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1、(10)申请公布号 CN 103845397 A (43)申请公布日 2014.06.11 CN 103845397 A (21)申请号 201210498062.0 (22)申请日 2012.11.29 A61K 36/53(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 9/04(2006.01)。
2、 (71)申请人 中国科学院兰州化学物理研究所 地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水中路 18 号 (72)发明人 赵亮 董树清 王利涛 张霞 (74)专利代理机构 兰州中科华西专利代理有限 公司 62002 代理人 方晓佳 (54) 发明名称 独一味中苯乙醇苷的提取方法 (57) 摘要 本发明公开了一种独一味中苯乙醇苷的提取 方法。 本发明采用唇形科植物独一味全草为原料， 利用水提醇沉或乙醇提取水沉淀或乙醇渗漉法得 到提取液， 用硫酸铜或活性白土进一步改善绿色 植物提取活性成分过程中叶绿素的干扰， 得到的 粗提物， 再经不同极性大孔树脂吸附柱层析分离 后， 得到纯化的含量为 50% 的。
3、苯乙醇苷提取物。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103845397 A CN 103845397 A 1/1 页 2 1. 一种独一味中苯乙醇苷的提取方法， 其特征在于该方法依次有下列步骤 ： A 提取 ： 采用唇形科植物独一味全草为原料， 过筛除杂后， 经水提醇沉、 乙醇提取水沉 淀法或乙醇渗漉提取法得到提取液 ； B 纯化 ： 在提取液中加入硫酸铜或活性白土， 提取液中的沉淀被有效沉积下来 ； C 分离 ： 将上述 B 步骤。
4、所得提取液通过弱极性的大孔树脂进行分离， 将提取液浓缩后全 部上样， 先用蒸馏水淋洗， 续以不同含量的乙醇溶液分别洗脱， 浓缩回收乙醇洗脱液 ； D 富集 ： 将上述 C 步骤所得乙醇的洗脱液浓缩后， 上样于另一非极性大孔树脂精制， 采 用不同极性的洗脱液洗脱， 先用蒸馏水淋洗， 续以不同含量乙醇溶液分别洗脱， 浓缩回收乙 醇洗脱液， 并将其真空干燥， 得到苯乙醇苷的提取物 ； E 测定 ： 将富集得到的干燥产物进行水解， 使苯乙醇苷的提取物中的苯乙醇苷完全水 解释放出苯乙醇和肉桂酸类化合物 ； 水解后得到的溶液用甲醇稀释供液相色谱测定。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于水提醇沉。
5、法 ： 称取药材粗粉， 加水煮 15 次， 合并水煮液， 浓缩至相对密度为 25时 1.021.12， 加 50%90% 乙醇， 静置， 待完全沉淀后， 抽滤得上清液， 浓缩药液至密度 1.021.12。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于醇提水沉法 ： 称取药材粗粉， 加 60%95% 的乙 醇回流15次， 合并醇煮液， 回收乙醇， 浓缩至相对密度为1.021.12， 加58倍体积蒸馏水， 静置， 待完全沉淀后， 抽滤得上清液， 浓缩药液至密度 1.021.12。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于乙醇渗漉法 ： 称取药材粗粉， 加 30%85wt% 的 乙醇浸泡， 。
6、收集渗滤液， 回收乙醇， 浓缩至相对密度为25时1.021.12， 加58倍体积蒸馏 水， 静置， 待完全沉淀后， 抽滤得上清液， 浓缩药液至密度 1.021.12。 5. 如权利要求 1-4 中任一项所述的方法， 其特征在于纯化 ： 将提取液中加入药材粗粉质量5%10%的CuSO4， 静置， 待沉淀完全析出后， 倾出上清液， 药液浓缩至相对密度在 25时测 1.021.14 ； 或者 将提取液中加入药材粗粉质量 5%10% 的活性白土， 静置， 待沉淀完全析出后， 倾出上 清液， 药液浓缩至相对密度在 25时测 1.021.14。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于分离 ： 提取。
7、得到的药液通过大孔树脂， 所用的 第一个弱极性大孔树脂为 HPD-100， WLD， D-101， AB-8 ； 用体积比 510 倍量的蒸馏水洗脱剂 进行洗脱 ； 用体积比 510 倍量的乙醇洗脱剂进行洗脱 ； 乙醇洗脱液的含量为 30%50%。 7. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于富集 ： 将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后， 再次 通过非极性大孔树脂为 Diaion HP - 10、 - 20、 - 30、 - 40、 - 50 ； 用体积比 510 倍量的 蒸馏水洗脱剂进行洗脱 ； 用体积比 510 倍量的乙醇洗脱剂进行洗脱 ； 乙醇洗脱液的含量为 50%70% 进行洗脱。 权 利 。
8、要 求 书 CN 103845397 A 2 1/4 页 3 独一味中苯乙醇苷的提取方法 0001 技术领域 本发明属于医药领域， 涉及以单一植物独一味为原料提取、 分离得到纯度较高的苯乙 醇苷类物质。 背景技术 0002 苯乙醇苷类化合物(phenylethanoid glycosides)是一类含有(羟基、 甲氧基)取 代苯乙基和 ( 羟基、 甲氧基 ) 取代肉桂酰基， 通常以 - 葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键 的天然糖苷， 广泛存在于双子叶植物中。 近年来许多研究表明， 该类化合物具有抗菌、 抗炎、 抗病毒、 抗肿瘤、 抗氧化、 免疫调节、 增强记忆、 保肝、 强心等作用， 尤其以抗菌。
9、活性最为显著 ( 中国药学杂志， 1995, 30（5） ： 269)。因而， 随着新的结构不断被发现， 药理活性实验技术 的提高， 更多活性指标的完成， 苯乙醇苷很有希望成为新一类抗菌、 抗肿瘤及提高人体免疫 机能的苷类药物。 0003 藏药独一味是唇形科植物， 主要治疗骨松质发炎、 骨折、 挫伤、 筋骨疼痛、 枪伤、 跌 打损伤、 浮肿后流黄水、 关节积水。中国专利申请号 200410022734.6 公开了从独一味植物 用水或乙醇提取， 经大孔树脂分离得到的一种提取物， 提取物的主要成分是总苷和总黄酮。 但是实际上我们研究发现独一味中黄酮含量较低， 实际上以苷类成分为主。中国专利申请 号。
10、 200510035064.6 公开了应用醇提水沉或乙醇渗漉提取法得到的提取液， 经大孔树脂吸 附后， 再经聚酰胺或硅胶柱层析分离纯化， 得到以干品计含量为 22-90% 的苯乙醇苷类活性 物质。 但此项专利并未对提取物活性成分做出具体的确证， 且工艺复杂， 使用聚酰胺柱成本 较高。 发明内容 0004 本发明目的是建立工艺路线简单、 成本低廉的独一味中苯乙醇苷类物质提取方 法。 0005 本发明采用唇形科植物独一味全草为原料， 利用水提醇沉或乙醇提取水沉淀或乙 醇渗漉法得到提取液， 用硫酸铜或活性白土进一步改善绿色植物提取活性成分过程中叶绿 素的干扰， 得到的粗提物， 再经不同极性大孔树脂吸。
11、附柱层析分离后， 得到纯化的含量为 50% 的苯乙醇苷提取物。 0006 本发明所得到的苯乙醇苷是苯乙醇总苷， 其水解后的产物是羟基酪醇、 高香草醇、 3,4- 二甲氧基苯乙醇、 咖啡酸、 阿魏酸、 3,4- 二甲氧基肉桂酸， 从而可以用这六种物质作为 对照品， 来定性定量测定实际样品中相应成分的含量。 0007 一种独一味中苯乙醇苷的提取方法， 其特征在于该方法依次有下列步骤 ： A 提取 ： 采用唇形科植物独一味全草为原料， 过筛除杂后， 经水提醇沉、 乙醇提取水沉 淀法或乙醇渗漉提取法得到提取液 ； B 纯化 ： 在提取液中加入硫酸铜或活性白土， 提取液中的沉淀被有效沉积下来 ； C 分。
12、离 ： 将上述 B 步骤所得提取液通过弱极性的大孔树脂进行分离， 将提取液浓缩后全 说 明 书 CN 103845397 A 3 2/4 页 4 部上样， 先用蒸馏水淋洗， 续以不同含量的乙醇溶液分别洗脱， 浓缩回收乙醇洗脱液 ； D 富集 ： 将上述 C 步骤所得乙醇的洗脱液浓缩后， 上样于另一非极性大孔树脂精制， 采 用不同极性的洗脱液洗脱， 先用蒸馏水淋洗， 续以不同含量乙醇溶液分别洗脱， 浓缩回收乙 醇洗脱液， 并将其真空干燥， 得到苯乙醇苷的提取物 ； E 测定 ： 将富集得到的干燥产物进行水解， 使苯乙醇苷的提取物中的苯乙醇苷完全水 解释放出苯乙醇和肉桂酸类化合物 ； 水解后得到的。
13、溶液用甲醇稀释供液相色谱测定。 0008 对于本发明所述的方法， 具体优选方案如下 ： 本发明步骤 1） 提取 ： a 水提醇沉法 ： 称取药材粗粉， 加水煮 15 次， 合并水煮液， 浓缩至相对密度为 25 时 1.021.12， 加 50%90% 乙醇， 静置， 待完全沉淀后， 抽滤得上清液， 浓缩药液至密度 1.021.12 为备用 ； b 醇提水沉法 ： 称取药材粗粉， 加 60%95% 的乙醇回流 15 次， 合并醇煮液， 回收乙醇， 浓缩至相对密度为 1.021.12， 加 58 倍体积蒸馏水， 静置， 待完全沉淀后， 抽滤得上清液， 浓缩药液至密度 1.021.12 为备用。 0。
14、009 c 乙醇渗漉法 ： 称取药材粗粉， 加 30%85wt% 的乙醇浸泡， 收集渗滤液， 回收乙醇， 浓缩至相对密度为25时1.021.12， 加58倍体积蒸馏水， 静置， 待完全沉淀后， 抽滤得上 清液， 浓缩药液至密度 1.021.12 为备用。 0010 本发明步骤 2） 纯化 ： a 本发明将 1） a 或 b 或 c 提取液中加入药材粗粉质量 5%10% 的 CuSO4， 静置， 待沉淀完 全析出后， 倾出上清液， 药液浓缩至相对密度在 25时测 1.021.14， 备用。 0011 b 本发明将 1） a， b， c 提取液中加入药材粗粉质量 5%10% 的活性白土， 静置， 。
15、待沉 淀完全析出后， 倾出上清液， 药液浓缩至相对密度在 25时测 1.021.14， 备用。 0012 本发明步骤 3） 分离 ： 本发明将 2） 提取得到的药液通过大孔树脂， 本发明所用的第一个弱极性大孔树脂为 HPD-100， WLD， D-101， AB-8。 0013 用体积比 510 倍量的蒸馏水洗脱剂进行洗脱。 0014 用体积比 510 倍量的乙醇洗脱剂进行洗脱。 0015 乙醇洗脱液的含量为 30%50%。 0016 本发明步骤 4） 富集 ： 本发明将 3） 洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后， 再次通过非极性大孔树脂为 Diaion HP - 10、 - 20、 - 30、 - 4。
16、0、 - 50。 0017 用体积比 510 倍量的蒸馏水洗脱剂进行洗脱。 0018 用体积比 510 倍量的乙醇洗脱剂进行洗脱。 0019 乙醇洗脱液的含量为 50%70% 进行洗脱。 0020 本发明步骤 5） 测定 ： 本发明的测定方法适用于独一味原植物以及由原植物制备的提取物和制剂。 0021 本发明所述的液相色谱测定是在十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱 （ODS） 上进行 分离的， 色谱分离所用的流动相为甲醇 /10 mmol/L 磷酸二氢钾缓冲溶液 （30/70， V/V） ， 用 磷酸调节 pH 为 3.0， 添加四丁基溴化铵对离子试剂， 使流动相中四丁基溴化铵的浓度达到 说 明 。
17、书 CN 103845397 A 4 3/4 页 5 5100 mmol/L。流动相的流速为 1.0 ml/min。 0022 本发明所述的液相色谱测定是在紫外检测器上进行检测的， 检测使用的波长为 290nm。 0023 本发明采用不同极性大孔树脂进行分离纯化， 得到高含量的苯乙醇苷类化合物， 不仅解决传统生产工艺不能有效提取苯乙醇苷的困难， 而且实现独一味中苯乙醇苷的规模 化工业生产和进一步开发其生物活性提供原材料生产的技术保障。 本发明提供一种较纯的 独一味有效成分， 更好的控制产品质量， 并且提供苯乙醇苷的提取制备工艺。 0024 本发明提供的苯乙醇苷类物质的提取方法与现有方法相比具有。
18、如下优点 ： 本发明提供的方法可以得到产率为 50% 纯度较高的苯乙醇苷物质。提取采用的大孔树 脂可以活化后再生利用， 生产成本低 ； 提取过程中使用硫酸铜或活性白土助沉， 可以有效的 提高沉淀效率， 节省提取时间， 该方法易于实现工业化规模生产。 附图说明 0025 图 1 为六种对照品的高效液相色谱图。其中 ： 1. 羟基酪醇， 2. 高香草醇， 3. 3,4- 二甲氧基苯乙醇， 4. 咖啡酸， 5. 阿魏酸， 6. 3,4- 二甲氧基肉桂酸。 0026 图 2 为独一味原植物的高效液相色谱图。其中 ： 1. 羟基酪醇， 2. 高香草醇， 3. 3,4- 二甲氧基苯乙醇， 4. 咖啡酸， 。
19、5. 阿魏酸， 6. 3,4- 二甲氧基肉桂酸。 0027 色谱条件 ： 用 Waters 2487 色谱仪检测， Diamonsil C18 色谱柱 (5 m, 416 mm250 mm)， 流动相为甲醇-10 mM的磷酸二氢钾水溶液- ( 30:70, V/V)， 用磷酸调节pH 为 3.0， 添加 60 mM 四丁基溴化铵对离子试剂， 检测波长为 290 nm， 流速为 1.0 mL/min。 0028 具体实施方式 本发明将通过具体实施例进行详细的描述。 0029 实施例 1 准确称取 100.0 g 粉碎的独一味全草加入到 2000 mL 烧瓶中， 用 1000 mL 60% 乙醇加。
20、 热回流提取， 共提取 3 次。将 3 次所得的提取液合并， 浓缩后加入 800 mL 的蒸馏水， 加入 5 g 的硫酸铜， 静置过夜， 用布氏漏斗过滤后， 旋转蒸发仪蒸馏浓缩至 100 mL， 所得药液通过 AB-8 大孔树脂吸附， 待样品全部通过树脂柱后， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 直至洗脱液 无色, 续以1000 mL 30%的乙醇溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩至100 mL， 再上样于 Diaion HP - 10 树脂， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 续以 1000 mL 50% 的乙醇 溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩后得干燥产。
21、物， 液相色谱定量分析苯乙醇苷 的含量为 50.2%。 0030 实施例 2 准确称取 100.0 g 粉碎的独一味全草加入到 2000 mL 烧瓶中， 用 1000 mL 蒸馏水水加 热回流提取， 共提取 3 次。将 3 次所得的提取液合并， 浓缩后加入 800 mL 的 80% 乙醇， 加入 5 g的活性白土， 静置过夜， 用布氏漏斗过滤后， 旋转蒸发仪蒸馏浓缩至100 mL， 所得药液通 过 DM130 大孔树脂吸附， 待样品全部通过树脂柱后， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 直至洗 脱液无色, 续以1000 mL 30%的乙醇溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩至10。
22、0 mL， 再上样于 Diaion HP - 30 树脂， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 续以 1000 mL 60% 的乙 醇溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩后得干燥产物， 液相色谱定量分析苯乙醇 说 明 书 CN 103845397 A 5 4/4 页 6 苷的含量为 40.8%。 0031 实施例 3 准确称取 100.0 g 粉碎的独一味全草加入到 2000 mL 烧瓶中， 用 1000 mL 60% 乙醇渗 漉， 提取液浓缩后加入800 mL的蒸馏水， 加入5 g的硫酸铜， 静置过夜， 用布氏漏斗过滤后， 旋转蒸发仪蒸馏浓缩至 100 mL， 所得药液通过 D。
23、101 大孔树脂吸附， 待样品全部通过树脂柱 后， 用1000 mL蒸馏水冲洗树脂柱， 直至洗脱液无色, 续以1000 mL 40%的乙醇溶液进行洗 脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩至 100 mL， 再上样于 Diaion HP - 10 树脂， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 续以1000 mL 60%的乙醇溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓 缩后得干燥产物， 液相色谱定量分析苯乙醇苷的含量为 32.9%。 0032 实施例 4 准确称取 100.0 g 粉碎的独一味全草加入到 2000 mL 烧瓶中， 用 1000 mL 80% 乙醇加 热回流提取， 共提取 3 次。
24、。将 3 次所得的提取液合并， 浓缩后加入 800 mL 的蒸馏水， 加入 10 g的活性白土， 静置过夜， 用布氏漏斗过滤后， 旋转蒸发仪蒸馏浓缩至100 mL， 所得药液通过 AB-8 大孔树脂吸附， 待样品全部通过树脂柱后， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 直至洗脱液 无色, 续以1000 mL 20%的乙醇溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩至100 mL， 再上样于 Diaion HP - 10 树脂， 用 1000 mL 蒸馏水冲洗树脂柱， 续以 1000 mL 50% 的乙醇 溶液进行洗脱， 回收乙醇洗脱液， 将洗脱液浓缩后得干燥产物， 液相色谱定量分析苯乙醇苷 的含量为 53.1%。 说 明 书 CN 103845397 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103845397 A 7 。