技术领域
本发明涉及医药、食品、饮料和试剂等技术领域，具体地说是涉及一种蛋白质巯基保护 试剂的新用途，更具体地说是涉及一种蛋白质巯基保护试剂2-巯基-3-丁醇 (2-Mercapto-3-Butanol，简称：2-SH-3-丁醇)的新用途，再具体地说是涉及2-巯基-3-丁醇能 够用于制备抗晶状体浑浊产品的新用途。
背景技术
(一)2-巯基-3-丁醇的概况
2-巯基-3-丁醇(或称：3-巯基-2-丁醇)，CAS号：37887-04-0，CBNumber：CB2129062， 产品类别：香精与香料/香料/植物性天然香料/精油，英文同义词：FEMA 3502；Femano.3502； (R*，S*)-3-mercaptobutan-2-ol；3-Mercapto-2-butanol；3-Thio-2-butanol；3-sulfanylbutan-2-ol； 2-MERCAPTO-3-BUTANOL；3-Mercapto-2-butanol；3-MERCAPTOBUTAN-2-OL等)。
分子式：C4H10OS，分子量106.19，无色透明液体，沸点：58～60℃/10mmHg，比重(25 ℃)：1.0410-1.017，密度1.013g/mL(25℃)，折射率1.4779，折光率(20℃)：1.4756-1.485， 闪点：59℃。
3-巯基-2-丁醇是合成食用香料2，3-丁二硫醇的副产物之一，同样是一种具有葱肉香的香 料化合物，具有肉香、烤肉香、洋葱、大蒜香气，主要用于肉类、家禽类及烧烤食品中，用 于调配鸡肉、烤牛肉、猪肉、洋葱、大蒜、调味品等香精，在最终加香食品中浓度约为0.2mg/kg。 与一般的香料化合物相比，它具有更宽的可使用质量分数范围((0.002～20)×10-6)，可以作 为一种香料单独使用。
安全管理情况：3-巯基-2-丁醇的FEMA编号为3502，CoE编号为760，IOFI。中国GB 2760 -1996批准为允许使用的食品香料。
3-巯基-2-丁酮(Ⅲ)及其氢化产物3-巯基-2-丁醇是两种葱香属肉味香料，在食品工业中 广泛应用。目前国内外合成3-巯基-2-丁醇较成熟的方法是以3-卤代-2-丁醇作原料来合成，国 内更多地采用3-溴-2-丁醇与NaHS直接作用法，有关其具体的合成方法及其改进方法可参见 《3-巯基-2-丁醇的合成》(《化学试剂》1999年05期，田红玉、孙宝国、徐理阮)、《3-巯基-2 -丁醇合成方法的改进及其异构体组成的分析鉴定》(《合成化学》1998年第4期，南开大学 元素有机化学研究所邢晓东、唐国志)等文献。
缩略词表
英文缩写 英文全称 中文名称 HMW High molecular weight 高分子聚合状态 PTM Post translational modification 翻译后修饰 RSL Reactive site loop 环状结构区 Ts Tosyl 对甲苯磺酰基 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 TAB Tert-butyl alcohol 叔丁醇 Ts Tosyl 对甲基磺酰基 UPP Ubiquitin-proteasome pathway 泛素蛋白酶体途径 PTM Post translational modification 翻译后修饰 LEC Lens epithelial cells 晶状体上皮细胞 PBS Phosphate-Bufer-Solution 磷酸盐缓冲液 GO Glucose oxidase 葡萄糖氧化酶 OS Oxidase Stress 氧化应激 ROS Reactive oxygen species 活性氧 RNS Reactive ntrogen species 活性氮 G3PD Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 NOS Reactive Ntrogen Species 活性氮自由基 TTase Thioltransferase 硫醇转移酶 Trx Thioredoxin 硫氧还蛋白 TR Thioredoxin reductase 硫氧还蛋白还原酶 Tr Tris HCL-Bufer-Solution Tris HCL缓冲液 GR Glutathione reductase 谷胱甘肽还原酶 Cys Cysteine 半胱氨酸 EB Ethidium bromide 溴化乙锭 CF Cystic fibrosis 囊性纤维化
TEMED Tetramethylethylenediamine N，N，N′，N′-四甲基乙二胺 DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚枫 CK-19 Cytokeratin-19 细胞角蛋白19 dsRNA Double-stranded RNA 双链RNA siRNA Small interfering RNA 小干扰RNA NC Negative control 阴性对照 RT Reverse transcription 逆转录 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 FAM Carboxyfluorescein 羧基荧光素 Abs Absorption wavelength 吸收波长 Em Emission wavelength 发射波长
(二)白内障的研究概况
1、概述
白内障是目前世界上影响人类健康的常见病，是严重影响人类健康的常见病、多发病， 也是最常见的致盲原因之一，位列中国第一位致盲的疾病，其发病机制尚不十分清楚。
白内障临床研究表明，在各类白内障病例中，由老化所引起的老年性白内障占有绝大部 分的比例。老年性白内障为双眼病，但两眼发病可有先后。根据白内障开始形成的部位，老 年性白内障分为皮质性白内障(corticsal cataract)、核性白内障(nuclear cataract)和囊性白内 障(subcapsular cataract)，其中皮质性白内障是老年性白内障最常见的类型。
老年性白内障是老年人视力下降的主要原因，该病主要表现为在晶体老化过程中逐渐出 现变性浑浊，又称变性白内障。在美国85岁以上的老年人中，患病率约占95％。
全世界特别是中国，面临人口快速增长的巨大压力及老龄化趋势加重的严峻局面，更加 需要大力加强对白内障发病机理及影响因素的研究，以努力控制和减缓由此带来的白内障发 病率上升的趋势。
2、白内障的形成原理及其病因学研究进展
白内障的发生与多种因素有关，是多种因素综合作用的结果。比如晶状体蛋白的基因突变、 晶状体遭受氧化损伤、辐射损伤、老化变性、葡萄糖过度刺激、半乳糖等代谢障碍、脂质过氧 化损伤等均可对晶状体的正常功能造成不同程度的损伤，结果导致晶状体发生混浊，影响晶状 体对光的透射和折射，从而造成视物不清。
晶状体的功能是将光线聚焦到视网膜上产生视觉。晶状体的主要成分是水和蛋白质，晶状 体干重的80％～90％是蛋白质，每种蛋白质的结构和它们彼此之间的相互作用是维持晶状体透 明性的分子基础，所述的蛋白质包括α、β及γ三大族晶体蛋白。
晶状体的透明度是由恒定的水分含量、高浓度的蛋白质以及复杂的新陈代谢来保持的，即 每种蛋白质的结构和它们彼此之间的相互作用是维持晶状体透明性的分子基础；也就是说，晶 体蛋白的有序排列是维持晶状体空间结构的物质基础，即如果晶体蛋白组成发生改变，则会影 响、破坏此种正常结构。
晶状体的透光性主要是取决于晶状体中水溶性蛋白组分的质和量，尤其是几种主要的结 构蛋白如βB2(定义可参见文献：Aarts HJ，Lubsen NH，Schoenmakers JG..Crystallin gene expression during rat lens development.Eur J Biochem，1989，183(1)：31-36)、γ5，6(γC，γD)、 γ1，4、γ2，3和伴侣蛋白αA2及αB2。水溶性晶体蛋白的质和量的改变，直接影响晶体的透光 性以及白内障的形成，以βB2为代表的高含量的晶体结构蛋白亦对晶状体的结构及其正常透 光性起着举足轻重的作用。
α族晶体蛋白具有特殊的分子伴侣(Molecular Chaperone)作用，对于维持晶状体的正常 结构起着关键作用；α族晶体蛋白的含量在老化过程中变化趋势，直接影响其分子伴侣活性的 改变；随着老化进程，通常α族晶体蛋白分子伴侣作用减弱，而在白内障晶体中，则显现大量 α族晶体蛋白转变为非水溶性的高分子量交联聚合物。
所谓分子伴侣，是指一类能够介导其它蛋白质的正确折叠和装配，以保护该蛋白质的活性， 但它本身却不是有功能的最终装配产物的组成成分。但是，α族晶体蛋白是一种特殊的具有分 子伴侣作用的蛋白，它不仅具有分子伴侣活性，而且也是晶体中最重要的结构蛋白之一。
晶体的透光性不仅需要足够量的水溶性成份来维持，而且还需要考虑晶状体的特殊代谢方 式：晶体蛋白自生成之日起，不断被后生成的晶体蛋白向晶体的核心部挤压，并储存在不同的 晶体结构层。因此，无论水溶性蛋白组分还是水不溶性组分，均无法代谢到体外。不过水溶性 成份的积累有助于构建晶体从内到外层的正常结构；而水不溶性成份的渐次积累，则会逐渐增 大晶体的光散射，不利于透光性，也就是说，它是老年性白内障形成的物质基础。
哺乳动物自出生后，由于晶体暴露在外，在晶状体发育成长过程中，晶体蛋白受机体自身 自然老化及诸多外界因素的影响，易受体内外多种因素的影响而发生变异，会发生不同的修饰 变性。晶体蛋白的质和量会发生改变，水溶性成份不断转变为水不溶性成分，影响其水溶性， 进而影响晶状体的正常结构和透光性，最终导致老年性白内障的形成。也就是说，在人体衰老 的过程中，一旦晶状体中的蛋白质结构受到破坏，则晶状体由清澈透明变为混浊不透明，进而 影响晶状体的正常结构及透光性，并逐步演变为老年性白内障。
综合文献相关晶体蛋白的结构特点，研究发现影响其蛋白结构的主要因素为翻译后修饰 (posttranslational modification，简称：PTM)，即许多晶体蛋白在翻译后可通过酶的催化或在 酶控制下反应而发生的修饰，其主要包括糖基化、氧化、氨甲酰化、磷酸化、乙酰化、羟基化、 脱酰胺、消旋和切除作用等。晶状体蛋白质周围存在许多活性分子，包括糖、来源于尿中的氰 酸盐、糖皮质激素和具有活性的其他代谢产物等，这些均可在非酶环境下攻击蛋白质。
因此，维持晶状体的透光性，一方面，需保持晶状体中足够的水溶性蛋白的量，这主要取 决于机体内部晶体蛋白的基因不遭受突变，能够实施正常表达即可，如需要某种晶体蛋白进行 高表达或低表达，则可采用基因工程方法，激活或抑制相应的基因；另一方面，需要尽力遏制、 减缓晶体蛋白由水溶性蛋白向水不溶性蛋白的转变。
3、白内障的治疗现状
白内障是世界性致盲性疾病。临床诊疗方面，目前对于白内障的唯一有效治疗手段是外 科手术。尽管白内障手术已日臻完善，但不可避免的手术并发症和社会经济问题仍十分严重， 如手术后数年内后发性白内障、继发性青光眼或角膜损伤等发生率较高，通常难以根除。
寻找有效的预防和药物治疗方法，早期控制白内障，仍然是该领域的研究热点。预防和 药物治疗白内障主要有两种途径，即减少白内障发病的危险因素和应用抗白内障药物。
与白内障发病相关的主要危险因素有糖尿病、青光眼、近视、长期应用皮质类固醇、严 重腹泻、紫外线辐射、大量饮酒和吸烟等。Taylor等总结为6个“D”，即阳光辐射、饮食、 药物、糖尿病、脱水和原因不明。减少这些可能的危险因素是一种积极的预防手段。
在药物应用方面，现已研制出数十种药物用于临床，用于维持晶体的透光性延缓或治疗 白内障。由于缺乏对于白内障生成机理的完善依据，研制并仍在使用的诸多药物，仍存在不 少的缺陷，例如有效率较低、针对性差等。因此，虽然名目繁多的抗白内障药物在世界各国 广泛应用，但是尚存在很多问题。白内障的药物治疗仍然面临着严峻的挑战：尽管有数十种 抗白内障药物已被广泛临床使用，但证明其有效性的直接证据甚少。
由于白内障的发生是各种因素综合的结果，其发病原因还没有定论。当前，各科研组织 多是针对某一发病因素，或是对抗发病过程中眼的某些生理生化变化进行抗白内障药物的研 究开发。如今已经用于白内障治疗的药物主要有以下几类：
①醛糖还原酶抑制剂(简称：ARlS)是第一类被系统地研究并进行临床实验的抗白内障 药物，使用该药物是基于1962年提出的渗透压学说和早期糖尿病性大鼠晶状体以及高糖孵育 环境下，晶状体中大量的山梨醇沉积的证据。
代表药物有卡他林(Catalin)和法可立辛(Phacolysin)，通过抑制晶状体中多元醇的积 累，起到缓解糖性白内障的作用，同时二者与晶体蛋白的结合力都很强，可保护晶体蛋白不 受因色氨酸代谢异常而产生的醌亚氨酸的损伤；但临床应用及实验室验证表明，ARIS治疗糖 性白内障并非有效，而且ARIS的副作用严重，其药物机制“名不符实”。
②针对白内障发生的自由基氧化学说而开发的抗氧化药物抗氧化的药物品种很多，包 括谷胱甘肽、牛磺酸、维生素E、维生素C、β胡萝卜素，以及带有还原性琉基的各类化合 物等。
谷胱甘肽和药物前体：随着老化和白内障的形成，晶状体中谷胱甘肽的水平降低，故增 加谷胱甘肽会有益于治疗白内障。谷胱甘肽是一种三肽(γ谷氨酰胺、半胱氨酸、氨基乙酸)， 它在晶状体中的水平将会被三肽自身、或者一种药物前体如酯、或者被氨基酸组分激活。谷 胱甘肽可抑制糖基化。许多实验采用谷胱甘肽的酯和它的二肽前体，抑制各种实验性白内障 的形成，但一般要比诱发白内障的因子同时或提前使用，可能的原因是简单地减少诱发因子 的攻击或影响该因子的吸收。例如，谷胱甘肽单异丙基酯或提前一小时应用谷胱甘肽和γ谷 氨酰胺半胱氨酸酯，可抑制Buthionine Sulphonimine诱导的白内障的发生；较亚硒酸钠提前 30分钟应用谷胱甘肽和单异丙基酯，可减少硒性白内障的发生；在X射线辐射大鼠前注射半 胱氨酸、硫脲、谷胱甘肽和半胱胺可减少辐射的副作用；X射线辐射大鼠一天后，谷胱甘肽 单异丙基酯能保护X射线辐射诱导的白内障形成。
半胱氨酸是谷胱甘肽限制性底物，故使用半胱氨酸(或药物前体)可抑制白内障，如果 能减少硫基或双硫基团，双硫化合物是较好的抗白内障药物。但目前临床试验甚少。
牛磺酸：牛磺酸可抑制半乳糖性白内障，阻止晶状体蛋白的糖基化和氧化。若饮食中增 加牛磺酸替代品，可减少由于晶状体细胞的损害导致的γ晶体蛋白向玻璃体的渗漏，被认为 是一种较好的抗氧化剂和抗白内障药物。
牛磺酸是一种磺基氨基酸，在人体中大量存在，其具有抗氧化作用，能保护细胞和组织 免受氧化损伤。晶状体具有蓄积牛磺酸的能力，在晶状体中牛磺酸约占非蛋白质水解氨基酸 的50％，是晶状体中重要的氨基酸。随着白内障病程的发展，晶状体中午磺酸的含量显著降 低。世界各国的一些研究小组近年来进行了一系列系统研究，发现牛磺酸对亚硒酸钠性白内 障的抑制作用与其抗氧化特性有关，而牛磺酸能够预防或延缓糖尿病性白内障的作用机制主 要为：抗氧化作用；膜稳定作用；降血糖作用；渗透压调节作用。牛磺酸的抗氧化作用和渗 透压调节作用对白内障的防治具有一定的可行性。
由美国国家眼科研究所资助的大规模年龄相关性眼病研究(简称：AREDS)，对5000例 进行为期5～10年的随访调查，目的是揭示大剂量抗氧化剂和锌添加剂的摄入对年龄相关性 眼病包括白内障的防治作用。最近的报道对年龄55～80岁的3640例，长期服用维生素类药 物的情况进行调查，平均随访6.3年，结果建议55岁以上有可疑年龄相关性黄斑变性，应服 用抗氧化剂，如维生素C、维生素E、β胡萝卜素和锌，但大量摄入营养仅可提供很有限的 抗白内障作用。
抗氧化剂越来越多的试验证实了，在白内障发生发展中，氧化损伤作用是各个层次上生 理生化变化的枢纽，所以对各种抗氧化剂的研究成为抗白内障药物开发的焦点。日本学者研 究了一系列还原性硫醇衍生物，发现它们可与游离基快速反应，阻断谷胱甘肽被氧化，恢复 晶状体的正常状态。其中，双硫伦(Disulfiram，简称：DSF)是这类药物中具有较高活性的 一种前体药物，脂溶性的DSF透过角膜上皮后，可以转化为其单体二乙二硫氨甲酸 (Diethyldithjocarbamateacid，简称：DDC)发挥抗白内障作用，对于急性硒性大鼠白内障模 型具有明显的延缓白内障发生发展的作用，并能减轻氧化造成的损伤。
但是，单纯应用维生素类对于抗氧化剂的预防和治疗白内障的作用有限，临床资料缺乏 可比性。
③针对因眼组织能量新陈代谢失调，特别是制造不足而导致的白内障而开发的能量补充 剂，主要含有维生素B1、B2、B6、烟酰氨、腺嘌呤核苷、琥珀酸、遍多酸、维生素C、维生 素E、ATP、儿茶酚、细胞色素C等成分。
④针对钙离子过多引起的白内障而应用于白内障治疗的Ca离子拮抗剂维拉帕米，能够 阻断细胞钙离子的内流，降低白内障眼组织中的钙离子的浓度。
⑤针对Mallard反应为发病机理的药物，如布洛芬、DETAPAC等。
⑥中草药制剂，如八味地黄丸、珍珠明日液及雪叶莲挤压汁和美国金缕梅的浸出液等；
⑦氨基酸制剂Phakan，含有谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、肌醇、盐酸吡哆醛等。
⑧阿司匹林
阿司匹林是二十世纪最伟大的发明之一，作为治疗药物不断有新的用途出现。研究表明， 阿斯匹林也具有抗白内障的作用。通过动物实验研究阿司匹林的作用机理，认为阿司匹林抗 白内障机制有4种：(A)抑制非酶性蛋白质糖基化，即阿司匹林与晶体蛋白中赖氨酸残基结 合，阻止葡萄糖与赖氨酸的非酶性糖基化反应，并可防止晶体蛋白聚合物形成；(B)抑制晶 体蛋白的氨基甲酰化，阿司匹林的乙酰基与晶体蛋白的氨基酸基团结合，阻断了氨基酸残基 甲酰化反应，使蛋白分子表面的正常电荷配布免遭破坏，从而维持了晶体蛋白的正常结构； (C)抑制脂质过氧化，阿司匹林的乙酰基可优先夺取晶体蛋白的活性氨基位点，避免了脂 质过氧化给晶体带来的损害；(D)阿司匹林通过抑制膜上的环氧化酶使晶体细胞膜上的钙通 道失活，从而防止晶体蛋白多肽链的聚合反应。
阿司匹林类药物廉价方便，副作用较少，有潜在的治疗老年性白内障的临床应用价值， 但该药物适应症甚广，有部分病人对该药有依赖性，长期较大剂量的口服亦会有副作用，如 临床个案发现，长期大剂量应用阿司匹林会导致胃出血。
⑨糖基化抑制剂
蛋白质糖基化学说—糖基化反应。此学说的核心是还原糖醛基与蛋白质中自由氨基(赖 氨酸或精氨酸的。NH2或蛋白质分子的N端游离的-NH2)发生非酶性糖基化反应(Maillard 反应)，生成含Schiff氏碱基对的中间产物，在经过一系列缓慢的Amadori结构重排后，形成 有酮胺结构特征的各种Amadori产物，再经脱水和分子重排后，最终形成有荧光和蛋白质交 联特性的各种糖基化终产物(简称：AGE)。
糖基化抑制剂——氨基胍：氨基胍(aminoguanidine)是一种亲核肼的衍生物，70年代 认为可抑制糖基化末端产物的形成以及抑制二胺氧化酶、一氧化氮合成酶和过氧化氢酶活性。 近年的研究表明，氨基胍、1，3-二氨基胍和甲基氨基胍可抑制醛糖还原酶。但在半乳糖性白 内障模型中，这3种化合物并无醛糖还原酶抑制剂的作用。氨基胍是糖基化抑制剂，被用于 糖尿病并发症的治疗，包括白内障，它能够与糖基化的化合物结合，在糖基化各个时期抑制 早期和晚期糖基化产物。氨基胍可抑制轻度糖尿病性大鼠晶状体的混浊，可降低链脲佐菌素 诱导糖尿病大鼠主动脉、肾小球和肾小管血液中荧光值，减少尿中白蛋白的分泌，但不能降 低肾皮质已升高的山梨醇水平。氨基胍的主要作用是抑制糖基化，而不是改变生物化学过程。 氨基胍还可抑制钙依赖的Calpain(内肽酶)蛋白水解酶介导的晶状体蛋白质的水解，阻止遗 传性Shumiya大鼠白内障。该药物已用于临床试验，其衍生物和清除糖基化交联因子正在研 究中。
⑩Calpain抑制剂
硒性白内障是快速、有效和重复性良好的白内障模型，已广泛应用于白内障发病机制和 评价抗白内障药物的研究。蛋白质水解酶诱导的晶体蛋白的切除作用，特别是钙依赖的 Calpain蛋白水解酶LP82和M Calpain的激活，在该白内障发病中起重要作用。Calpain蛋白 水解酶抑制剂E64可延迟大鼠硒性白内障的形成，但必须在亚硒酸钠应用前；E64在离体孵 育晶状体中可抑制晶状体的混浊，其它还包括E64D和S J A6017等。但重要的问题是在白内 障晶状体中尚未发现Calpain诱导的局部晶体蛋白的水解。钙依赖的Calpain蛋白水解酶在幼 鼠晶状体中的含量远远超过了人的含量，所以它与人白内障的发病存在不同的机制。Calpain 抑制剂主要是实验室研究结果，尚无临床资料。
糖基化抑制剂、谷胱甘肽和药物前体、相分离抑制剂和Calpain抑制剂等的研究虽有较大 进展，但仍需要临床研究的进一步验证。此外，还有许多有希望成为抗白内障的药物正在开 发和研制中。
4、白内障治疗药物研究的发展趋势
目前，手术是白内障的最直接、最有效的治疗方法。尽管白内障手术已较成熟，但不可 避免的有相应的手术并发症，而且患者需要选择最佳的手术时期，过了最佳手术期便不会有 太好的效果。因此，研究白内障的致病因素，发病机制，和有效的抗白内障药物极其重要。
一般认为，自由基损伤是引起各种致白内障因素作用的共同途径，晶状体上皮细胞过度 凋亡及晶状体蛋白损伤也是白内障发生机制中的重要因素。随着对白内障发病机制的深入研 究，越来越多的研究者认识到虽然不同的损伤因子导致白内障的途径和机制各不相同，但他 们大多通过一个共同的最终产物——高分子量物质(High molecular weight，简称：HMW) 而导致晶状体混浊。多年来人们对白内障的病因和发生机制进行了大量研究，针对不同的病 因学说应用不同的药物治疗白内障，尽管目前在世界范围内有近40多种抗白内障的药物在临 床上广泛应用，但其疗效不十分确切，手术治疗仍然是各种白内障的主要手段。因此研究新 型抗白内障药物的疗效，探讨其干预的机制是白内障研究领域的重要内容。
白内障的发生是多因素共同作用而导致的综合结果，其病理变化是多水平多层次的。随 着研究手段的不断提高，对白内障发病机理的研究也将日益深入，同时对治疗白内障药物的 开发针对性也就越强。理想的白内障治疗药物应该能够恢复晶体的正常代谢和促进晶体混浊 的吸收，但至今为止尚无一个药能够达到上述要求，尽管如此，任何有希望的抑制白内障发 病的措施都显示出研究的价值，而世界医学的传统宝库还有待发明人去开发。
现临床上多种用于治疗白内障的药物，由于缺乏对于白内障生成机理的完善依据，使仍 在广泛使用的诸多药物存在不少缺陷：有些效率较低、针对性差，有些还有较大的副作用。 为此，亟待进一步探明白内障发病机理、找出影响晶体透光性的易感蛋白，作为治疗和预防 白内障的有效靶点，设计有针对性的药物，以达延缓晶体老化和预防、治疗白内障的目的。
随着白内障发病机理的研究不断趋于完善，也一定会产生更多相关的应用思路和切实可 行的方法服务于临床治疗，同时也为研究防治晶状体浑浊提供了一条新的策略。
因此，寻找新型、成分明确、疗效确切、不良反应小的抗晶状体浑浊产品仍然势在必行， 特别是药物，意义重大，并具有显著的社会效益和经济效益。经文献检索等，迄今为止，尚 未发现利用2-巯基-3-丁醇作为抗晶状体浑浊产品尤其是抗晶状体浑浊药物的报道。
发明内容
本发现所需要解决的技术问题是公开了一种蛋白质巯基保护试剂的新用途，即蛋白质巯 基保护试剂2-巯基-3-丁醇具有抗晶状体浑浊作用的新用途，能够用于制备抗晶状体浑浊产品， 以克服现有技术存在的上述缺陷。
也就是说，本发明针对现有技术的不足，通过实验研究和理论探索，目的意在2-巯基-3- 丁醇的用途，即提供含有上述药物或其组合物作为抗晶状体浑浊产品方面的应用。
本发明所述的抗晶状体浑浊产品是指医药等技术领域中，一种直接或者间接用于预防、 诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产品；
优选直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊及其直接相关疾病的产 品，所述的晶状体混浊疾病包括各类晶状体混浊疾病中的一种或多种。
所述的抗晶状体浑浊产品是包括药物、试剂等中的一种或多种，优选药物。
一、技术构思
自主开发研发创新药物是中国目前的一项紧迫任务，中国医药学具有悠久的历史，在预 防和治疗疾病方面也积累了丰富的经验，寻找有效的活性成分或其组合物，发现新药物、已 有药物的新组合或新用途等均是有效的快捷途径，特别是拓展现有化合物或已有药物的新用 途更是高效、快捷、经济的手段，也是中国创新药物研制的优势之所在。
晶状体浑浊的防治是近年来的一个研究热点，然而有关白内障的病因学研究，尚远远滞后 于临床需要。在白内障疾病的病因学研究方面，特别是以往在有关晶体蛋白受不同外界因素影 响的研究方面，对晶体蛋白发生质和量的改变，大多不作细分，如宏观描述β晶体蛋白。但是， 发明人认为，晶体蛋白随老化进程，不同组分应该有不同的表达趋势、消长规律不一，不细分 落实到具体蛋白，则难以定向研究各自晶体蛋白的特性。
晶状体的老化是一种不可避免的自然生理进程，即随着年龄的增长，晶状体逐渐老化。但 是，发明人仍然可以通过探讨老年性白内障的形成机理，采用合理的控制方法或治疗手段，延 缓晶状体的老化进程。但是，晶状体浑浊的机制复杂，是多种因素相互、共同作用的结果，而 单一机制的研究往往不能达到满意的效果，因此多种机制的、多药物联合运用的综合性研究有 待进一步开展。
氧化应激是由活性氧(简称：ROS)诱导的一种与老化密切相关的损伤类型，与老年 性白内障的形成有关，被认为是白内障的始发因素。晶状体产生的主要活性氧分子包括超 氧负离子、羟自由基和H2O2；内源性产生的活性氧的结构包括NADPH氧化酶，线粒体和过 氧化物酶体，两种主要产生内源性活性氧的途径是紫外线和离子辐射。晶状体中通过这些 途径产生的ROS分子可以经由抗氧化剂和氧化防御系统中和，因此晶状体中具备这两大修 复系统来重塑损伤分子或者减轻损伤程度。硫醇转移酶(thioltransferase，简称：TTase)、 硫氧还蛋白(thioredoxin，简称：Trx)和硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，简称： TR)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，简称：GR)系统被认为是哺乳动物组织中 强有力的蛋白修复系统。近年的研究显示TTase/GR和Trx/TR均存在于晶状体中，对保持 晶状体的透明性有重要的作用。
近年来β晶体蛋白成为研究热点，发明人前期研究表明了它对维持晶状体的透明性和屈 光度有一定的作用。晶体蛋白中均含有一定数量的半胱氨酸(Cys，αB除外)，尤其是β、γ 类含量较高，Cys含一游离的巯基(-SH)，对于氧化极为敏感；巯基经氧化作用形成二硫键 混合物，是晶体蛋白去折叠、聚集增强的主要动因。由此产生一对矛盾：氧化应激会使巯 基氧化，而为了保持晶状体的透光性，晶体蛋白必须维持足够量的还原状态的巯基(-SH)。
晶体蛋白的翻译后修饰(简称：PTM)是白内障发病的主要诱因。晶状体是一种结构 极为特殊的器官：透明、缺乏血供，晶体蛋白缺乏转化更新、形成后即伴随终生。使晶体 蛋白遭受PTM的可能性远较其它类蛋白大。PTM对晶体蛋白的主要影响是：极易引发晶体 蛋白去折叠、改变蛋白原有构象；二硫键形成、晶体蛋白之间非特异交联，蛋白水溶性下 降；聚集增强形成高分子量物质(High molecular weight，简称：HMW)，当HMW聚集达 到1×107Da以上时，即可发生光散射，晶体失去透明性、发生白内障。
那么如何保持晶体蛋白中-SH未被氧化交联为二硫键，进而阻断后续蛋白分子交联、聚 集、沉淀，对维持晶体透光性及防治老年性白内障起着关键的作用。
发明人前期的研究成果表明了二硫苏糖醇(dithiothreitol，简称：DTT，分子式为 C4H10O2S2)具有良好的抗晶状体蛋白变性的作用，DTT是一类化学性质的还原剂，它可以 解开蛋白质分子内部及蛋白质分子间的二硫键，作为巯基的保护剂，能够抑制晶状体蛋白 的热变性及非特异性聚集沉淀。发明人前期研究显示出在用自行配制的DTT滴眼液第8天后 能使硒性白内障小鼠模型晶状体混浊的程度减轻。而且发明人研究也显示出DTT对紫外线 性白内障大鼠模型具有良好的抑制作用。DTT不仅可以防止蛋白质分子间形成二硫键，并 且可以和蛋白质竞争性结合-SH，因此在预防和治疗方面都发挥了一定的作用。前期实验也 初步验证了异丙醇对晶体蛋白巯基的保护作用，通过封闭部分巯基，抑制了二硫化合物的 形成。
能够对蛋白质的巯基进行保护的试剂有很多，发明人筛选出了一些化合物，例如叔丁 醇(Tert-butyl alcohol，简称：TAB)、2-SH-3-丁醇、N-对甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮 (N-tosyl-L-phenylalanyl-chloromethyl ketone，简称：CPTK)、甲苯磺胺氯甲基酮等等，其 中叔丁醇对硒性白内障的治疗作用也得到了发明人初步的证实。
本发明研究已经证实2-巯基-3-丁醇能够抑制细胞的凋亡以及抗炎等作用对脑缺血有一 定的治疗效果并初步应用于临床。基于前期实验结果，发明人首先将离体培养晶状体并模 拟氧化应激的环境，加入2-巯基-3-丁醇干预后，观察2-巯基-3-丁醇对晶状体混浊程度的抑 制作用，检测其中酶含量的变化，观察细胞凋亡的情况，研究2-巯基-3-丁醇抗氧化损伤的 效果，研究其机制。
发明人通过对晶体蛋白进行系统的抗浑浊实验，推断2-巯基-3-丁醇在防治晶状体浑浊等 方面的药效，应主要是通过封闭晶体蛋白本身部分非必需的巯基、抑制蛋白之间通过形成二 硫键而导致非特异性聚集、进而实现遏制大分子晶体蛋白形成之通路来发挥抗蛋白浑浊作用 的，研究结果也证明和证实了2-巯基-3-丁醇具有显著的抗晶状体浑浊的药理作用。
总之，发明人的实验发现了此化合物具有良好的抗晶状体浑浊作用，为白内障药物防治 的临床前期研究提供可靠的理论实验依据，而且这将对于其它年龄相关性眼部疾病的防治也 有重要的参考价值。
根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的 研究结果和应用产品。
二、确定2-巯基-3-丁醇能够用于制备抗晶状体浑浊产品的理论设想与研究基础
1、概述
晶状体具有独特的代谢方式，其中央无显著的蛋白质合成、氧浓度极低、长期遭受环境 和眼内各种应激的刺激，给蛋白质翻译后修饰带来了机会，因此晶状体蛋白是研究人体老化 极好的器官。白内障的形成是晶状体老化的最终结果。晶状体是富含蛋白质的组织，晶状体 蛋白约占整个晶状体湿重的34％，透明性是由于这些蛋白质短程有序的排列方式，特别是α 晶状体蛋白，随着年龄老化，或者是遭受氧化应激，晶体蛋白短程有序的排列方式，特别是 α晶状体蛋白，随着年龄老化，或者是遭受氧化应激，晶状体蛋白的结构排列方式发生变化 时，均可影响晶状体的正常功能。
晶状体蛋白的各种翻译后修饰(post translational modification，简称：PTM)包括βB1、 βB2和βA3/βA1晶状体蛋白N端的切除，α晶状体蛋白部分磷酸化和C-末端降解；αA和γs晶 状体蛋白的脱酰胺，αA晶状体蛋白内双硫键形成和γs晶状体蛋白巯基暴露等可导致不同程 度的α晶状体蛋白分子伴侣活性的下降，β晶状体蛋白的溶解性降低。所以如何有效的修复 或清除受损的晶状体蛋白质，防止其在晶状体内聚合沉淀，对维持晶状体的透明性及防治老 年性白内障起着关键作用。
2-巯基-3-丁醇能够调节生物体内许多重要的生命过程，例如抗氧化、参与并影响蛋白质 的折叠等。发明人前期的实验结果显示了二硫苏糖醇(dithiothreitol，简称：DTT)和叔丁醇 (Tert-butyl alcohol，简称：TAB)以及异丙醇对晶状体混浊都有一定的抑制作用，2-巯基-3- 丁醇化学结构中的巯基活性强，可以保护晶体蛋白的巯基免受氧化损伤，发挥与DTT类似的 作用：减少蛋白之间非特异性聚集变性的可能性，阻止蛋白高分子聚合物的形成，进而阻止 其蛋白由水溶性变为水不溶性，具有良好的抑制晶状体蛋白中的含巯基蛋白的抗氧化作用。
本研究通过对2-巯基-3-丁醇和晶状体蛋白氧化损伤之间关系的研究，不但能够使发明 人理解2-巯基-3-丁醇的抗晶状体损伤混浊的作用，还将为白内障以及其他年龄相关性眼部 疾病的防治提供新的思路。并且对进一步探索2-巯基-3-丁醇的抗晶状体氧化损伤的分子生 物学机制提供实验依据。
综上所述，本发明从该靶蛋白的生物化学结构特征着手，着重研究了物理、化学等因素诱 导晶体蛋白变性的机理；并据此研制抗靶蛋白变性的化合物，此化合物可作为能够保护晶体蛋 白不受或少受促变异影响的外用药物；该化合物能够采用脂质体作为晶体角膜的导入体；并先 期用于硒(亚硒酸钠Na2SeO3)诱导的SD大鼠白内障模型，模拟老年性白内障的病理变化， 裂隙灯每日观察、记录晶体透光性改变进程，观察疗效；进而探讨临床应用的前景，期望该化 合物能够对于延缓和治疗老年性白内障，尤其针对大部分初发期的老年性白内障治疗产生积极 影响。
2、实验研究的基本情况
本发明基于对晶状体混浊发病机制的深入了解为起点，设计、筛选合适的抗晶状体混浊 的新型药物，并验证其作用效果，进而探讨药物的作用机制。本发明的实验研究主要包括以 下部分内容：
2-巯基-3-丁醇对晶状体氧化应激下混浊程度和热稳定性的影响
本发明第一部分的研究内容在于开发临床现有的药物2-巯基-3-丁醇的临床新用途。探讨 2-巯基-3-丁醇在培养的大鼠离体晶状体中抵抗氧化应激的能力及对晶状体蛋白热稳定性的 影响。
2-巯基-3-丁醇是已知的用于合成香精的原料。本实验巧妙利用该化合物的特殊结构特点， 挖掘新用途，探讨该药物对于晶状体混浊的干预作用。该研究内容是发明人率先尝试的。
首先，发明人通过离体培养大鼠晶状体并模拟体内氧化应激损伤的环境，在不同时间点 加入不同剂量的2-巯基-3-丁醇进行干预。
方法：取完整晶状体用H2O2诱导其氧化损伤，分别在不同的时间点观察完整晶状体在氧 化损伤组和用2-巯基-3-丁醇干预组的混浊程度，检测不同组的晶状体蛋白的热稳定性的变 化。
结果：未加入2-巯基-3-丁醇仅用H2O2诱导氧化损伤的晶体混浊程度高于2-巯基-3-丁醇用 药组；晶状体蛋白吸光度值在用2-巯基-3-丁醇药物组低于氧化损伤组且上升速度缓慢。
结果观察到2-巯基-3-丁醇能够有效的延缓晶状体受到氧化损伤时的混浊发展程度，并且 有助于提高晶状体蛋白的热稳定性。这是本发明的一个创新点，而且为白内障药物防治的临 床转化，提供了新思路和实验依据。
结论：2-巯基-3-丁醇能够在一定程度上减轻晶状体氧化应激状态下混浊程度的发生并稳 定晶状体蛋白。
三、2-巯基-3-丁醇的用途
1、概述
本发明研究涉及到的药物作用机制与封闭晶体蛋白部分巯基、抑制蛋白间非特异性聚集 有关，并进行了进一步的动物实验研究与理论探索。
发明人经过研究的最新发现是：发明人以晶状体浑浊为研究重点，详细阐述了对蛋白质 的巯基进行保护的积极作用。如采用2-巯基-3-丁醇干预晶状体，减缓晶状体因受氧化应激作 用而浑浊，即明确了2-巯基-3-丁醇的抗氧化应激作用。
虽然还有很多问题有待解释和解决，但是发明人的实验为2-巯基-3-丁醇防治白内障的作 用机制提供了实验依据，对下一步药物开发以及运用于临床前期的治疗方案提供了崭新思路。
也就是说，2-巯基-3-丁醇或其组合物能够用于制备抗晶状体浑浊产品，可用于所涉及晶 状体浑浊的防护、治疗等应用，最优选的是抗晶状体浑浊药物。
经实验研究表明，2-巯基-3-丁醇体外能够显著延缓晶状体浑浊相关疾病的发展。已完成的 急性毒性实验证明，小鼠腹腔注射给药对2-巯基-3-丁醇的最大耐受量超过2mg/kg，相当于临 床推荐用药剂量的40倍以上，表明该有效部位安全可靠，解决了该类药物剂量使用禁忌上的 问题。
综上所述，发明人对抗晶状体浑浊产品进行了理论探索，经过大量的实验研究包括长期 的药理学试验，发现所述及的2-巯基-3-丁醇有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研 究抗晶状体浑浊的活性，为研制抗晶状体浑浊产品尤其是抗晶状体浑浊药物提供了新的来源， 为进一步开发利用中国现有药物提供了科学依据。
因此，2-巯基-3-丁醇或其组合物尤其是药物组合物可用于制备抗晶状体浑浊产品，优 选以本发明2-巯基-3-丁醇为原料制备而成的抗晶状体浑浊药物。
2、2-巯基-3-丁醇的使用方法与要求
本发明2-巯基-3-丁醇可以单独或进一步与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于预 防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品，包括药物或试剂等，尤其是药物。
在具体使用方面，本发明所述的2-巯基-3-丁醇能够单独直接使用，还能够与其他许多化 学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功 能如协同放大作用、拮抗或缓解2-巯基-3-丁醇的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可 接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可 接受的载体等中的一种或多种。
本文使用的“医药学上可接受的载体”包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、 胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的 例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一 种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、 山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物 质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了2-巯基-3-丁醇的 有效期或效力。
从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包 括润滑剂，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素、羧 甲基纤维素钠或低取代羟丙纤维素等中的一种或多种；填充剂，如淀粉、糊精或乳糖等中的 一种或多种；粘合剂，如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚 乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、 山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种； 溶剂，如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等；抗氧剂和络合剂，如亚硫酸钠、 EDTA等中的一种或多种；表面活性剂，如季铵化合物、十六烷醇等；吸附载体，如高岭土 或皂粘土等中的一种或多种；高分子骨架剂，如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或 多种；稀释剂如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖和大豆油等中的一种或多种； 稳定剂如羧甲基纤维素钠或环糊精等中的一种或多种；防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或苯甲酸 钠等中的一种或多种。另外，还可以在2-巯基-3-丁醇中加入其他辅助剂，如香味剂和/或甜味 剂如蔗糖、果糖和天冬甜素等中的一种或多种。
例如，将2-巯基-3-丁醇溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐 水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽 油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有增溶剂 (例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚维酮、环糊精、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲 醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、 D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如稳定 剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，盐酸普鲁卡因或利多卡因等中的一种或多种) 等。
本发明所述及的2-巯基-3-丁醇还可以联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物 尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动 物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河 猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种，进一步优 选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明2-巯基-3-丁醇加入适于给与受治疗 者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明2-巯基-3-丁醇和药学上可接受的载体。
2-巯基-3-丁醇的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固 体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的2-巯基-3-丁醇为活 性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。
本发明所述的2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物能够可以采用本领域公知的常规 生产方法制成任何一种适合于实验、研究或临床上应用的剂型，包括固体制剂如胶囊、片剂、 颗粒制剂等，液体制剂如口服液或者注射剂等。
例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片 剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口 服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等 中的一种或多种给药途径进行抗晶状体浑浊的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。
2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以 将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通 过将所需量的2-巯基-3-丁醇与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行 除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将2-巯基-3-丁醇加入含有基本分散介质和所需的 上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐 的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通 过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。
该组合物中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐或明胶，以达到注射组合物的延长 吸收；可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯，以达到口服组合物的延长 释放。
用于患者时，本发明所述的2-巯基-3-丁醇剂量为0.15～1.5mg/kg·d，可以分一次或多次 使用，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来 决定。
本发明2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效 量”的本发明2-巯基-3-丁醇。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗 效果的量。2-巯基-3-丁醇的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及2- 巯基-3-丁醇在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指2-巯基-3-丁醇的有 益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。
“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用 于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明2-巯基-3-丁醇的 治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是0.15～1.5mg/kg，更优选为0.2～0.8mg/kg。应注意， 剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的2-巯基 -3-丁醇剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来 决定。
另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所 述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不 会限制要求保护的组合物的范围或实践。
也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明2-巯基 -3-丁醇的每次和/或每日的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人(如体重 60kg)，所述2-巯基-3-丁醇的单剂量约为1.5～5mg，优选约2.5mg，优选每日给药1次。可以 调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如，治疗或预防应答)。
例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切 性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有 利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单 位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物2-巯基 -3-丁醇。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)2-巯基-3-丁醇的 独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性2-巯基-3- 丁醇的技术中的内在限制。
3、2-巯基-3-丁醇的药物剂型和给药途径
本发明所述的2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物制备的用于预防、诊断、检测、 保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品，其中按照试剂技术领域的要求制备的产品能够用于诊 断、检测、研究抗晶状体浑浊；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗、 诊断、预防或研究，既能够单独直接用于制备治疗、预防或研究的药物，也能够与许多化学 物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗、预防或研究的药物。这里所述的化学物质 与本节上文中所述的相同。
在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际 情况和需要，采用试剂级或药用级的物料。
本发明所述的2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物，可以用本领域已知的各种方法 给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是，技术人 员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与 保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如控释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传 递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚 合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多 种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，纽约， 1978)。
本发明所述的2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物中，可以含有本领域公知的医药 学上可接受的载体和其它任选成分。载体包括羧甲基淀粉、淀粉、纤维素、明胶、碳酸氢钠、 丙二醇或吐温80等。任选成分例如是着色剂、甜味剂、抗氧剂等。
本发明所述的2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物，通常通过口服、直肠或肠胃外 给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。
本发明所述的2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物可以制成任何一种适合于临床 上应用的剂型，包括固体制剂，如胶囊、片剂、颗粒制剂等，半固体制剂如软膏等，液体制 剂如口服液、混悬剂、乳剂等，或者注射剂。采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、 肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗晶状体 浑浊的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。
用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。 在实施时，本发明2-巯基-3-丁醇可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。2-巯 基-3-丁醇(和其它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入 受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述2-巯基-3-丁醇与赋形剂一起加入并以可 食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。
为了以非肠道给药之外给予本发明2-巯基-3-丁醇，可能需要用防止其失活的材料对2- 巯基-3-丁醇包衣或与2-巯基-3-丁醇一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。 在具体实施时，将本发明2-巯基-3-丁醇与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配 制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可 能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。
制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆、酊剂或酏剂 等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等 中的一种或多种。
以上药物或药物组合物能够使用各种途径，在所述的使用形式中，优选的形式是口服制 剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种)、非肠道给予剂型(如注射 剂、软膏或贴剂等中的一种或多种)等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等 中的一种或多种，特别优选片剂或注射剂中的一种。
综上所述，本发明2-巯基-3-丁醇的组合物尤其是药物组合物可用于预防、诊断、检测、 保护、治疗和研究抗晶状体浑浊产品，优选药物和食品，进一步优选药物。
四、技术特长
本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊提供了一种新的药物来源 和应用剂型，从而对现有的抗晶状体浑浊产品系统特别是药物进行了改进、改善和提高，从 而拓展了现有药物的应用。
本发明安全有效，实用性较强，价廉，方便快捷，其制备工艺简便、容易操作，使用简 便、疗效显著，可用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究各类晶状体浑浊的治疗和预防。
本发明有针对性地研究晶状体浑浊，发现了一种新的抗晶状体浑浊产品，作出了意想不到 的成绩；同时，本发明也有针对性地研究2-巯基-3-丁醇的活性，其药理作用较强，使用安全， 最大限度地发挥了作用。本发明对2-巯基-3-丁醇拓展了新的医药用途，也为预防、诊断、检 测、保护、治疗和研究抗晶状体浑浊提供了一种新的药物来源。
2-巯基-3-丁醇用于治疗晶状体浑浊，可明显改善晶状体浑浊引起的细胞凋亡，治疗效果 显著，且毒副作用小，克服了现有的常用药物造成的副作用。本发明挖掘了2-巯基-3-丁醇新 的医药用途，也为防治晶状体浑浊提供了一种新的药物干预手段。
本发明2-巯基-3-丁醇药理作用较强，效果明显，其原料来源丰富、价廉，性质稳定，制 备工艺简单，质量控制简便，更适于医药、试剂等工业和行业的大规模生产和商业应用；使用 范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，为研究开 发新的抗晶状体浑浊产品提供了新的药物和制剂来源，对开发利用中国现有药物具有重要价 值，是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究晶状体浑浊等方面的安全原料，对改进和提 高现有的医疗水平具有重要价值。
附图说明
图1：未加药组和加入2-巯基-3-丁醇药物的SD大鼠晶状体离体培养，均用H2O2诱导氧 化损伤。同一时间未加药大鼠晶状体混浊程度高于2-巯基-3-丁醇组大鼠；
A、D分别为未加药和2-巯基-3-丁醇大鼠晶状体培养组0hr，B、C分别代表未加药组大 鼠晶状体离体培养6、12hr，E、F分别代表2-巯基-3-丁醇组大鼠晶状体离体培养6、12hr；
图2：BCA标准曲线图；
图3：氧化应激和2-巯基-3-丁醇组大鼠晶体蛋白热变性。
具体实施方式
本发明研究了现有的晶状体浑浊技术，提供了一种新的抗晶状体浑浊产品的配方的新用 途，便于医疗、试剂等行业的安全使用。
本发明最终需要制备成抗晶状体浑浊产品进行应用，下面将列举实施例进行进一步说明。 如有问题，可以与发明人直接联系13386272938。上述提供的一些实验数据以及下列实施例 中按前述发明内容给出几种配方及其使用方法及一些试验研究内容，但应该理解本发明并不 仅限于此处所列出的研究内容，还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而 并不是对本发明的限定。
下面以2-巯基3-丁醇对晶状体氧化应激混浊程度和热稳定性影响的部分具体实验研究 内容为例，进一步阐述本发明2-巯基-3-丁醇的新用途。
1、概述
白内障是我国的第一位致盲疾病，严重影响了我国人民的健康。白内障发生的关键因 素是晶状体发生混浊，从而影响了光线经过屈光介质透射、汇聚到视网膜，最终造成视物 不清晰。老年性白内障是年龄相关性的疾病，也是老年人视力下降及致盲的主要原因，究 其原因就在于晶状体在老化过程中出现的变性混浊。随着我国人口的逐渐老龄化趋势，其 患病人数还会继续增加。国外的研究资料表明(Bloemendal H，Jong W，Jaenicke R，Lubsen N H，Slingsby C，Tardieu A.Progress on the function and structure of serine protease inhibitor[J]. Prog Biophys Mol Biol，2004，86：407-485.)，75岁以上的人群中老年性白内障患病率高达 88％。众所皆知氧化应激(oxidative stress)在老年性白内障的发病过程中发挥了重要作用， 氧化应激与晶状体混浊以及晶状体蛋白遭受应激损伤的翻译后修饰(post translational modification，简称：PTM)密切相关(Quillen DA.Common causes of vision loss in elderly patients[J].Am Fam Physician，1999，60(1)：99-108.和Sun W R，Zhang X H，Zhang S J，Zhou Z Y.Oxidative damage and enzyme histochemistry changes in senile cataract[J].US Chin J Ophthalmol，2000，1：1-3.)。人眼的晶状体是一个比较特殊的器官，它的赤道部的晶状体上 皮细胞(lens epithelial cells，简称：LECs)不断分化形成新的晶状体纤维，并且逐步向晶 状体的核区移动，在这一迁移过程中，纤维细胞的细胞核以及细胞器都不断地退化进而消 失，仅仅残留下透明的细胞质，从而形成了几乎不存在蛋白质的更新的核性区域。随着时 间的累积，晶状体组织的硬度明显的增加，有研究表明(Heys KR Cram SL，Truscott RJ. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age：the basis for presbyopia？[J]. Mol Vis，2004，10：956-963.)，人到中年大概有50％原本可溶性的蛋白质会变性成为不溶性蛋 白，因此使得晶状体的硬度增加，透明性也明显降低。
随着人类年龄的增长，自然老化是一项不可避免的生理过程，人们无法完全地阻止老 化进程对于晶状体正常功能的负面影响，但是发明人可以通过采取一些防护措施，延缓或 者一定程度地抑制晶状体的老化。对于老年性白内障，如果能够尽早采用有助于预防晶状 体混浊的外用药物，提早打下预防基础，努力维持晶状体的透明度，尽量减轻老年性白内 障的发生程度，将对老年性白内障患者是一大福音。迄今为止白内障传统的治疗方法仍旧 是通过外科手术摘除混浊的晶状体，虽然技术成熟依然有一定的创伤性；另外常规眼液白 内停、卡林优(吡诺克辛钠滴眼液)等传统治疗白内障药物的临床应用效果也并不是十分 明显。因此，探寻老年性白内障的发生机制，进一步为寻找新型的抗白内障药物成为发明 人亟待关注的重点。
本部分研究的构思是期望通过采用TC-199培养液(成分与晶状体在体内中的离子成分、 PH值等相近)离体培养大鼠晶状体的方法，外加入H2O2刺激造成氧化应激的模型，由此来 模拟体内环境中晶状体随着年龄的增长不断遭受外界氧化损伤以及逐渐老化的条件，并同时 通过药物2-巯基-3-丁醇进行干预性调节，从而对比观察干预后2-巯基-3-丁醇是否能对晶状体 混浊程度具有一定的延缓或者抑制的作用，并采用热诱导晶状体蛋白变性的方法检测分析不 同处理组的晶状体蛋白受热后其稳定性的改变，以此初步明确2-巯基-3-丁醇对于晶状体在氧 化应激状态下的保护作用。
2、材料与方法
(1)实验动物：大鼠
(2)主要仪器及耗材：显微手术器械、微镜、移液器、滤纸、相机、天平、离心机、水 浴箱、超纯水装置、干燥箱、消毒箱、制冰机、旋涡混合器、冰箱、PH调节仪；
(3)主要试剂：培养液、GO、H2O2、2-巯基-3-丁醇、水合氯醛、蛋白浓度测定试剂盒；
(4)实验方法：
①晶状体离体培养
A、动物晶状体准备：取大鼠，采用水合氯醛腹腔麻醉后处死，酒精擦拭双眼睑周围， 取出眼球，放入PBS中清洗血液，漂洗后置于超净台无菌条件下用显微剪刀在角巩膜缘偏后 剪开，娩出晶状体。
B、方法：取出完整的晶状体放入PBS中，将周围残存的玻璃体小心剥离，再将漂洗过 的晶状体在滤纸上吸干表面水分及多余杂质，之后将晶状体放入培养液中，浸泡后移入培 养板，加入培养液，放入培养箱，然后加入H2O2和GO；实验组再加入2-巯基-3-丁醇，对 照组仅加培养液。
C、分组：H2O2氧化应激与另外加入2-巯基-3-丁醇治疗组分别为对照组和实验组。
②体外诱导晶状体蛋白热变性
A、测定前准备：取仅加入H2O2氧化应激的大鼠晶状体和加入2-巯基-3-丁醇治疗组晶状 体，分别移入匀浆管中，加入蛋白裂解液，置于冰盒上使用匀浆器匀浆，离心，取上清液稀 释后测定蛋白浓度，并将两组大鼠晶状体蛋白上清液调至同一浓度。
B、方法：将浓度水平一致的晶状体蛋白均浆液移入比色杯，水浴箱预热，样品首先测 定起始吸光度值，双蒸水做参照，加热后，定时测定吸光度值，用双蒸水做参照。
(5)统计与分析
所有数据用均数±标准差表示，应用统计软件进行t检验，p＜0.01表示统计学差异 非常显著，p＜0.05表示统计学差异显著，p＞0.05表示无统计学差异。
3、实验结果
(1)晶状体离体培养
晶状体在培养液中离体培养，观察到经H2O2诱导氧化损伤的晶状体及2-巯基-3-丁醇对 照组晶状体均无明显改变；之后，随着时间的延长，H2O2诱导损伤组晶状体出现逐渐加重的 混浊，从开始的前或后皮质混浊发展到全皮质甚至全晶状体混浊，同一时间里加入2-巯基-3- 丁醇的大鼠晶状体混浊程度均低于于未加药组大鼠。
(2)体外诱导晶状体蛋白热变性
①BCA法测定蛋白浓度：根据蛋白标准品，测定吸光度，绘制标准曲线(注：公式中 R2值越接近1越好)。
②热稳定性测定：H2O2诱导氧化损伤的晶状体混合蛋白的上清液混浊程度增加较快，抗 氧化损伤能力下降；H2O2诱导氧化损伤的同时加入了2-巯基-3-丁醇的晶状体混合蛋白上清液 经水浴后逐渐变混浊，程度缓慢加重。
4、讨论与结论
氧化应激和热诱导变性是白内障发病的诱发因素。氧化应激(Oxidation Stress，简称： OS)是美国RS.Sohal于1990年首次提出的一种病理生理性质的概念。氧化应激在各种类型的 白内障的发病过程中都扮演着重要的角色。氧化应激的损伤可以使得晶状体中产生一些氧自 由基(Reactive Oxygen Species，简称：ROS)、活性氮自由基(Reactive Ntrogen Species，简 称：RNS)，这些均能够损伤晶状体细胞中的蛋白质、脂质以及核酸，诱发晶状体混浊变性。 当细胞处于较高的温度下，细胞膜就会产生一些单层膜状的结构，从而破坏了细胞膜整体性 和通透性(Dowhan W.Molecular basis for membrane phospholipid diversity：why are there so many lipids？[J].Annu Rev Biochem，1997，66：199-232.)。晶状体蛋白受热性质改变，形成不溶 性蛋白，可以发生凝集沉淀反应，使得晶状体失去其透明性，混浊发生。Heys KR等(Zhen-Yu H，Rong Z，Pei-Hong S，Bo W，Cheng-Jian J.Progress on the function and structure of serine protease inhibitor[J].Genomics and Applied Biology，2011，30(45)：1290-1298.)的研究表明，把 完整的晶状体置于50℃温和的热应激下，用来模拟晶状体在人体35℃体温内环境中发生的年 龄相关改变，该模型中晶状体内部也会出现细胞内可溶性晶状体蛋白含量的下降，蛋白高分 子形式(High molecular weight，简称：HMW)，HMW的形成并最终凝集沉淀以及晶状体的 硬度增加等类似于年龄相关性的晶状体的改变。因此发明人通过氧化应激和热诱导变性的方 法可以检测2-巯基-3-丁醇对于SD大鼠晶状体混浊程度的影响以及对蛋白稳定性的作用，从而 得知2-巯基-3-丁醇对于晶状体遭受损伤时是否具有一定的保护作用。
根据第一部分发明人的实验结果提示了2-巯基-3-丁醇不仅有助于保护大鼠晶状体蛋白免 于氧化应激状态下的混浊程度的进展，而且对晶状体蛋白受热变性具有一定的抵抗能力。在离 体培养的晶状体收到外界H2O2的氧化应激的损伤时，2-巯基-3-丁醇表现出对晶状体遭受外界 氧化损伤时混浊的保护效应，可以观察在前3个小时的大鼠晶状体离体培养中，H2O2氧化损 伤组和2-巯基-3-丁醇干预组未见到明显的变化，之后连续的6个小时中，可以明显看到加入 了2-巯基-3-丁醇干预组的晶状体较之H2O2氧化损伤组的混浊程度大大减轻。但是12个小时 之后，晶状体开始出现核性的完全性混浊，即使2-巯基-3-丁醇也无法减缓或逆转混浊程度的 发生。因此根据本实验的结果可以看出2-巯基-3-丁醇对于处于氧化应激状态下的晶状体是具 有一定的防护作用的。
H2O2是氧化应激的一种方式，除了能够引起自由基的增多，蛋白质结构和空间构象的 变化外，还能激活晶状体上皮细胞的氧化敏感性转录因子NF-κB，从而导致基因表达异常， 最终导致白内障。这只是H2O2损伤的一个机制，2-巯基-3-丁醇是通过哪种机制来保护晶状 体在氧化应激下的损伤的，还需要发明人进一步的探讨。而对于在白内障发生过程中具有重 要作用的晶状体蛋白来说，其热稳定性的提高也是延缓白内障发生的原因之一，在这部分实 验中发明人可以看出，2-巯基-3-丁醇对于晶状体蛋白受到外来的氧化损伤时的蛋白稳定性具 有一定的抵抗作用，较之未加入2-巯基-3-丁醇的大鼠晶状体，能够提高晶状体蛋白的稳定 结构，提高抗损伤的能力。
众所周知，白内障形成时，晶状体核变为暗黄色乃至褐色，van Heyningen于1971年首 次报道晶状体含有荧光色素物(葡萄糖方苷)(YAN Hong，HU I Yan-Nian.Ageing lens and development of tataract[J].Fourth Mil Med Univ，2005，26(2)：97-100.)。晶状体纤维细胞中有从色 氨酸氧化产物衍变来的犬尿氨酸(Kyn)，其中主要包括3-羟基犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸葡 萄糖方苷和4-(2-氨基-3-羟苯基)-4-氧丁酸O-L-D-葡萄糖方苷。晶状体中这些物质的氧化增 加了晶状体蛋白的凝聚、色素沉着和非色氨酸荧光物质的增加，上述改变与晶状体混浊密切 相关。犬尿氨酸可能与谷胱甘肽或亲核氨基酸(如半胱氨酸)形成3-羟基谷胱甘肽犬尿氨酸 葡萄糖方苷加合物。Gamer等(Gamer B，Roberg K，Q ian M，et al.Distribution of ferritin and redox-actinve transition metals in normal and cataractous human lenses[J].Exp Eye Res，2000， 71(6)：599-604.)发现牛晶状体蛋白可被犬尿氨酸修饰产生有色(在365nm吸收)和荧光(激 发380nm，发射450～490nm)的蛋白质加合物。这些加合物凝聚增加了光散射，降低了晶状 体的透明性。氧化损伤引起自由基的升高不仅可以导致脂质过氧化而产生白内障，还可以提 高晶状体中3-羟基犬尿氨酸的浓度。发明人前期实验对抗白内障药物卡优林的研究表明了它 是通过这种代谢组氨酸、色氨酸等生色基团来发挥作用的。
如果阻止晶状体蛋白交联、聚集成高分子量物质，那么便可抑制受损蛋白之间的偶联沉 淀和由此产生的晶状体混浊。因而发明人提出一种假设：使用烷基(甲基、乙基等)替代受 损晶状体蛋白中暴露的-SH中的H达到封闭巯基的作用，就可以阻止晶状体蛋白聚集、抑制 晶状体混浊。晶状体蛋白大多含有一定数量的巯基且在晶状体中浓度极高，可达晶体湿重的 35％；晶体的核区蛋白含量更高达50％(Simpanya MF，Ansari RR，Suh KI.Aggregation of lens crystallins in an in vivo hyperbaric oxygen guinea pig model of nuclear cataract：Dynamic light-scattering and HPLC analysis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(12)：4641-4651.)。因 此，晶体中含游离巯基的蛋白较多。通过控制烷基化试剂的浓度及活性、部分封闭巯基，使 晶体蛋白不再发生或少发生二硫化物交联，应可阻止或降低蛋白聚集、保持晶体透光性。发 明人有个大胆的猜测2-巯基-3-丁醇可能通过以下途径发挥抗氧化损伤的作用：2-巯基-3-丁醇 以不断的牺牲自我的结构成分来保持晶状体的透光性。
在白内障的发生过程中，蛋白质的聚集和沉淀是晶状体混浊的一个原因。在晶状体蛋白 中，α晶状体蛋白和β晶状体蛋白都对蛋白裂解酶的降解敏感，α晶状体蛋白亲水的C端，β 晶状体蛋白大部分的N端都可以被蛋白裂解酶降解，而这些亲水性末端对晶状体蛋白的水溶 性起着重要的作用。γ晶状体蛋白相对比较稳定，最初它被认为是晶状体内的一种结构蛋白， 比较不容易受到蛋白裂解酶的降解。三种晶状体蛋白中都含有一定数量的半胱氨酸(Cysteine， Cys)，Cys中的游离巯基(-SH)极其容易遭受氧化损伤(Lou MF.Redox regulation in the lens [J].Progress in Retinal and Eye Research，2003，22(5)：657-682.)进一步聚集形成二硫键，引起蛋 白的变性沉淀，晶状体混浊的产生。英国牛津大学眼科的最新研究成果显示α晶体蛋白和含 巯基的还原剂共同作用，可使人白内障晶状体中活性已丧失的酶“起死回生”(Schey KL， Little M，Fowler JG.Characterization of human lens major intrinsic protein structure[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41(1)：175-183.)。α晶状体蛋白和硫甲丙脯酸使谷胱甘肽还原酶活 性“回升”79％，α晶状体蛋白和二硫苏糖醇(DTT)能使巯醇转移酶活性增加200％。这进 一步揭示了α晶体蛋白的分子伴侣活性在维持晶状体代谢中的重要性，分子伴侣可“解救” 一类由于蛋白质错误折叠累积导致的构象性疾病，首次临床应用药物性伴侣治疗构象性疾病 已取得可喜结果。α晶状体蛋白在透明性发面发挥着多功能的作用，α晶状体蛋白的特性以及 蛋白质的低聚性是维持晶状体透明状态所需的。1992年Horwitz(Horwitz J.Alpha crystallin can function as a molecular chaperone[J].Natl Acad Sci，.1992，89：10449-10453.)提出α晶状体蛋白 与年龄相关白内障的关系：α晶状体蛋白通过分子伴侣的作用纠正在老龄化拥挤的纤维细胞 中的错误折叠或受损变性的蛋白，依次来抑制变性蛋白的聚集沉淀，维持晶状体的透明。鉴 于此α晶状体蛋白的降解参与了晶状体混浊的发生，受到损伤而被蛋白酶类降解的α晶状体 蛋白片段在晶状体内聚集沉淀，最终会导致晶状体不溶性蛋白增加，透光度减低，混浊逐渐 产生。αA1-162晶状体蛋白是m-蛋白裂解酶的主要降解产物，而且研究显示出它在一般正常的 晶状体中含量极少，在糖尿病白内障的晶状体中出现(Thampi P，Hassan A，Smith JB，Abraham EC.Enhanced c-terminal truncation of αA-and αB-crystallins in diabetic lenses[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43：3265-3237.)，这也说明了它只有在遭受到氧化应激、离子辐射、 药物或者毒性刺激例如高糖状态的损伤时，才会出现并且容易聚集进而引起晶状体的混浊。
因此在研究抗晶状体蛋白聚集的新途径时发明人设想：晶状体蛋白的聚集与否主要取决 于是否形成分子内或分子间的二硫化物交联，而保持游离-SH只是阻止上述交联的可能条件， 而非必须条件。
总之，通过整个的实验结果，发明人得知2-巯基-3-丁醇能够对晶状体中的蛋白质进行调 控，在白内障的形成过程中发挥了一定的功能。白内障的发病机制极其复杂，是机体内外多 重因素对晶状体综合作用而产生的结果，晶状体在整个的生命旅程中都处于动态的分化进程， 其正常的分化状态是保持透明度的前提(Nakamura T，Pichel JG，Williams-Simons L.An apoptotic defect in lens differentiation caused by human p53 is rescued by a mutant allele[J].Pro Natl Acad Sci，1995，92(13)：6142-6146.)，分化失常则形成白内障。晶状体中含游离巯基的蛋 白较多，如果通过控制合适的巯基保护剂的浓度及活性，使晶体蛋白不再发生或少发生二硫 化物交联，应该可阻止或降低蛋白聚集、保持晶体透光性。根据上述假设，发明人设计将晶 体蛋白的巯基进行有效保护。通过补充适量的游离活性巯基，既可以抑制大量二硫化物的形 成；还可对已经形成的二硫化物聚合体进行竞争结合，促使重新打开二硫键，最终有助于维 持晶状体透光性。
2-巯基-3-丁醇及其组合物的常用药物制剂的制备方法
本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取2-巯基-3- 丁醇，加入赋形剂，加水溶解，调节pH，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥， 压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH 调节剂等中的一种或几种。每瓶含2-巯基-3-丁醇0.1～4mg。
本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取2-巯基-3-丁醇， 加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装， 压塞轧盖即可。每瓶含2-巯基-3-丁醇0.1～4mg。
本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、 丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、环糊精、抗氧 剂、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。注射剂可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂质 体、微球、微囊或其它适合于高药物浓度的有序结构，其中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬 脂酸盐、明胶、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等，以达到注 射组合物的延长吸收。每支含2-巯基-3-丁醇0.1～4mg。
本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配 制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、 pH调节剂、表面活性剂、抗氧剂、环糊精、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。每瓶 含2-巯基-3-丁醇0.1～4mg。
本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬 脂酸盐等，按常规技术制备。可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯等，以 达到口服组合物的延长释放。
在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明， 并不是用来限制发明的范围。
下面通过实施例对本发明作详细描述。
以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均是来自上述的描述或 符合上述的要求。
实施例1、2-巯基-3-丁醇对晶状体氧化应激混浊程度和热稳定性的影响
1、材料与方法
(1)实验动物
健康SD大鼠10只，雄性，6W龄，体重180g左右。由第二军医大学实验动物中心提供。 清洁级并饲养于动物中心。
(2)主要仪器及耗材
(3)主要试剂
(4)主要试剂和溶液的配制
①TC-199培养液
取一袋TC-199(9.5g/袋)，按照说明加入2.2gNaHCO3，加入双蒸水补至1L，调节PH值到 5.5。于4℃存放。用前滤过除菌。
②0.25mM的2-巯基3-丁醇溶液
2-巯基-3-丁醇分子式量为351.84。取一支100mg的2-巯基-3-丁醇粉末，溶于100ml的双蒸 水中，再加入0.1ml的TWEEN80(作为一种增溶剂，可以促进溶解2-巯基-3-丁醇的作用)，即 为2.8mmol/L(1/351.84×1000＝2.8mmol/L)的溶液。4℃存放。用前稀释10倍在超净台内滤 过除菌后使用。
③葡萄糖氧化物(glucose oxidase，GO，0.025U/μl)
取GO(含10KU)加入1ml的dd H2O，配制成10U/μl。取出10μl加入90μl的双蒸水，此时 浓度为1U/μl。用前稀释40倍，使其终浓度为0.025U/μl。-20℃保存。用前超净台内滤过除菌。 加入GO为了维持稳定的H2O2的浓度。
④H2O2(0.24mM)
H2O2的密度是1.122g/ml，分子式量为34，(1.122×30％×100/34)/0.1＝9.9mol/L，所以 一般都认为大概是10mol/L。配制成0.24mM浓度，取1μl稀释40倍左右即0.24mM的H2O2， (1×10-3×10/0.24)＝42ml。室温下存放。用前滤过除菌。
⑤10×磷酸盐缓冲液(Phosphate-Bufer-Solution，简称：PBS)
NaCL 80g
KCL 2g
Na2HPO47H2O 11.5g
KH2PO4 2.0g
用800ml的双蒸水溶解，调节pH值至7.2～7.4，定容至1000ml，4℃保存，用前10倍稀 释。
⑥晶状体蛋白裂解液
A液为0.2mol/L的Tris(MW 121.14)2.428g，加100ml双蒸水(ddH2O)；B液为0.1mol/L 的HCL(37％、1.19)0.84ml加100ml双蒸水(ddH2O)。然后将A液25ml与B液41.4ml均匀混合， 调节酸碱度至PH为7.4，此溶液即晶状体蛋白裂解液。
(5)实验方法
①晶状体离体培养
A、动物晶状体准备
健康SD大鼠10只，雄性，6W龄，体重180g左右。采用10％水合氯醛(0.6～0.7/100g)腹 腔麻醉后颈椎脱臼法处死，70％酒精擦拭双眼睑周围，取出眼球，放入PBS中清洗血液，漂洗 两次后置于超净台无菌条件下用显微剪刀在角巩膜缘偏后约0.2mm处剪开，小心于裂口处向 两边延伸，再用两把显微镊轻轻牵拉裂口两边小心娩出晶状体。
B、方法
取出完整的晶状体放入PBS中，将周围残存的玻璃体小心剥离，再将漂洗过的晶状体在 滤纸上小心来回滚动几次吸干表面水分及黏连的多余杂质，之后将晶状体放入经过滤过除菌 的TC-199培养液中，浸泡数秒后移入24孔培养板，加入600μl TC-199培养液，放入37℃、 5％CO2培养箱2小时，然后加入0.04mM的H2O2和0.025U/μl的GO，使H2O2终浓度约为 0.02mM，实验组再加入100μl的2-巯基-3-丁醇，对照组仅加培养液。
C、分组
H2O2氧化应激与另外加入2-巯基-3-丁醇治疗组分别为对照组和实验组，每组10只SD大鼠 晶状体。
②体外诱导晶状体蛋白热变性
A、测定前准备
取仅加入H2O2氧化应激的SD大鼠晶状体和加入2-巯基-3-丁醇治疗组晶状体各2只，分 别移入2ml匀浆管中，加入1.8ml蛋白裂解液，置于冰盒上使用电动匀浆器反复匀浆(注意 每隔30s左右停止匀浆并于冰盒上静置30s后继续匀浆，间断匀浆)，研磨均匀后，12,000rpm、 4℃离心20分钟，取上清液稀释后用BCA法、酶标仪540nm波长测定蛋白浓度，并将两组 大鼠晶状体蛋白上清液调至同一浓度(7.5μg/μl)。
B、方法
将浓度水平一致的晶状体蛋白均浆液移入1cm光径比色杯，体积2ml；恒温水浴箱预热 至50℃，样品首先于320nm波长处测定起始吸光度值，双蒸水做参照，加热后，每5分钟测 定一次320nm波长处的吸光度值，用双蒸水做参照。
(6)统计与分析
所有数据用均数±标准差表示，应用SPSS18.0医用统计软件进行t检验，p＜0.01表 示统计学差异非常显著，p＜0.05表示统计学差异显著，p＞0.05表示无统计学差异。
2、实验结果
(1)晶状体离体培养
晶状体在TC-199中离体培养的前三小时，观察到经H2O2诱导氧化损伤的晶状体及2-巯 基-3-丁醇对照组晶状体均无明显改变；之后，随着时间的延长，H2O2诱导损伤组晶状体出现 逐渐加重的混浊，从开始的前或后皮质混浊发展到全皮质甚至全晶状体混浊，同一时间里加 入2-巯基-3-丁醇的大鼠晶状体混浊程度均低于于未加药组大鼠(图1)。
(2)体外诱导晶状体蛋白热变性
①BCA法测定蛋白浓度
根据7个蛋白标准品(浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μg/μl)，测定540nm 处吸光度分别为0.096、0.138、0.163、0.251、0.302、0.377、0.500。绘制标准曲线，见图2 (注：公式中R2值越接近1越好)。
②热稳定性测定
在一个小时的实验中，H2O2诱导氧化损伤的晶状体混合蛋白的上清液混浊程度增加较 快，在320nm处的吸光度值上升较快，曲线陡峭，抗氧化损伤能力下降；H2O2诱导氧化损伤 的同时加入了2-巯基-3-丁醇的晶状体混合蛋白上清液经水浴后逐渐变混浊，程度缓慢加重， 在320nm处的吸光度值上升较慢，曲线斜率低(图3)。
3、结论
氧化应激和热诱导变性是白内障发病的诱发因素。