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1、(10)申请公布号 CN 103041031 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103041031 A *CN103041031A* (21)申请号 201310029357.8 (22)申请日 2013.01.27 A61K 36/808(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/06(2006.01) A61P 9/04(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街 2699 号 (72)发明人 孙连坤 刘永强 苏静 杨晓春 李洪岩 康劲松 (74)专利代理机构 吉林。
2、长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人 魏征骥 (54) 发明名称 一种中药组合物及其制备方法和用途 (57) 摘要 本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和 用途， 属于中药领域。 由下列重量份的原料药制成 的 ： 红参 160 240 份、 丹参 350 450 份、 玄参 160 240 份。本发明以传统中医理论指导组方， 治疗效果确切， 具有补气固脱， 活血化瘀， 清热利 湿的功能， 用于胸痹、 心悸、 胸痛、 气短乏力等 ； 对 于预防、 治疗一、 二级心力衰竭有较好疗效， 本发 明通过增强心肌细胞自噬活性减少凋亡发挥心功 能保护作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书。
3、 1 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 1/1 页 2 1. 一种中药组合物， 其特征在于是由下列重量份的原料药制成的 ： 红参 160 240 份、 丹参 350 450 份、 玄参 160 240 份。 2. 根据权利要求 1 所述的一种中药组合物， 其特征在于是由下列重量份的原料药制成 的 ： 红参 200 份、 丹参 400 份、 玄参 200 份。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的一种中药组合物的制备方法， 其特征在于包括下列步骤 ： （一） 将红参、 丹参和玄参粉碎成粗粉 ； （二） 红参、 玄参。
4、用 57 倍量的 5070% 乙醇提取 3 次， 每次 13 小时， 合并提取液， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对密度为 1.251.30 的浸膏 ； 丹参用 57 倍量的 7090% 乙醇提取 3 次， 每次 13 小时， 合并提取液， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对密度为 1.251.30 的浸膏 ； （三） 将上述三份药材的药渣用 57 倍量的水提取三次， 每次 12 小时， 滤过， 滤液浓缩 至 60时测相对密度为 1.251.30 的浸膏 ； 将上述浸膏合并， 减压干燥。 4.如权利要求1或2所述的一种中药组合物在制备增强心肌细胞自噬活性药物中的应 用。 5. 如权利要求 1 或。
5、 2 所述的一种中药组合物在制备增加 LC3 蛋白表达药物中的应用。 6. 如权利要求 1 或 2 所述的一种中药组合物在制备降低 p62 蛋白表达药物中的应用。 7. 如权利要求 1 或 2 所述的一种中药组合物在制备降低泛素蛋白 Ub 表达药物中的应 用。 8. 如权利要求 1 或 2 所述的一种中药组合物在制备降低心肌细胞凋亡率药物中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 103041031 A 2 1/6 页 3 一种中药组合物及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种中药组合物及其制备方法， 尤其涉及一种增强心肌细胞自噬中药 组合物及其制备方法。 背景技术 0002 心血管。
6、疾病是当今人类中危害大、 发病率和死亡率极高的一类疾病。心脏是血液 循环的源动力， 各种心脏疾病， 特别是心肌缺血性疾病往往导致心肌舒缩能力下降或丧失， 心功能低下， 心输出量不足， 组织器官供血不足， 进而产生一系列的症状和体征， 最终转归 为心力衰竭。 0003 当前仍缺乏有效的心力衰竭防治药物， 存在药物毒性较大、 疗效不满意等问题。 中 国专利 CN101584805A 公开了一种 “治疗心力衰竭的中药制剂” ， 具有一定的防治心衰的作 用， 但其组方达 11 味中药材。 0004 心室重构是心力衰竭的重要机制。心室重构涉及心肌结构与功能的变化， 如心室 形态变化、 血流动力学变化、 。
7、心肌细胞凋亡等。 0005 抑制细胞凋亡是防治心力衰竭的病理生理学基础。Bcl-2 家族成员在细胞凋亡的 调控中发挥重要作用。中国专利 CN101590180A 指出提高心肌细胞 Bcl-2 表达， 降低 Bax 表 达能够抑制细胞凋亡， 改善心力衰竭。 0006 与细胞凋亡调控密切相关的另一现象自噬， 它是负责胞内大分子物质及内源 性底物降解的途径。当细胞受到药物作用、 射线照射和机械损伤时， 自噬体数量明显地增 多。 在心肌梗死、 缺血再灌注损伤及压力超负荷等因素诱导心力衰竭的进程中， 自噬现象伴 发或先于凋亡发生。采用药物等刺激自噬发生时， 标志性蛋白 LC3 表达增加， 泛素化蛋白减 。
8、少， 接头蛋白 p62 表达减少。自噬活性增加可能减少细胞凋亡， 这是由于应激诱导的蛋白聚 集体被自噬体吞噬进而被降解， 缓解了应激， 恢复了心肌细胞稳态。 发明内容 0007 本发明提供一种中药组合物及其制备方法和用途。 0008 本发明药物组分的用量也是经过发明人进行大量摸索总结得出的， 各组分用量为 在下述重量范围内都具有较好疗效 ： 红参 160 240 份、 丹参 350 450 份、 玄参 160 240 份。 0009 优选为 ： 红参 200 份、 丹参 400 份、 玄参 200 份。 0010 本发明药物可以采用中药制剂的常规方法制备成任何常规内服制剂。优选地， 本 发明药。
9、物活性组分的制备方法如下 ： （一） 将红参、 丹参和玄参粉碎成粗粉 ； （二） 红参、 玄参用 57 倍量的 5070% 乙醇提取 3 次， 每次 13 小时， 合并提取液， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对密度为 1.251.30 的浸膏 ； 丹参用 57 倍量的 7090% 乙醇提取 3 说 明 书 CN 103041031 A 3 2/6 页 4 次， 每次 13 小时， 合并提取液， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对密度为 1.251.30 的浸膏 ； （三） 将上述三份药材的药渣用 57 倍量的水提取三次， 每次 12 小时， 滤过， 滤液浓缩 至 60时测相对密度为 1.251.。
10、30 的浸膏 ； 将上述浸膏合并， 减压干燥。 0011 本发明中药组合物在制备增强心肌细胞自噬活性药物中的应用。 0012 本发明中药组合物在制备增加 LC3 蛋白表达药物中的应用。 0013 本发明中药组合物在制备降低 p62 蛋白表达药物中的应用。 0014 本发明中药组合物在制备降低泛素蛋白 Ub 表达药物中的应用。 0015 本发明中药组合物在制备降低心肌细胞凋亡率药物中的应用。 0016 本发明以传统中医理论指导组方， 组成简单， 制备方法新颖， 克服了西药制剂的严 重不良反应， 本发明治疗效果确切， 具有补气固脱， 活血化瘀， 清热利湿的功能， 用于胸痹、 心悸、 胸痛、 气短乏。
11、力等 ； 对于预防、 治疗一、 二级心力衰竭有较好疗效， 本发明通过增强心 肌细胞自噬活性减少凋亡发挥心功能保护作用。口服胶囊剂， 一次 4 粒， 一日 3 次。 具体实施方式 0017 实施例 1 本发明胶囊剂的制备 红参 200g、 丹参 400g、 玄参 200g ； 将红参、 丹参、 玄参粉碎成粗粉， 红参、 玄参加 6 倍量 60% 乙醇回流提取 3 次， 每次 2 小 时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至 60时测相对密度为 1.30 的浸膏， 丹参加 6 倍量 80% 乙醇 回流提取3次， 每次2小时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至60时测相对密度为1.30的浸膏， 上述三份药。
12、材的药渣用 6 倍量水提取三次， 每次 1 小时， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对密 度为 1.30 的浸膏， 将上述浸膏合并， 减压干燥， 粉碎， 再加入适量淀粉， 制粒， 装胶囊， 制成 1000 粒。 0018 实施例 2 本发明颗粒剂的制备 红参 160g、 丹参 350g、 玄参 160g ； 将红参、 丹参、 玄参粉碎成粗粉， 红参、 玄参加 7 倍量 70% 乙醇回流提取 3 次， 每次 1 小 时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至 60时测相对密度为 1.25 的浸膏， 丹参加 7 倍量 90% 乙醇 回流提取3次， 每次1小时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至60时测相对密。
13、度为1.25的浸膏， 上述三份药材的药渣用 7 倍量水提取 3 次， 每次 1.5 小时， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对 密度为 1.25 的浸膏， 将上述浸膏合并， 减压干燥， 粉碎， 再加入适量的糊精、 蔗糖或甜菊苷 混匀按照常规方法制成颗粒剂。 0019 实施例 3 本发明片剂的制备 红参 240g、 丹参 450g、 玄参 240g 将红参、 丹参、 玄参粉碎成粗粉， 红参、 玄参加 5 倍量 50% 乙醇回流提取 3 次， 每次 3 小 时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至 60时测相对密度为 1.28 的浸膏， 丹参加 5 倍量 70% 乙醇 回流提取3次， 每次3小时， 滤过。
14、， 滤液回收乙醇， 浓缩至60时测相对密度为1.28的浸膏， 上述三份药材的药渣用 5 倍量水提取三次， 每次 2 小时， 滤过， 滤液浓缩至 60时测相对密 度为 1.28 的浸膏， 将上述浸膏合并， 减压干燥， 粉碎， 再加入适量淀粉， 按照常规方法制成 片剂。 0020 下面通过具体药效学试验进一步说明本发明的效果。 说 明 书 CN 103041031 A 4 3/6 页 5 0021 试验例 1 ： 三参维心胶囊对大鼠实验性心力衰竭的保护作用 一 试验材料 1. 药物 ： 本发明药物， 以下简称三参维心胶囊， 2.2g 生药 /g 干粉， 中药阳性对照药生 脉饮， 0.4g 生药 /。
15、ml， 江西福仁堂药业有限公司生产， 批号 20100701。人参茎叶皂苷胶囊， 0.2g/ 粒， 吉林中研药业有限公司生产， 批号 20100502。丹参片， 吉林鑫辉药业有限公司生 产， 批号 20110801。 0022 2. 动物 ： 雄性 Wistar 大鼠， 体重 180-200g， 吉林大学实验动物中心提供。合格证 编号 ： SCXK-（吉） 2008-0005。 0023 3.仪器 ： 心脏彩色多普勒超声仪(GE vivid-， 美国通用公司)， 多道生理信号采 集处理系统 ( 成都泰盟科技有限公司， BL-420F)， 显微摄影图像分析系统 （成都泰盟科技有 限公司， BI2。
16、000） 。 0024 二 试验方法 ： 模型制备 大鼠适应性饲养一周。 大鼠适应性饲养一周后， 参照文献方法结扎大鼠冠状 动脉左前降支 （LAD） 复制心肌梗死诱导的心力衰竭模型。方法如下 ： 乙醚吸入麻醉大鼠， 仰 位固定， 胸部正中去毛， 做荷包缝合， 以手术刀正中切开， 钝性分离肋间肌肉， 自左侧第三、 四肋间打开胸腔， 暴露心脏， 于左心耳根部下方 2mm 处进针， 在肺动脉圆锥旁出针， 深度为 1 1.5mm， 立即结扎并将心脏送回胸腔， 快速挤出胸腔内空气， 结扎荷包缝合线关闭胸腔， 开胸时间不超过 30 秒。假手术组只穿线不结扎。术后大鼠肌肉注射青霉素 10 万单位 / 只 /。
17、天， 连续给药5天。 结扎LAD 3天后， 乙醚麻醉大鼠， 采用心脏彩色多普勒超声仪观察大鼠 心功能， 根据左室射血分数 （LVEF） 的下降 （美国心脏超声协会标准， LVEF 低于 45%） 确定入 选实验大鼠。 0025 分组给药 ： 58 只大鼠随机分为 6 组，（1） 假手术组 （生理盐水） ，（2） 模型组 （生理盐 水） ，（3） 阳性药生脉饮组 （2.4g 生药 /Kg） ，（4） 阳性药丹参片组 （0.3g /Kg） ，（5） 阳性药人 参皂苷组 （0.125g/Kg） ，（6） 三参维心胶囊组 （0.5g /Kg） 。药物以蒸馏水配至所需浓度， 灌 胃给药， 每天一次， 连。
18、续给药 4 周。 0026 观察指标 ： 1 超声心动图评价心功能 治疗结束后， 胸部去毛， 乙醚麻醉大鼠， 采用心脏彩色多普 勒超声仪观察大鼠心功能， 记录左室舒张末期内径 （LVEDD） ， 左室收缩末期内径 （LVESD） ， LVEF 及缩短分数 （FS） 。 0027 2 血流动力学 20% 氨基甲酸乙酯 (1.2g/kg) 腹腔注射麻醉大鼠。分离右侧颈总 动脉， 行左心室插管， 心室插管的非插入端通过换能器与多道生理信号采集处理系统 , 同 步左室收缩压 (LVSP)， 左室最大上升和下降速率 (dp/dtmax)， 左室舒末压 (LVEDP)。 0028 3 脏器指数 处置大鼠前。
19、称量大鼠体重， 采集血流动力学数据后用生理盐水进行 灌洗， 取出心脏， 称重 ； 沿房室沟剪掉心房与动脉， 紧贴室间隔右侧剪下右心室游离壁， 剩 余部分为左心室， 称重， 计算全心质量指数、 左室质量指数 ； 脏器指数为脏器重量 g/ 体重 g100。 0029 4 免疫印迹 左心室横截部分匀浆， 提取组织蛋白。 采用免疫印迹法检测自噬相关 蛋白 LC3 及 p62、 Ub 表达变化， 各组数值采用灰度值与内参 （-actin） 的比值进行比较， 取 三次实验平均值。 说 明 书 CN 103041031 A 5 4/6 页 6 0030 5 细胞凋亡率 制备左心室横截面组织切片 （2.5uM。
20、 厚） ， 进行 TUNEL 染色， 在显微 镜下 （200 倍） 选取 5 个视野统计 TUNEL 阳性着色细胞数及总细胞数的平均值， 计算阳性细 胞数与总细胞数比值。 0031 三 实验结果 ： 1 、 三参维心胶囊对心力衰竭模型大鼠心功能的影响 表 1 三参维心胶囊对大鼠超声心动图指标的影响 (SD) 注 ： 与假手术组相比， *P 0.001 ； 与模型组相比， #P 0.01，#P 0.001 表 2 三参维心胶囊对大鼠血流动力学的影响 (SD) 注 ： 与假手术组相比， *P0.01， *P0.001 ； 与模型组相比， #P0.05，#P0.01， #P 0.001. 上述实验结。
21、果显示， 模型组由于心肌梗死， 导致 LVEDD、 LVESD、 LVEDP 显著升高 （P 0.01 P 0.001） ， LVEF、 FS、 LVSP、 dp/dtmax显著降低 （P 0.001） ； 三参维心胶囊组 可降低 LVEDD、 LVESD、 LVEDP（P 0.05 P 0.001） ， 升高 LVEF、 FS、 LVSP、 dp/dtmax（P 0.05P0.001） 。 表明三参维心胶囊可使心脏舒缩功能得到改善， 其效应与阳性药无 显著差异。 0032 2 、 三参维心胶囊对心力衰竭模型大鼠脏器指数的影响 表 3 三参维心胶囊对大鼠脏器指数的影响 (SD) 说 明 书 C。
22、N 103041031 A 6 5/6 页 7 注 ： 与假手术组相比， *P 0.001 ； 与模型组相比， #P 0.05，#P 0.01. 实验结果显示， 模型组心脏指数、 左室指数明显增加， 与假手术组比较有显著性差 异 (P0.001); 三参维心胶囊组心脏指数、 左室指数降低， 与模型组比较亦有显著性差异 (P0.05 P0.01)。其效应与各阳性药无显著差异。 0033 3、 三参维心胶囊对大鼠心肌细胞自噬相关蛋白及凋亡率的影响 表 4 三参维心胶囊对大心肌细胞自噬相关蛋白及凋亡率的影响 (SD， n=3) 注 ： 与假手术组相比， *P 0.05， *P 0.01 ； 与模型组。
23、相比， #P 0.05，#P 0.01. 实验结果显示， 模型组 LC3、 p62、 Ub 表达均有增加， 后二者与假手术组比较有显著性差 异 (P0.05 P0.01); 三参维心胶囊组 p62、 Ub 表达降低， LC3 表达明显增加， 与模型组比 较有显著性差异(P0.05P0.01) ， 与各阳性药无明显差异。 较之假手术组， 模型组细胞 凋亡率显著增加 (P0.01)， 三参维心胶囊组细胞凋亡率则显著低于模型组 (P0.01)， 亦低 于各阳性药组， 但无统计学差异。 0034 病理检查心室梗死边缘区可见假手术组心肌排列整齐， 细胞无萎缩或肥大， 间质 未见水肿及结缔组织增生 ； 模。
24、型组组心肌纤维排列紊乱， 心肌结构松弛， 心肌间质明显水 肿， 发生炎性细胞浸润及间质纤维化， 可见结缔组织增生， 心肌纤维增粗 ； 三参维心胶囊组 心肌细胞排列较为整齐， 间质水肿明显减轻， 间质中少见结缔组织增生和炎性细胞浸润， 心 肌纤维未见明显增粗， 各阳性药组亦有类似改变。 0035 综上， 三参维心胶囊对心肌梗死诱导的心力衰竭具有明显的保护作用。其作用机 理为增强心肌细胞自噬活性， 清除胞内蛋白聚集， 降低心肌细胞凋亡率， 抑制心肌肥大并提 高心室舒缩能力， 进而改善心衰大鼠心功能。 说 明 书 CN 103041031 A 7 6/6 页 8 0036 急性毒性试验 一 试验材料。
25、 1. 药物 ： 三参维心胶囊， 2.2g 生药 /g 干粉 ； 2. 动物 ： ICR 小鼠 50 只， 雌雄各半， 体重 20-22g， 吉林大学实验动物中心提供。合格证 编号 ： SCXK( 吉 ) 2007-0003。 0037 二 试验方法 ： 根据预实验情况， 禁食12h后将小鼠随机分为5组， 每组10只， 按照 剂量梯度 1 日内 3 次给予药物， 给予容量为 0.4mL/10g 体重， 观察 7 天， 记录死亡情况并进 行分析。 0038 三 实验结果 ： 给药当时各组小鼠出现动物精神不振、 身体蜷缩， 4h 后出现动物死 亡。经由统计分析， 可知三参维心胶囊的 LD50为 60.26g 生药 /Kg， 相当于临床应用剂量的 753 倍。说明本发明毒性较低， 安全性良好。 0039 大鼠长期毒性试验 应用 Wistar 大鼠， 三参维心胶囊按 4g/kg, 2g/kg, 1g/kg( 相当于临床拟用量的 50、 25、 12.5 倍， 分别为药效学有效剂量的 8、 4 和 2 倍 ) 剂量分组， 大鼠连续灌胃给药 3 个月、 6 个月及停药 4 周后各组动物未见严重不良反应。病理检查各脏器均未见该药引起的明显中 毒性病理改变。因此， 本品大鼠长期给药的无毒剂量为 4g/kg。 说 明 书 CN 103041031 A 8 。