一、技术领域
本发明涉及蛇床子素单剂及其复配组合物，特别是其与腈菌唑、井冈霉素复配后在 制备防治水稻稻曲病农药中的应用。
二、背景技术
水稻稻曲病又称伪黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病，俗称“丰产果”，是由 Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak引起的水稻后期发生的一种真菌性病害。1874年Cooke 在印度首次发现稻曲病，该病害是世界主要稻作区普遍发生的一种病害。有报道其分布 范围包括中国、日本、菲律宾、印度、印尼、美国、巴西、澳大利亚、埃及、孟加拉国、 英国等5大洲40多个国家。自20世纪70年代末以来，该病在我国自南向北相继大面积发 生，并有加重趋势，已成为影响我国水稻生产的重要病害之一。一般发病田块减产 5％～10％，严重发病田块减产50％～70％。此外稻曲病菌还可产生有害毒素，影响稻米品 质，对人、畜、家禽等造成危害。
目前水稻稻曲病主要以有机铜、有机锡类药剂防治，虽然它们有良好的防效，但是 重金属类药剂在水稻穗期使用对水稻有药害作用。长期使用该类药剂不仅造成严重的农 田生态环境和水质污染，而且增加了稻米有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危 害。因此，研究新型生物杀菌剂对于控制稻曲病的发生发展，提高稻米品质意义重大。
香豆素类化合物蛇床子素(Osthol)化学名称为8-(3-甲基-2-丁烯基)甲醚繖形酮， 是伞形花科植物蛇床子中主要成分，也是欧前胡、圆当归、毛当归、栓翅芹的根和根茎， 以及芸香科植物八角、黄皮的根皮，单叶芸香等的地上部分的活性成分。该化合物的杀 虫抑菌活性已经报道。如专利ZL01127083.7“蛇床子素在农业上的应用”公开了蛇床子 素在杀虫抑菌、果蔬保鲜和农畜产品防腐等方面的应用。专利ZL200410069127.5“蛇床 子素及其复配组合物防治作物白粉病”公开了蛇床子素及其复配组合物防治作物白粉病 的使用技术和效果。关于蛇床子素、蛇床子素与腈菌唑、井冈霉素复配物防治水稻稻曲 病的应用研究未见报道。
三、发明内容
1、发明目的：本发明的目的是针对有机铜、有机锡类药剂在防治稻曲病方面存在 的不足，提供一种高效、低毒的植物源农药及其复配组合物，以减少重金属类药剂的使 用量，安全有效地控制稻曲病的发生发展。
2、技术方案：本发明一方面提供了蛇床子素在制备防治水稻稻曲病农药中的应用； 另一方面还提供了蛇床子素(A)和腈菌唑、或井冈霉素(B)以重量比为A∶B＝1∶1～1∶ 20，更优选为1∶1～10组成的复配组合物在制备防治水稻稻曲病农药中的应用。蛇床子 素与其他杀菌剂复配室内配方筛选。
供试病菌及作物：
以水稻稻曲病菌Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak为供试菌(江苏省农科院食品质 量安全与检测研究所提供)，供试水稻品种为“连粳3号”。
供试药剂：
94.7％蛇床子素溶解于95％乙醇，制成10000μg/ml母液备用；95％腈菌唑(江苏省 江阴市福达农化有限公司生产)、86％井冈霉素(上海市农药研究所生产)，分别溶解于 水和丙酮，制成10000μg/ml母液备用。
表1蛇床子素和其他杀菌剂复配比例 原药A∶B 复配比例范 围A∶B 复配例证 比例1 比例2 比例3 94.7％蛇床子 素∶95％腈菌唑 1∶1～10 1∶1 1∶2 1∶3 1∶10 94.7％蛇床子 素∶86％井冈霉素 1∶3 1∶5 1∶7 1∶10
注：表中所列比例均按药剂有效成分计算。
菌种培养：
在100ml PS培养基中接种已在PSA培养基上培养了7d的菌丝块(直径4mm)3块，25 ℃恒温水浴摇培7d的孢子菌丝悬浮液，以单层灭菌医用沙布过滤去菌丝，孢子悬浮液供 测试用。
复配组合物制备：
通过预备试验和所测定的单剂毒力曲线进行配比设计，按照表1的复配比例 进行复配，各复配剂均溶于丙酮，制成10000μg/ml母液备用。
毒力测定方法：
将上述各单剂及复配母液按表2用PS培养基稀释成系列浓度。每50ml的三角瓶中装 稀释液30ml，设空白对照和溶剂对照，每浓度3瓶。稀释时严格无菌操作。然后，每瓶 加已培养备用的菌种2.5ml，28℃恒温摇培7d(转速120r/min)。收集菌丝，冷冻真空 干燥，称取菌丝干重，计算菌丝干重抑制率。
表2各药剂系列稀释浓度 药剂 稀释浓度梯度(μg/ml) 94.7％蛇床子素 200 100 50 25 12.5 95％腈菌唑 2.0 1.0 0.5 0.25 0.125 86％井冈霉素 400 200 100 50 25 94.7％蛇床子素∶95％腈菌唑 50 25 12.5 6.25 3.125 94.7％蛇床子素∶86％井冈霉素 100 50 25 12.5 6.25
计算方法：
EC50(理论值)＝(a+b)/(a/EC50(a)+b/EC50(b))；
SR＝EC50(理论值)/EC50(实际值)。
通过菌丝干重抑制率的机率值和系列药剂浓度的对数值之间的线性回归分析，求出 各药剂的毒力曲线Y＝a+bx和EC50。根据Wadley方法评价混配剂的相互作用，a、b是各组 分在混剂中含量比例。以SR值分析混配的效果。其中，SR＝0.5～1.5，则两种药剂混配 有加和作用，SR≤0.5，则两种药剂混配有拮抗作用，SR≥1.5，则2种药剂混配有增效作 用。 94.7％蛇床子素∶95 ％腈菌唑＝1∶2 Y＝5.0715+0.8093X 0.9643 0.82 1.32 1.61 94.7％蛇床子素∶95 ％腈菌唑＝1∶3 Y＝5.1001+0.7899X 0.9771 0.75 1.18 1.57 94.7％蛇床子素∶95 ％腈菌唑＝1∶10 Y＝3.7069+1.1447x 0.9749 0.88 0.99 1.13 94.7％蛇床子素∶ 86％井冈霉素＝1∶3 Y＝3.2289+1.1081X 0.9600 39.7 64.68 1.63 94.7％蛇床子素∶ 86％井冈霉素＝1∶5 Y＝3.1321+1.1476X 0.9619 42.4 83.13 1.96 94.7％蛇床子素∶ 86％井冈霉素＝1∶7 Y＝2.5086+1.4264X 0.9706 55.8 96.95 1.74 94.7％蛇床子素∶ 86％井冈霉素＝1∶10 Y＝3.8835+0.7910x 0.9853 81.3 113.4 1.39
结果与分析：
蛇床子素和其他杀菌剂复配制剂田间药效试验。
试验设计：
具体试验设计见表4：
表4田间药效试验设计 供试作物 防治对象 试验药剂 对照药剂 水稻品种 连粳3号 水稻稻曲病菌 (Ustilaginoidea virens) 1％蛇床子素EW 20％瘟曲克星WP 12.5腈菌唑WP 2％蛇床子素·腈菌唑SE 3％蛇床子素·腈菌唑SE 4％蛇床子素·腈菌唑SE 11％蛇床子素·腈菌唑SE 20％井冈霉素WG 4％蛇床子素·井冈霉素SE 6％蛇床子素·井冈霉素SE 8％蛇床子素·井冈霉素SE 11％蛇床子素·井冈霉素sE
试验药剂：
1％蛇床子素EW 250×(“×”表示稀释倍数下同)，江苏省农业科学院，有效浓度为 40μg/ml。
12.5％腈菌唑WP 1500×，张家港市七洲农药化工有限公司生产，有效浓度为83.3μg /ml。
20％井冈霉素WG 3000×，浙江省金丰农化有限公司生产，有效浓度为66.7μg/ml。
2％蛇床子素·腈菌唑SE 400×(有效成分：1％蛇床子素+1％腈菌唑)，江苏省农业 科学院，有效浓度为25μg/ml蛇床子素+25μg/ml腈菌唑。
3％蛇床子素·腈菌唑SE 500×(有效成分：1％蛇床子素+2％腈菌唑)，江苏省农业 科学院，有效浓度为20μg/ml蛇床子素+40μg/ml腈菌唑。
4％蛇床子素·腈菌唑SE 600×(有效成分：1％蛇床子素+3％腈菌唑)，江苏省农业 科学院，有效浓度为16.7μg/ml蛇床子素+51μg/ml腈菌唑。
11％蛇床子素·腈菌唑SE 800×(有效成分：1％蛇床子素+10％腈菌唑)，江苏省农 业科学院，有效浓度为12.5μg/ml蛇床子素+125μg/ml腈菌唑。
4％蛇床子素·井冈霉素SE600×(有效成分：1％蛇床子素+3％井冈霉素)，江苏省农 业科学院，有效浓度为16.7μg/ml蛇床子素+50μg/ml井冈霉素。
6％蛇床子素·井冈霉素SE 750×(有效成分：1％蛇床子素+5％井冈霉素)，江苏省 农业科学院，有效浓度为13.3μg/ml蛇床子素+66.7μg/ml井冈霉素。
8％蛇床子素·井冈霉素SE 900×(有效成分：1％蛇床子素+7％井冈霉素)，江苏省 农业科学院，有效浓度为11.1μg/ml蛇床子素+77.8μg/ml井冈霉素。
11％蛇床子素·井冈霉素SE 1000×(有效成分：1％蛇床子素+10％井冈霉素)，江苏 省农业科学院，有效浓度为10μg/ml蛇床子素+100μg/ml井冈霉素。
对照药剂：
20％瘟曲克星WP，100g/667m2，浙江禾本农化有限公司。
空白对照：清水。
其中，EW表示水乳剂，WP表示可湿性粉剂，WG表示水溶性粒剂，SE表示水悬 乳剂。
小区设置及试验方法：
根据预备试验的结果设置系列浓度进行小区试验，设空白对照，每小区20m2，每 处理4次重复。于水稻破口前、破口期和齐穗期各施一次药，用工农-16型喷雾器喷雾， 用药液量50kg/亩。
调查方法：
最后一次施药后10d观察安全性，病情稳定期调查防治效果。采用对角线5点取样， 每处理调查5点，共100丛，调查各处理的病穗数、病粒数，计算病穗率、病粒率、病穗 防效和病粒防效。并用DPS2000数据处理系统进行分析和差异显著性检验(Duncan’S新复 极差法)。
药效计算方法：
病穗率(％)＝病穗数/调查总数×100。
病穗防治效果(％)＝(对照病穗率-处理病穗率)/对照病穗率×100。
病粒率(％)＝病粒数/调查总数×100。
病粒防治效果(％)＝(对照病粒率-处理病粒率)/对照病粒率×100。
对作物安全性：
根据观察，各药剂对水稻生长安全，无药害。
试验结果：
各药剂对水稻稻曲病的田间防治效果见表5，1％蛇床子素EW250×、12.5％腈菌 唑WP1500×、2％蛇床子素·腈菌唑SE400×、3％蛇床子素·腈菌唑SE 500×、4％蛇 床子素·腈菌唑SE 600×、11％蛇床子素·腈菌唑SE 800×等药剂的病穗防效分别为 72.3％、78.1％、84.0％、86.7％、88.4％、86.5％，病粒防效分别为75.2％、81.6％、87.7％、 90.1％、89.6％、87.6％，对照药剂20％瘟曲克星WP 100g/667m2的病穗防效和病粒防效 分别为87.3％和82.3％。方差分析结果表明，处理药剂2％蛇床子素·腈菌唑SE 400×、 3％蛇床子素·腈菌唑SE 500×、4％蛇床子素·腈菌唑SE 600×、11％蛇床子素·腈菌 唑SE 800×与对照药剂20％瘟曲克星WP 100g/667m2的防效之间无显著差异，而与两单 剂1％蛇床子素EW250×、12.5％腈菌唑WP1500×的防效之间差异达极显著水平。
1％蛇床子素EW250×、20％井冈霉素WG、4％蛇床子素·井冈霉素SE600×、6％ 蛇床子素·井冈霉素SE 750×、8％蛇床子素·井冈霉素SE 900×、11％蛇床子素·井 冈霉素SE 1000×等药剂对水稻稻曲病的病穗防效分别为72.3％、65.6％、80.3％、82.9％、 88.7％、85.6％，病粒防效分别为75.2％、67.8％、81.5％、84.1％、86.7％、88.3％，对照 药剂20％瘟曲克星WP 100g/667m2的病穗防效和病粒防效分别为87.3％和82.3％。方差 分析结果表明，处理药剂4％蛇床子素·井冈霉素SE600×、6％蛇床子素·井冈霉素SE 750×、8％蛇床子素·井冈霉素SE 900×、11％蛇床子素·井冈霉素SE 1000×与对照 药剂20％瘟曲克星WP 100g/667m2的防效之间无显著差异，而与两单剂1％蛇床子素 EW250×、20％井冈霉素WG的防效之间差异达极显著水平。
药效评价：各复配剂对水稻稻曲病均有较好的防治效果，防效可达80％左右，高于各单 剂的防效，田间能有效防治水稻稻曲病。
表5蛇床子素及其复配制剂防治水稻稻曲病田间药效试验结果 处理 病穗率(％)* 病穗防效(％)* 病粒率(％)* 病粒防效(％) 1％蛇床子素EW 250× 4.26 72.3Aa 0.115 75.2Aa 12.5％腈菌唑WP 1500× 3.38 78.1Bb 0.090 80.6ABb 2％蛇床子素·腈菌唑SE 400× 2.46 84.0Cc 0.060 87.7CDc 3％蛇床子素·腈菌唑SE 500× 2.05 86.7Cc 0.046 90.1Dc 4％蛇床子素·腈菌唑SE 600× 1.79 88.4Cc 0.048 89.6Dc 11％蛇床子素·腈菌唑 SE800× 2.04 86.5Cc 0.06 87.6CDc 1％蛇床子素EW 250× 4.26 72.3Bb 0.115 75.2Bb 20％井冈霉素WG 3000 × 5.30 65.6Aa 0.149 67.8Aa 4％蛇床子素·井冈霉素 SE600× 3.03 80.3Cc 0.086 81.5Cc 6％蛇床子素·井冈霉素 SE 750× 2.63 82.9CDc 0.074 84.1Ccd 8％蛇床子素·井冈霉素 SE900× 1.74 88.7Dd 0.062 86.7Cd 11％蛇床子素·井冈霉素 SE1000× 2.22 85.6CD 0.082 82.3Cc 20％瘟曲克星WP 100g/667m2 1.96 87.3Dd 0.082 82.3Ccd 清水对照 15.4 / 0.463 /
注：不同小写字母表示差异达0.05显著水平，不同大写字母表示差异达0.01显著水平。
*为4次重复的平均值。
安全性试验：
在上述与蛇床子素复配比例的其它杀菌剂中，其用量均为单剂常规用量一半或一半 以下，因此其对人畜的毒性与对作物的安全性是符合要求的，而在上述配方中，蛇床子 素的含量最高1％，经认定机构毒性试验结果表明1％蛇床子素水乳剂属于微毒类农药：
大鼠急性经口毒性 ♀＞5000mg/Kg；
大鼠急性经皮毒性 ♀＞5000mg/Kg；
兔眼刺激积分为0(1h)，48h后为0(1∶100)稀释，对眼无刺激性；
兔眼刺激积分为0(4h)，对皮肤无刺激性。
3、有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是提供了一种高效、低毒的植 物源农药及其复配组合物农药，以减少重金属类药剂的使用量，能安全有效地控制稻曲 病的发生发展。
四、具体实施方式
实施例1：1％蛇床子素EW 250×(有效浓度为40μg/ml)防治水稻稻曲病在水稻破 口前、破口前期各施1次药，每亩用药100ml，每亩药液量30～40千克，喷雾。
实施例2：3％蛇床子素·腈菌唑SE 500×(有效成分：1％蛇床子素+1％腈菌唑，有 效浓度为20μg/ml蛇床子素+40μg/ml腈菌唑)防治水稻稻曲病在水稻破口前、破口前期 各施1次药，每亩用药100ml，每亩药液量30～40千克，喷雾。
实施例3：6％蛇床子素·井冈霉素SE 750×(有效成分：1％蛇床子素+5％井冈霉 素，有效浓度为13.3μg/ml蛇床子素+66.7μg/ml井冈霉素)防治水稻稻曲病在在水稻破 口前、破口期各施1次药，每亩用药100ml，每亩药液量30～40千克，喷雾。