一种胎盘保存液的制备方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610560839.X	申请日：	20160714
公开号：	CN106172373A	公开日：	20161207
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	A01N1/02	主分类号：	A01N1/02
申请人：	金华市思丹姆干细胞生物科技有限公司
发明人：	蔡鹏,吴进一,江文娇,朱思眉,项鹏辉
地址：	321000 浙江省金华市婺城区八一南街以西，旅游大厦以南云中楼1幢第7层
优先权：	CN201610560839A
专利代理机构：	北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙)	代理人：	黄冠华;贾莲莲
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

本发明公开了一种胎盘保存液的制备方法，包括以下步骤：(1)准备0.9％的氯化钠水溶液；(2)向步骤(1)中的溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液；(3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；(4)将步骤(3)所得的保存液通过20μm—25μm滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。胎盘保存液直接由0.9％的氯化钠水溶液和AIM—V无血清培养基配置而成，可以有效的维持细胞渗透压和活力，提高细胞抵抗力，对细胞无毒副作用，同时因成分简单，配置方便快捷，提高使用率。

权利要求书

1.一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)准备浓度为0.9％的氯化钠水溶液；(2)向步骤(1)中的溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液；(3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO，调节PH至7.1—7.4；(4)将步骤(3)所得的保存液通过20μm—25μm滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。 2.根据权利要求1所述的一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的AIM—V无血清培养基含有L—谷酰酰胺，50μg/ml硫酸链霉素和10μg/ml硫酸庆大霉素。 3.根据权利要求1所述的一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：所述胎盘保存液中AIM—V无血清培养基的浓度为30％—40％。 4.根据权利要求1所述的一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：步骤(4)所用的滤膜孔径为22μm。

说明书

技术领域

本发明涉及生物离体组织或器官的保存领域，特别涉及一种胎盘保存液的制备方法。

背景技术

间充质干细胞是干细胞家族中的重要一员，可以不断进行自我更新，具有多向分化潜力。目前，间充质干细胞主要来源于骨髓、脐血、脐带组织和胎盘组织等,从胎盘组织中分离得到的间充质干细胞，具有来源方便，数量充足，制备简单、快捷，细胞增殖能力和分化能力强等优点，具有较高的应用价值。

胎盘从采集到制备，这个过程需要一定时间，然而胎盘在离体环境下会迅速影响胎盘组织的代谢状况，其细胞活力会在短时间内明显下降，因此如何保证间充质干细胞的活性是问题的关键。通常情况下，在采集完胎盘后，将其置于保存液中进行保存，给细胞提供营养成分，维持活力。

现有保存液主要是在缓冲液的基础上添加树种氨基酸、抗生素、人血白蛋白等成分，虽然可以较好的维持细胞活性，然而过程繁琐，成分复杂，费时费力，无法在短时间内大量配置。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种胎盘保存液的制备方法，解决现有技术中存在的保存液配置繁琐，过程复杂，工作量大等问题。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种胎盘保存液的制备方法，包括以下步骤：

(1)准备浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

(2)向步骤(1)中的溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液；

(3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；

(4)将步骤(3)所得的保存液通过20μm—25μm滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。

作为优选，步骤(2)中所述的AIM—V无血清培养基含有L—谷酰酰胺，50μg/ml硫酸链霉素和10μg/ml硫酸庆大霉素。

作为优选，所述胎盘保存液中AIM—V无血清培养基的浓度为30％—40％。

作为优选，步骤(4)所用的滤膜孔径为22μm。。

本发明的有益效果是：胎盘保存液直接由浓度为0.9％的氯化钠水溶液和AIM—V无血清培养基配置而成，可以有效的维持细胞渗透压和活力，提高细胞抵抗力，对细胞无毒副作用，同时因成分简单，配置方便快捷，提高使用率。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明的一种胎盘保存液的制备方法，包括以下步骤：

(1)准备浓度为0.9％的氯化钠水溶液；

(2)向步骤(1)中的溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液；

(3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；

(4)将步骤(3)所得的保存液通过20μm—25μm滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。

其中AIM—V无血清培养基含有L—谷酰酰胺，50μg/ml硫酸链霉素和10μg/ml硫酸庆大霉素；所得胎盘保存液中AIM—V无血清培养基的浓度为30％—40％；步骤(4)所用的滤膜孔径为22μm。

上述所得胎盘保存液直接由浓度为0.9％的氯化钠水溶液和AIM—V无血清培养基配置而成，可以有效的维持细胞渗透压和活力，提高细胞抵抗力，对细胞无毒副作用，同时因成分简单，配置方便快捷，提高使用率。

实施例1：

向0.9％的氯化钠水溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液，再加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；最后将保存液通过22μm的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIM—V无血清培养基的浓度为30％。

实施例2：

向0.9％的氯化钠水溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液，再加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；最后将保存液通过22μm的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIM—V无血清培养基的浓度为40％。

对比例1：

向0.9％的氯化钠水溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液，再加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；最后将保存液通过22μm的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIM—V无血清培养基的浓度为20％。

对比例2：

向0.9％的氯化钠水溶液中加入AIM—V无血清培养基，形成保存液，再加入NaHCO3，调节PH至7.1—7.4；最后将保存液通过22μm的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIM—V无血清培养基的浓度为50％。

用上述实施例和对比例配置好的胎盘保存液浸没胎盘，在4℃避光保存，具体方法为：由医护人员把新鲜采集的胎盘放置于胎盘采集盒中，并把4℃胎盘保存液转移至胎盘采集盒中，胎盘保存液应浸没胎盘，封好采集盒盖子后置于4℃中保存、运输。

细胞活力检测：

以实施例1—2所述的胎盘保存液保存的胎盘为实验组1—2，以对比例1—2所述的胎盘保存液保存的胎盘为对照组1—2。各实验组和对照组胎盘分别在24h、48h、96h进行实验，按照常规方法分离胎盘间充质干细胞，取分离得到的胎盘干细胞，调整密度为1×106cells/ml，进行活细胞计数，结果如表1所示。

表1

细胞活率 24h 48h 96h 实验组1 93.85％ 89.58％ 82.15％实验组2 94.98％ 90.14％ 81.24％对照组1 88.48％ 72.56％ 56.38％对照组2 92.23％ 85.26％ 63.24％

实验组1、2分离得到的胎盘间充质干细胞整体的细胞活率要高于对照组1、2分离得到的胎盘间充质干细胞。对照组1可能是因为培养基含量低，导致细胞营养成分不足；对照组2前24h细胞活率在90％以上，随着时间推移，细胞活率出现了明显的下降，可能是由于培养基含量高，细胞代谢偏旺盛，产生代谢废物，致使溶液PH降低，影响细胞活性。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

资源描述

《一种胎盘保存液的制备方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种胎盘保存液的制备方法.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610560839.X (22)申请日 2016.07.14 (71)申请人金华市思丹姆干细胞生物科技有限公司地址 321000 浙江省金华市婺城区八一南街以西，旅游大厦以南云中楼1幢第7 层 (72)发明人蔡鹏吴进一江文娇朱思眉项鹏辉 (74)专利代理机构北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙) 11411 代理人黄冠华贾莲莲 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) (54)发明名称一种胎盘保存液的制备方法 (57)摘。

2、要本发明公开了一种胎盘保存液的制备方法，包括以下步骤： (1)准备0.9的氯化钠水溶液； (2)向步骤(1)中的溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液； (3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.17.4； (4)将步骤 (3)所得的保存液通过20m25m滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。胎盘保存液直接由0.9 的氯化钠水溶液和AIMV无血清培养基配置而成，可以有效的维持细胞渗透压和活力，提高细胞抵抗力，对细胞无毒副作用，同时因成分简单，配置方便快捷，提高使用率。权利要求书1页说明书3页 CN 106172373 A 2016.12。

3、.07 CN 106172373 A 1.一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)准备浓度为0.9的氯化钠水溶液； (2)向步骤(1)中的溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液； (3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.17.4； (4)将步骤(3)所得的保存液通过20 m25 m滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。 2.根据权利要求1所述的一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的 AIMV无血清培养基含有L谷酰酰胺， 50 g/ml硫酸链霉素和10 g/ml硫酸庆大霉素。 3.根据权利要求1所述的一种胎盘保存液的制备方。

4、法，其特征在于：所述胎盘保存液中 AIMV无血清培养基的浓度为3040。 4.根据权利要求1所述的一种胎盘保存液的制备方法，其特征在于：步骤(4)所用的滤膜孔径为22 m。权利要求书 1/1 页 2 CN 106172373 A 2 一种胎盘保存液的制备方法技术领域 0001 本发明涉及生物离体组织或器官的保存领域，特别涉及一种胎盘保存液的制备方法。背景技术 0002 间充质干细胞是干细胞家族中的重要一员，可以不断进行自我更新，具有多向分化潜力。目前，间充质干细胞主要来源于骨髓、脐血、脐带组织和胎盘组织等,从胎盘组织中分离得到的间充质干细胞，具有来。

5、源方便，数量充足，制备简单、快捷，细胞增殖能力和分化能力强等优点，具有较高的应用价值。 0003 胎盘从采集到制备，这个过程需要一定时间，然而胎盘在离体环境下会迅速影响胎盘组织的代谢状况，其细胞活力会在短时间内明显下降，因此如何保证间充质干细胞的活性是问题的关键。通常情况下，在采集完胎盘后，将其置于保存液中进行保存，给细胞提供营养成分，维持活力。 0004 现有保存液主要是在缓冲液的基础上添加树种氨基酸、抗生素、人血白蛋白等成分，虽然可以较好的维持细胞活性，然而过程繁琐，成分复杂，费时费力，无法在短时间内大量配置。发明内容 0005 本发。

6、明要解决的技术问题是提供一种胎盘保存液的制备方法，解决现有技术中存在的保存液配置繁琐，过程复杂，工作量大等问题。 0006 为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现： 0007 一种胎盘保存液的制备方法，包括以下步骤： 0008 (1)准备浓度为0.9的氯化钠水溶液； 0009 (2)向步骤(1)中的溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液； 0010 (3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.17.4； 0011 (4)将步骤(3)所得的保存液通过20 m25 m滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。 0012 作为优选，步骤(2)中所述的AIM。

7、V无血清培养基含有L谷酰酰胺， 50 g/ml硫酸链霉素和10 g/ml硫酸庆大霉素。 0013 作为优选，所述胎盘保存液中AIMV无血清培养基的浓度为3040。 0014 作为优选，步骤(4)所用的滤膜孔径为22 m。。 0015 本发明的有益效果是：胎盘保存液直接由浓度为0.9的氯化钠水溶液和AIMV 无血清培养基配置而成，可以有效的维持细胞渗透压和活力，提高细胞抵抗力，对细胞无毒副作用，同时因成分简单，配置方便快捷，提高使用率。具体实施方式 0016 下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施说明书 1/3 页 3 CN 1。

8、06172373 A 3 方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 0017 本发明的一种胎盘保存液的制备方法，包括以下步骤： 0018 (1)准备浓度为0.9的氯化钠水溶液； 0019 (2)向步骤(1)中的溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液； 0020 (3)向步骤(2)所得的保存液中加入NaHCO3，调节PH至7.17.4； 0021 (4)将步骤(3)所得的保存液通过20 m25 m滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液。 0022 其中AIMV无血清培养基含有。

9、L谷酰酰胺， 50 g/ml硫酸链霉素和10 g/ml硫酸庆大霉素；所得胎盘保存液中AIMV无血清培养基的浓度为3040；步骤(4)所用的滤膜孔径为22 m。 0023 上述所得胎盘保存液直接由浓度为0.9的氯化钠水溶液和AIMV无血清培养基配置而成，可以有效的维持细胞渗透压和活力，提高细胞抵抗力，对细胞无毒副作用，同时因成分简单，配置方便快捷，提高使用率。 0024 实施例1： 0025 向0 .9的氯化钠水溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液，再加入 NaHCO3，调节PH至7.17.4；最后将保存液通过22 m的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其。

10、中AIMV无血清培养基的浓度为30。 0026 实施例2： 0027 向0 .9的氯化钠水溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液，再加入 NaHCO3，调节PH至7.17.4；最后将保存液通过22 m的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIMV无血清培养基的浓度为40。 0028 对比例1： 0029 向0 .9的氯化钠水溶液中加入AIMV无血清培养基，形成保存液，再加入 NaHCO3，调节PH至7.17.4；最后将保存液通过22 m的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIMV无血清培养基的浓度为20。 0030 对比例2： 0031 向0 .9的氯化钠水溶液中。

11、加入AIMV无血清培养基，形成保存液，再加入 NaHCO3，调节PH至7.17.4；最后将保存液通过22 m的滤膜进行过滤，最终得胎盘保存液，其中AIMV无血清培养基的浓度为50。 0032 用上述实施例和对比例配置好的胎盘保存液浸没胎盘，在4避光保存，具体方法为：由医护人员把新鲜采集的胎盘放置于胎盘采集盒中，并把4胎盘保存液转移至胎盘采集盒中，胎盘保存液应浸没胎盘，封好采集盒盖子后置于4中保存、运输。 0033 细胞活力检测： 0034 以实施例12所述的胎盘保存液保存的胎盘为实验组12，以对比例12所述的胎盘保存液保存的胎盘为对照组12。各实验组和对照组。

12、胎盘分别在24h、 48h、 96h进行实验，按照常规方法分离胎盘间充质干细胞，取分离得到的胎盘干细胞，调整密度为1 106cells/ml，进行活细胞计数，结果如表1所示。 0035 表1 说明书 2/3 页 4 CN 106172373 A 4 0036 细胞活率 24h 48h 96h 实验组1 93.85 89.58 82.15 实验组2 94.98 90.14 81.24 对照组1 88.48 72.56 56.38 对照组2 92.23 85.26 63.24 0037 实验组1、 2分离得到的胎盘间充质干细胞整体的细胞活率要高于对照组1、 2分离得到的胎盘间充质干细胞。对照组1可能是因为培养基含量低，导致细胞营养成分不足；对照组2前24h细胞活率在90以上，随着时间推移，细胞活率出现了明显的下降，可能是由于培养基含量高，细胞代谢偏旺盛，产生代谢废物，致使溶液PH降低，影响细胞活性。 0038 以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。说明书 3/3 页 5 CN 106172373 A 5 。

展开阅读全文