 0037 3) 生根培养 0038 将步骤 2 得。
20、到的 2cm 以上的不定芽接入装有 40ml 生根培养基的 200ml 培养瓶中， 每瓶生根培养基上接种 3-5 个不定芽， 用聚丙烯塑料瓶盖封口， 置于与步骤 1) 所述相同条 件的组培室中进行生根培养。生根培养基为 1/2MS 基本培养基 (1/2MS 培养基是指 MS 培养 基中大量元素用量减半， 其它成分不变的培养基)中添加吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L， 20g/L绵 白糖， 5g/L 琼脂， 调节 PH 值至 6.0-6.2， 经在 1.06kg/cm3压力下 (121 ) 下灭菌 15min， 冷 却后得到的固体培养基。 0039 生根培养 4 6 天在材料的基部明显可见数个颗。
21、粒状的突起， 8 10 天有白色根 发出， 培养 20 天后大部分材料的根可以达到 3-4cm( 图 3)， 生根率为 97 ( 生根率生根 的不定芽数 / 接种的不定芽总数 100 )。图 3 为生根培养 20 天后得到的幼苗照片。 0040 3、 美国红枫幼苗的炼苗移栽 0041 3 月上旬到 4 月中旬， 将步骤 2 生根培养 20 天得到的根长至 3-4cm 生根苗进行炼 苗， 具体为从组培室中取出放置到日光充足但不直射， 温度 17 -25， 湿度 50 -70的 环境中 7 天内逐步打开组培瓶的封口， 第 7 天将生根苗从培养瓶中取出， 20 30温水洗 说 明 书 CN 1014。
22、44187 B4/4 页 6 去基部残留培养基， 用 0.3的 KMnO4表面灭菌 2min， 20 30温水冲洗干净， 用于移栽 ( 图 4 中 A)。 0042 移栽具体方法如下所述 ： 0043 用珍珠岩、 蛭石、 草炭土按照体积比为 1 2 2 的比例混合， 作为培养基质， 将上 述得到的幼苗栽种到该培养基质上， 浇透水， 置于密闭、 透光的塑料小棚， 棚内温度白天保 持在 20-30， 夜间不低于 15， 湿度保持在 60-80， 此过程中第 4、 5 天时再浇一次透水， 培养第 5-7 天、 移栽苗的新叶开始展新叶， 就开始在温度 15-25， 湿度 50-70的环境下， 从两边逐步揭开塑料薄膜， 3-10天内全部揭开， 此时的幼苗照片如图4中B所示。 将幼苗继 续在环境温度 15-25， 湿度 50-70的条件下， 培养 30 天 ( 图 4 中 C)， 成活率 90 ( 成活 率成活苗数 / 移栽生根苗总数 100 )。每隔 3-5 天浇透水一次。图 4 中 C 为移栽后 30 天生长情况。 说 明 书 CN 101444187 B1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101444187 B2/3 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 101444187 B3/3 页 9 图 4 说 明 书 附 图 。