技术领域
本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的生物 制品及其制备方法。
背景技术
骨性关节炎是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节 病，发病率高，在老年人口中十分常见，60岁以上的人群中患病率可达50%， 75岁以上的人群中则达80%。骨关节炎患者的关节疼痛常使患者难以忍受，患 者发病后致残率高。现有的治疗骨关节炎的药物能在一定程度上延缓病程、改 善患者症状，缓解患者疼痛，但不能逆转病理过程，不能根治骨关节炎，且大 部分药物副作用明显。而外科手术治疗主要通过关节镜(窥镜)、开放手术或人 工关节置换，虽然能暂时缓解疼痛，但长远效果（>10年）并不理想。干细胞 等细胞治疗法是目前最有希望彻底解决骨关节炎治疗的新方法。
骨关节炎常发生软骨缺损，但软骨的自身修复能力有限，通常可以将软骨 修复作为骨关节炎治疗的最重要评价指标。近十年来，干细胞移植治疗骨关节 炎已有大量研究报道。干细胞注入骨关节炎关节后，能发挥免疫调节作用和炎 症反应调节作用，减少疼痛；分泌抗凋亡因子和抗纤维化因子抑制病情进展； 分泌TGF-β、BMP-4等因子，促进内源性干细胞软骨修复；还能分化为软骨细 胞帮助修复软骨。
目前骨关节炎的干细胞治疗研究大多采用骨髓来源的间充质干细胞，脂肪 多能细胞治疗骨关节炎也已有大量文献报道，临床前研究和临床研究显示骨髓 间充质干细胞和脂肪多能细胞都有可能改善病情，并有增加软骨含量报道，但 离完全恢复关节还有一定距离。骨髓间充质干细胞获取需穿刺骨髓，对供体造 成较大伤害，相比而言从脂肪获取多能细胞更具优势，1）取材对人体损伤小； 2）脂肪中具CFU-F形成能力的多能细胞含量高于1%，而骨髓中小于0.001%； 3）脂肪来源丰富，多能细胞的含量多；4）脂肪来源细胞增殖能力较骨髓间充 质干细胞强。因此脂肪多能细胞治疗骨关节炎更具优势。
基质血管成分含有脂肪多能细胞，并含有多种其他类型细胞，最早是采用 酶消化方法从脂肪组织获得，可经过提取纯化分离出脂肪多能细胞。基质血管 成分对骨关节炎治疗也具有治疗效果，并且基质血管成分从分离到移植仅用 2-3小时，减少移植时间，且价格便宜，直接使用还能减少细胞培养中的风险， 但是含有的脂肪多能细胞含量少。此外基质血管成分中含有表面标记为 CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞，具有较强的促进血管再生能力，而经培 养后的脂肪多能细胞CD34+表达减少或消失。目前尚未见基质血管成分或纯化 的CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞联合脂肪多能细胞用于治疗骨关节炎 的研究，而将这两者联用有可能提高血管再生能力，产生明显的改善治理的效 果。
富含血小板的血浆(PRP)能分泌多种促进软骨恢复细胞因子，但在治疗骨关 节炎领域，PRP的作用存在争议，有研究报道其对软骨修复产生负面效果。
目前，多种成分联合应用于骨关节炎治疗已有报道，然而，现有技术中， 仅仅对各有效组分进行简单叠加，而很少有对组分的选择、配比、有效成分和 杂质的含量等参数进行优化。且现有的关节内注射制品的注射体积普遍偏大， 如给人的关节注射5ml、8.5ml液态组合物，过量的液体注入关节腔会导致压 力增加，给患者造成不适。
综上所述，本领域尚缺乏一种成分优化，杂质含量少，有效成分含量高的 治疗骨关节炎的液态制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种成分优化，杂质含量少，有效成分含量高的治疗 骨关节炎的液态组合物。
本发明的第一方面，提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述组合物包括以 下组分：
a.含脂肪多能细胞组分，所述的组分中包括(a1)基质血管成分；和/或(a2) 纯化或培养扩增的脂肪多能细胞；
b.富含血小板的血浆，其中，所述血浆中白细胞的浓度为≤5×105/mL；
c.多糖；和
d.任选的药学上可接受的缓冲液。
在另一优选例中，所述组合物为液态组合物。
在另一优选例中，所述的基质血管成分含有脂肪多能细胞。
在另一优选例中，所述(a2)中的脂肪多能细胞选自下组：从基质血管成分中纯 化的脂肪多能细胞、经培养扩增的脂肪多能细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的经培养扩增的脂肪多能细胞是在无血清培养基或含 血清的培养基中进行扩增的。
在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是即时制备或冻存复苏的。
在另一优选例中，所述的含脂肪多能细胞组分含有选自下组的细胞：脂肪细 胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、肥大细胞、神经细胞、脂肪前 体细胞、淋巴细胞、血液细胞、基质细胞、巨噬细胞，或其组合。
在另一优选例中，在所述含脂肪多能细胞组分中，脂肪多能细胞含量占总细 胞量的10～100%。
在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分是自体的或同种异体的。
在另一优选例中，所述的脂肪多能细胞组分具有软骨分化潜能。
在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆选自下组：活化后的PRP，未活化 PRP液体、PRP凝胶，或其组合。
在另一优选例中，所述的基质血管成分中包括选自下组的细胞： CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞，和/或CD34+CD31+细胞。
在另一优选例中，所述的含脂肪多能细胞组分是CD45-CD235a-CD31-CD34+ 细胞，和/或CD45-CD13+CD36+CD73+细胞富集的含脂肪多能细胞组分。
在另一优选例中，所述的CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和/或 CD45-CD13+CD36+CD73+细胞富集指所述的CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和/或 CD45-CD13+CD36+CD73+细胞的含量占组分中细胞总量的15-100%。
在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，红细胞的浓度为≤5×105/mL。
在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，白细胞的浓度为≤4×105/mL。
在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，红细胞的浓度为≤4×105/mL。
在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，血小板浓度范围为0.5×106-1.5 ×1010/mL，且所述血浆中白细胞和红细胞的总浓度为≤10×105/mL；和/或
所述脂肪多能细胞在所述组合物中的浓度为105-108/mL。
在另一优选例中，所述富含血小板的血浆中，血小板浓度范围为5×107-5× 108/mL。
在另一优选例中，所述脂肪多能细胞在组合物中的浓度为1×106-5×107/mL。
在另一优选例中，所述血浆中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、PDGF、 VEGF、IL-1、IL-6、TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合；和/或
所述的含脂肪多能细胞组分中还包括细胞因子，且所述的细胞因子选自下组： TGF-β、TIMPs、VEGF、HGF、PGE2、IGF-1、MIP-1a、IL-6、IDO、GM-CSF、 IL-1RA、IL-12p40、IL-10、IL-13，或其组合；和/或
所述的脂肪多能细胞表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、CD36、 CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、HLA-ABC、CD73、 CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合；和/或
所述的脂肪多能细胞不表达的表面标志选自下组：CD133、CD146、CD14、 CD117、CD11b、CD79α、CD19、HLA-DR，或其组合。
在另一优选例中：
所述的多糖选自下组：透明质酸、透明质酸衍生物、右旋糖苷、褐藻酸、壳 多糖，或其组合；和/或
所述的药学上可接受的缓冲液选自下组：氯化钠缓冲液、氯化钙缓冲液、钙 镁磷酸盐缓冲液、钙镁硫酸盐缓冲液、钙镁羧酸盐缓冲液、葡萄糖磷酸缓冲液、4- 羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、含血清培养基，无血清培养基，或其组合。
在另一优选例中，所述的多糖的质量百分比浓度为0.001-30%，以溶液的总质 量计。
在另一优选例中，所述缓冲液的pH=6.7-7.5。
在另一优选例中，所述组合物为单元剂型，且所述单元剂型的体积为≤4mL， 较佳地为≤3mL。
在另一优选例中，所述组合物的单次使用体积为0.15-3mL。
在另一优选例中，在所述组合物中，所述脂肪多能细胞浓度与血小板浓度比 例是100：1-1：100000。
在另一优选例中，所述多能细胞浓度与血小板浓度比例是10：1-1：1000。
在另一优选例中，所述多能细胞浓度与血小板浓度比例是1：5-1：50。
本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的组合物的制备方法， 所述方法包括步骤：将组分a、b、c和d混合，制成组合物。
在另一优选例中，所述方法包括：
i从脂肪组织分离含脂肪多能细胞组分；
ii添加从血液中分离富含血小板的血浆；
iii添加多糖；
iv任选的添加药学上可接受的缓冲液；
其中，所述的步骤i.包括：
(1)分离基质血管成分；和/或：分离纯化血管基质成分中的脂肪多能细胞； 和/或；培养扩增脂肪多能细胞；
(2)取基质血管成分、纯化的脂肪多能细胞和培养扩增的脂肪多能细胞中的一 种或多种组合进行混合。
在另一优选例中，所述的基质血管成分来源于外周血。
在另一优选例中，所述的基质血管成分是使用酶消化法或超声空化法获 得。
在另一优选例中，所述的分离纯化血管基质成分中的脂肪多能细胞步骤包 括：采用流式细胞术分离得到CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和/或 CD34+CD31+细胞。
在另一优选例中，所述的分离富含血小板的血浆步骤包括：用全自动和半自动 装置对所述血浆进行分离。
在另一优选例中，所述的富含血小板的血浆通过离心法或过滤法去除红细胞和 白细胞。
本发明的第三方面，提供了一种用于治疗骨关节炎的制剂，所述制剂包含如本 发明第一方面所述的组合物作为有效成分。
在另一优选例中，所述的制剂是注射剂。
在另一优选例中，所述的制剂用于对患者的患病关节进行注射。
在另一优选例中，所述制剂中，
所述的脂肪多能细胞的浓度为105-108/mL；
血小板的浓度为5×107-5×108/mL；
白细胞的浓度为≤5×105mL；
红细胞的浓度为≤5×105mL；且
所述制剂的体积为≤4mL；且
所述血浆中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、PDGF、VEGF、IL-1、IL-6、 TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合；和/或
所述的含脂肪多能细胞组分中还包括细胞因子，且所述的细胞因子选自下组： TGF-β、TIMPs、VEGF、HGF、PGE2、IGF-1、MIP-1a、IL-6、IDO、GM-CSF、 IL-1RA、IL-12p40、IL-10、IL-13，或其组合；和/或
所述的含脂肪多能细胞组分表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、 CD36、CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、HLA-ABC、 CD73、CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合；和/或
所述的含脂肪多能细胞组分不表达的表面标志选自下组：CD133、CD146、 CD14、CD117、CD11b、CD79α、CD19、HLA-DR，或其组合。
在另一优选例中，所述制剂的体积为≤3mL。
在另一优选例中，所述制剂的体积为0.15-3mL。
本发明的第四方面，提供了一种试剂组合或试剂盒，所述试剂组合或试剂盒包 括：
a.含脂肪多能细胞组分，所述的组分中包括(a1)基质血管成分，所述的基质 血管成分中含有脂肪多能细胞；和/或(a2)纯化或培养扩增的脂肪多能细胞；
b.富含血小板的血浆，其中，所述血浆中白细胞的浓度为≤5×105/mL；
c.多糖；
d.任选的药学上可接受的缓冲液；
和e.说明书，所述的说明书中记载了使用方法；
且所述的使用方法包括：将组分a、b、c和d混合，用于对骨关节炎患者进行治 疗。
在另一优选例中，所述的基质血管成分含有脂肪多能细胞。
在另一优选例中，所述(a2)中的脂肪多能细胞选自下组：从基质血管成分中纯 化的脂肪多能细胞、经培养扩增的脂肪多能细胞，或其组合。
本发明的第五方面，提供了一种治疗骨关节炎的方法，所述方法包括：对患者 施用有效量的如本发明第一方面所述的组合物，或对患者施用有效量的如本发明第 二方面所述的制剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本发明实施例2中关节软骨修复病理图。
图2是本发明实施例2中各组的Mankin评分图。
图3是本发明实施例2中治疗后关节液内TNF-α含量检测图。
图4是本发明实施例2中治疗10周后的关节软骨总量图。
图5是本发明实施例3中膝骨关节炎疼痛缓解评分图。
图6是本发明实施例3中膝骨关节炎症状缓解评分图。
图7是本发明实施例4中治疗对象的治疗结果对比图。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，采用分离纯化并去除了白 细胞、红细胞的富含血小板的血浆结合脂肪多能细胞制成生物制品组合物对骨 关节炎患者进行治疗，得到了意想不到的治疗效果。且当所述的生物制品被制 成或用作关节注射剂时，只需注射少量的液体，即可达到非常好的治疗效果。 基于上述发现，发明人完成了本发明。
骨性关节炎
骨关节炎是一种慢性关节疾病，它的主要改变是关节软骨面的退行性变和 继发性的骨质增生，表现在关节疼痛和活动不灵活，X线表现关节间隙变窄，软 骨下骨质致密，骨小梁断裂，有硬化和囊性变；关节边缘有唇样增生；后期骨 端变形，关节面凹凸不平；关节内软骨剥落，骨质碎裂进入关节，形成关节内 游离体。
在本发明中，所述的骨关节炎可以是任选自下组的骨关节炎：膝骨关节炎、 脊柱骨关节炎、髋骨关节炎、或其组合。本发明所述的骨性关节炎优选为膝骨关 节炎。
脂肪
脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源，脂肪组织材料可以来源于腰部、臀 部、腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得脂 肪组织，包括(但不限于)抽吸、手术分离等方法。
在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人 的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、 臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。
基质血管成分
基质血管成分含有脂肪多能细胞，并含有多种其他类型细胞，最早是采用 酶消化方法从脂肪组织获得，可经过提取纯化分离出出脂肪多能细胞。基质血 管成分对骨关节炎治疗也具有治疗效果，并且基质血管成分从分离到移植2-3 小时，能减少移植时间，且价格便宜，还能减少细胞培养中的风险。同时基质 血管成分中含有CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞，具有较强的促进血管 再生能力，有明显的促进机体修复作用。
含脂肪多能细胞组分
脂肪多能细胞治疗骨关节炎已见报道，从脂肪获取多能细胞，相较于传统 的方法更为简便，来源广，且脂肪中具CFU-F形成能力的多能细胞含量高，增 殖能力强。
基质血管成分对骨关节炎具有治疗效果，并且基质血管成分从分离到移植 2-3小时，能减少移植时间，且价格便宜，还能减少细胞培养中的风险，同时 基质血管成分中含有CD34+CD31-和CD34+CD31+的多能细胞，具有较强的促进血 管再生能力，然而，基质血管成分含有的脂肪多能细胞浓度不够，影响了治疗 效果；而经培养后的脂肪多能细胞CD34+表达减少或消失，也可能达不到最佳 治疗效果。
在本发明中，将基质血管成分与纯化的或培养扩增的脂肪多能细胞联用， 从而改善上述两者各自的缺陷，提高血管再生能力，改善效果更明显。
优选地，所述的脂肪多能细胞表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、 CD36、CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、HLA-ABC、 CD73、CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合；和/或
所述的脂肪多能细胞不表达的表面标志选自下组：CD133、CD146、CD14、 CD117、CD11b、CD79α、CD19、HLA-DR，或其组合。
富含血小板的血浆(PRP)
富含血小板的血浆能分泌多种促进软骨恢复细胞因子，但也有研究报道其 对软骨修复产生负面效果。在治疗骨关节炎方面，PRP的效果尚存在争议。
目前，富含血小板血浆制备差异性巨大，所含单核细胞量从106/ML到 1010/ML，目前缺少对它的最佳含量范围的报道研究。
本发明采用了分离去除白细胞和红细胞的富含血小板的血浆，意外地得到 了更佳的治疗效果。优选地，本发明采用的PRP中，血小板的浓度为5×107-5× 108/mL，白细胞浓度为≤5×105mL，红细胞的浓度为≤5×105mL。
在本发明中，优选的所述血浆中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、PDGF、 VEGF、IL-1、IL-6、TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合。
治疗骨关节炎的组合物
本发明提供了一种治疗骨关节炎的组合物，所述的组合物包括以下组分：
a.含脂肪多能细胞组分；所述的组分中包含(a1)基质血管成分，所述的基质 血管成分中含有多能细胞；和(a2)纯化或培养扩增的脂肪多能细胞；
其中，所述的脂肪多能细胞选自下组：从基质血管成分中纯化的脂肪多能细胞、 经培养扩增的脂肪多能细胞，或其组合；b.富含血小板的血浆；
c.多糖；和
任选的d.药学上可接受的缓冲液。
所述的组合物较佳地为液态组合物。
多糖成分具有缓冲应力、屏蔽作用、抗炎、缓解疼痛和保护软骨的作用。 最后加入缓冲液可稳定溶液PH，并且可添加促进富含血小板的血浆释放因子的 成分。在本发明中，所述的多糖包括(但并不限于)：透明质酸、透明质酸衍生物、 右旋糖苷、褐藻酸、壳多糖，或其组合。
在另一优选例中，所述多糖的质量百分比浓度为0.001-30%。
缓冲液用于调整组合物的pH值，从而减轻注射时患者的刺痛感。在本发明中 所述的药学上可接受的缓冲液包括(但并不限于)：氯化钠缓冲液、氯化钙缓冲液、 钙镁磷酸盐缓冲液、钙镁硫酸盐缓冲液、钙镁羧酸盐缓冲液、葡萄糖磷酸缓冲液、 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、含血清培养基，无血清培养基，或其组合。较佳地， 所述的缓冲液是钙盐。在本发明的另一优选例中，所述缓冲液的pH=6.7-7.5。
现有技术中的治疗骨关节炎的注射用生物制品组合物普遍存在内注射体积偏 大的问题，如给人的关节注射总体积为5ml～8.5ml的液体，大量的液体注入不 仅使注射更容易失败，而且还会增加患者酸胀疼痛等不适感。在本发明中，由 于对各组分的含量和配比做出了优化，使得注射总体积能够减少至≤4mL，有 利于提高多能细胞和富含血小板的血浆释放因子的浓度，也能够促进细胞迁移 至病患部位进行修复。
在本发明的一个优选例中，所述组合物为单元剂型，且所述单元剂型的体积为 ≤4mL，较佳地为≤3mL。
在另一优选例中，所述单元剂型的体积在0.15-3mL。
在本发明的另一优选例中，在所述组合物中，所述脂肪多能细胞浓度与血小板 浓度比例是100：1-1：100000；
所述多能细胞浓度与血小板浓度比例是10：1-1：1000；
所述多能细胞浓度与血小板浓度比例是1：5-1：50。
所述的组合物可直接用于给骨关节炎患者的关节部位进行注射，或用于制备治 疗骨关节炎的制剂。所述的制剂可以是任何剂型，较佳地为注射剂。
在本发明的另一优选例中，所述制剂中：
所述的脂肪多能细胞的浓度为105-108/mL；
血小板的浓度为5×107-5×108/mL；
白细胞和红细胞的总浓度为≤5×105mL；
且所述制剂的体积为≤4mL；且
所述血浆中还包括选自下组的生长因子：TGF-β、PDGF、VEGF、IL-1、IL-6、 TNF、IRAP、CTGF、EGF、IGF、BFGF，或其组合；和/或
所述的含脂肪多能细胞组分中还包括细胞因子，且所述的细胞因子选自下组： TGF-β、TIMPs、VEGF、HGF、PGE2、IGF-1、MIP-1a、IL-6、IDO、GM-CSF、 IL-1RA、IL-12p40、IL-10、IL-13，或其组合；和/或
所述的脂肪多能细胞表达的表面标志选自下组：CD90、CD34、CD10、CD36、 CDCD45、CD105、CD29、CD44、CD49b、CD49e、CD58、HLA-ABC、CD73、 CD13、CD63、CD166、CD31、CD106、CD71，或其组合；和/或
所述的脂肪多能细胞不表达的表面标志选自下组：CD133、CD146、CD14、 CD117、CD11b、CD79α、CD19、HLA-DR，或其组合。
在另一优选例中，所述制剂的单次用量为≤3mL。
本发明的主要优点包括：
1.本发明采用去除了白细胞和红细胞的PRP，使本发明提供的组合物治疗 效果更佳。
2.采用基质血管成分与培养扩增后的多能细胞相组合，且采用了 CD45-CD235a-CD31-CD34+和CD34+CD31+多能细胞纯化的含脂肪多能细胞组 分，使本发明的组合物的修复能力相较现有技术更强，治疗效果更好。
3.优化了多能细胞与血小板的含量和配比，具有更佳治疗效果。
4.相较现有技术而言，本发明的制剂体积更小，注射后不会对患者关节造 成负担，具有更佳治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则 百分比和份数按重量计算。
实施例1：
制备治疗骨关节炎的生物制品
一、从脂肪组织分离含脂肪多能细胞组分
1.分离基质血管成分
从患者供脂部抽取脂肪组织30ml，脂肪组织经800g×5分钟离心，取离心 后的上层脂肪用含0.075％胶原酶的PBS消化45分钟，离心，弃上层液，DMEM 重悬下层混合的细胞沉淀。反复洗涤3次去除胶原酶。同时收集抽吸液500ml， 800g×5分钟离心，弃上层液，吹打，加生理盐水200ml震荡30秒，加入22.2ml 10×PBS恢复等张，离心，重悬，共3次。将两部分重悬液混合，100目滤网 过滤。使用血球计数板测定细胞浓度，离心重悬于DMEM，调整细胞浓度为3×107个/ML。
2.分离纯化血管基质成分中的脂肪多能细胞
分离的血管基质成分细胞重悬于FACS缓冲液(含1%BSA和0.05%叠氮化 钠的PBS)，调整细胞至105个细胞，加入抗体，混匀后冰上孵育。根据表达细 胞表面标记水平，使用FACSvantageTM(Becton Dickinson)分选 CD45-CD235a-CD31-CD34+细胞和CD34+CD31+细胞。加入DMEM调整细胞浓度为 3×107个/ML。
3.培养扩增脂肪多能细胞
将获得的基质血管成分细胞离心，重悬于无血清培养基中，调整细胞浓度 至3×105个/cm2，接种至T75培养瓶中培养，细胞增殖至融合度达80%后进行 细胞传代。P3代细胞融合至80%时，使用胰蛋白酶消化细胞，离心后重悬于DMEM， 调整细胞浓度为3×107个/ML。
4.混合几种含多能细胞成分
取血管基质成分细胞0.5ML、纯化的脂肪多能细胞0.5ML和培养的脂肪多 能细胞0.5ML在离心管中进行混合,共1.5ML。流式检测混合液 CD45-CD235a-CD31-CD34+和CD45-CD13+CD36+CD73+多能细胞含量，多能细胞终 浓度是2.1×107个/ML。
5.流式表面标志测定
取混合后的多能细胞样品，将5×106的细胞放入1.5ml离心管中3000r/ 分钟离心5分钟，弃上清。加入FACS缓冲液100微升悬浮细胞。加入封闭细 胞表面Fc受体0.5微升（0.5mg/ml），水浴3分钟。加入荧光抗体1微升 （0.5mg/ml），水浴30分钟。加入FACS缓冲液350微升，轻轻混匀，3000r/ 分钟，离心5分钟，弃上清，重复洗涤2次。取100微升l仪器缓冲液加入获 得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，在BD 流式细胞仪上进行仪器检测和分析。
检测得混合的多能细胞表达的表面标志为：CD90、CD34、CD10、CD36、CD45、 CD73、CD13、、CD31、CD106、CD71，不表达的表面标志为：CD133、CD14、CD79 α、CD19、HLA-DR。
6.软骨分化能力检测
取混合后的多能细胞样品接种至24孔板，融合至80%，更换成软骨诱导液 （10ng/mL TGF、10mmol/mL地塞米松、50mg/mL维生素C、高糖DMEM配制 成），每3天换液1次，诱导11天，对照组使用。诱导培养时培养孔内预先 放置盖玻片，使细胞贴盖玻片生长，至11天时取出细胞爬片，体积分数10% 甲醛固定1小时，PBS冲洗15分钟，蒸馏水冲洗1次，滴加10g/L阿新蓝染 色，染色3小时，加入95%乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。
检测得多能细胞能分化为软骨细胞，对照组分化实验结果为阴性。
二、分离富含血小板的血浆
抽取患者20ML外周血，摇匀，置入离心管中，进行两次离心。第一次离 心速度1500转/分钟，离10分钟。离心后分为上层的血浆和下层的红细胞两 层。弃去位于离心管下部的红细胞，吸取全部血浆至另一离心管。使用去白细 胞滤器过滤血浆，去除白细胞。将过滤的血浆进行第二次离心，速度3000转/ 分钟，离心10分钟，血浆分为上层的乏血小板血浆和下层的富含血小板的血 浆，取下层富含血小板的血浆。
采用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公司）检测分离的富含血小 板中血小板含量9.7×107个/ML，白细胞含量1.1×105个/ML，红细胞含量 4.3×105个/ML。
三、ELISA检测多能细胞培养上清液和富含血小板的血浆中细胞因子表达
取混合后的多能细胞样品按105个/cm2接种至培养皿中，贴壁培养36小时 后取培养上清，用ELISA法检测TGF-β、HGF、IGF-1、VEGF表达。
富血小板的血浆按体积比1∶9加入激活剂(500U凝血酶冻干粉溶于1mL 10%氯化钙中)，激活富血小板血浆，室温静置24小时后，4000转/分钟，离 心15分钟提取萃取液，用ELISA法检测细胞因子的表达。
检测结果显示：多能细胞培养上清液表达TGF-β、HGF、IGF-1、VEGF，富 含血小板的血浆中细胞因子表达TGF-β、PDGF、VEGF、EGF、IGF、BFGF
四、混合多能细胞组分、富含血小板的血浆、透明质酸、缓冲液
使用前分开保存，使用时多能细胞组分1.5ML，PRP0.5ML，透明质酸0.5ML， 10%的氯化钙缓冲液0.5ML。共3ML，加入后轻微振荡5分钟。
五、生物制品的冻存复苏
生物制品中多能干细胞组分加入10%DMSO，在程序降温仪中降温，保存于 -196℃液氮中，使用时在37℃水浴中快速复苏，复苏后细胞活率>90%。富含血 小板的血浆加入5%的DMSO，放入-80℃冰箱中保存，使用时常温复温。透明质 酸和10%的氯化钙缓冲液在4℃中保存，使用时常温复温。
实施例2：
生物制品的制备及用于治疗兔骨关节炎的实验
一、生物制品制备：
1）分离兔皮肤下脂肪10ML，使用酶消化法获得基质血管成分，调整细胞 浓度为1×107个/ML。培养扩增的脂肪多能细胞，调整细胞浓度为1×107个/ML。 取0.1ML基质血管成分和0.1ML扩增的脂肪多能细胞混合，流式检测混合液 CD45-CD235a-CD31-CD34+和CD45-CD13+CD36+CD73+多能细胞含量。多能细胞终 浓度是6.5×106个/ML。
2）抽取兔股动脉血液10ML，第一次离心速度1500转/分钟，离心10分钟， 吸取上层血浆至另一离心管。离心分离富含血小板的血浆，每次速度3000转/ 分钟，离心10分钟，去除上层含白细胞和红细胞液体，取下层富含血小板的 血浆，重悬于生理盐水中，重复离心3次。采用pocH-100i血细胞分析仪（日 本Sysmex公司）检测分离的富含血小板血浆中血小板含量5×107个/ML，白细 胞含量5×104个/ML，红细胞含量1.2×105个/ML。
3）取脂肪多能细胞组分0.2ML，富含血小板的血浆0.05ML，右旋糖苷 0.04ML，10%的氯化钙缓冲液0.01ML，轻微振荡混匀后共0.3ML。
二、兔骨关节炎造模
选用健康成年新西兰大耳白兔，体重4到5千克。将兔后左膝关节进行前 交叉韧带切断术与内侧半月板切除术联合造模，右膝作为对照侧，手术6周后， 病理评价骨关节炎造模效果。
三、兔骨关节炎治疗
在评价造模成功后第4周，在超声引导下使用注射器向患骨关节炎的关节 处注射0.3ml生物制品，缓慢推注。
四、治疗效果评价
在接受治疗后第10周，进行检测：
1）关节病理观察
关节去除远端股骨和胫骨平台后，用10%甲醛固定，样本脱钙后，石蜡包埋后 切片，进行HE染色。结果如图1所示，正常膝关节软骨表层完好，软骨细胞正常； 对照组未治疗的膝关节软骨表层明显破坏，剥脱现象明显，表层软骨空泡样变性， 成熟软骨细胞柱状线消失，结构破坏明显；经细胞治疗后的软骨，破坏的软骨表层 恢复完好，软骨正常未发生空泡样变性，成熟软骨细胞柱状线恢复。
2）Mankin评分
关节去除远端股骨和胫骨平台后，用10%甲醛固定，样本脱钙后，石蜡包 埋后切片，进行HE染色、甲苯胺蓝和番红O染色。采用Mankin评分法对关节进 行评分，结果如图2所示。
3）取关节液，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6、MMP-13等炎性因子表达。 治疗后关节液内TNF-α含量检测如图3所示。
4）将兔关节进行核磁共振成像MRI观察，检测关节恢复状况及软骨体积。 治疗10周后关节软骨总量变化如图4所示。
实施例3：
生物制品的制备及用于骨关节炎患者的治疗
一、生物制品制备：
1）分离患者皮下脂肪30ML，使用酶消化法获得基质血管成分，接种基质 血管成分至T75培养瓶，扩增培养脂肪多能细胞，生长至融合度80%，酶消化获 得细胞，调整细胞浓度为5×107个/ML。取0.1ML基质血管成分和0.1ML扩增的脂 肪多能细胞混合，流式检测混合液中CD45-CD235a-CD31-CD34+和 CD45-CD13+CD36+CD73+多能细胞含量。多能细胞终浓度是4.97×107个/ML。
2）抽取人外周血20ML，第一次离心速度1500r/min，离心10分钟，吸取上 层血浆至另一离心管。离心分离富含血小板的血浆，每次速度3000r/min，离 心10分钟，去除上层含白细胞和红细胞液体，取下层富含血小板的血浆，重悬 于生理盐水中，重复离心3次。采用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公 司）检测分离的富含血小板血浆中血小板含量5×108个/ML，白细胞含量9×104个/ML，红细胞含量4×105个/ML。
3）取脂肪多能细胞组分1ML、富含血小板的血浆1ML和透明质酸1ML，轻 微振荡液体，混匀后共3ML。
二、生物制品用于膝骨关节炎患者的治疗
膝骨关节炎患者20名，分为2组。组1患者在超声引导下缓慢注射3ml生物 制品到患骨关节炎的关节腔；组2患者接受注射的生物制品用透明质酸增加体 积至8ML，在超声引导下缓慢注射到患骨关节炎的关节。术后在第2、5、10、 18和52周随访。
三、治疗效果评价
生物制品注射到骨关节炎的关节腔内，3ml体积的生物制品在注射过程中， 患者反映的酸胀感和疼痛感低于8ml体积的生物制品。
1.膝骨关节炎疼痛缓解评分
疼痛缓解评分如图5所示，症状缓解评分如图6所示。结果显示，体积为3ml 的生物制品对疼痛和症状缓解效果优于体积8ml的生物制品。
2.超声测定软骨厚度
表1.超声测定软骨厚度
n=10
超声测定结果显示，体积为3ml的生物制品软骨恢复效果优于体积为8ml的 生物制品。
实施例4：
富含血小板的血浆采用去除白细胞和红细胞操作后用于骨关节炎治疗
一、富含血小板的血浆分离及减少白细胞和红细胞含量操作
抽取狗股动脉血液12ML，第一次离心速度1500r/min，离心10分钟，吸取上 层血浆至另一离心管。使用去白细胞滤器过滤血浆，去除白细胞。离心分离富 含血小板的血浆，每次速度3000r/min，离心10分钟，去除上层含白细胞和红 细胞液体，取下层富含血小板的血浆，重悬于生理盐水中，重复离心3次。采 用pocH-100i血细胞分析仪（日本Sysmex公司）检测分离的富含血小板血浆 中血小板含量3×108个/ML，白细胞含量3×103个/ML，红细胞含量7×104个/ML。
未进行去除红细胞和白细胞操作的富含血小板的血浆中血小板含量 2.8×108个/ML，白细胞含量1×106个/ML，红细胞含量5×106个/ML。
二、富含血小板的血浆用于狗骨关节炎患者的治疗
狗后左膝关节进行前交叉韧带切断术与内侧半月板切除术联合造模。患骨 关节炎的模型狗分成两组，每组10只。组1的狗在超声引导下缓慢注射0.5ml去 除红细胞和白细胞的富含血小板的血浆至骨关节炎关节；组2的狗在超声引导 下缓慢注射0.5ml未去除红细胞和白细胞的富含血小板的血浆至骨关节炎关 节，术后在30、60和90天随访。
三、治疗效果评价
1.总体评分
对狗治疗后跛行、活动受限、功能障碍进行测评，结果显示，治疗组的总 体状况较对照组有明显改善（总评分）。其中，跛行状况改善明显，行走中的 跛行30天后即出现明显改善（P<0.05），至60天出现进一步改善并持续至90天； 而跳跃中的跛行改善更为明显，30天左右即出现显著改善（P<0.01），并一直 保持至90天左右。关节的活动度改善也相当明显，30天左右就出现显著改善 （P<0.01），且直至实验结束均未为出现反复。将治疗组和对照组的总体评分 进行比较，结果如图7所示。
本发明提供的生物制品组合物在移植治疗骨关节炎和动物实验治疗中，软 骨有明显恢复，与对照组相比有差异显著，恢复情况与正常组相近。治疗组新 生血管情况优于对照组；治疗后关节液炎症因子显著下调，与正常值无显著差 异。临床病人接收治疗，疼痛不适感弱，膝关节功能恢复良好，评分显著高于 对照组。结果显示，本发明提供的组合物能够非常有效地治疗骨关节炎。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。