一种木本药用植物愈伤组织的发生和生长的培养基及其应用.pdf

本发明通过精心设计和多次筛选提供一种促进木本药用植物愈伤组织发生和生长的培养基，克服了木本植物愈伤组织诱导难、生长慢、褐化严重的技术缺陷，为大规模培养木本药用植物愈伤组织提供了技术基础。所述的培养基包括以下成分：无机盐A、无机盐B、有机化合物、1.0mg/L6苄基嘌呤(6BA)和0.1mg/L萘乙酸（NAA）、30000mg/L蔗糖、7000mg/L琼脂、50-150mg/L水溶性碳纳米管。本发明所得到的培养基除了诱导药用植物金银花和小桐子叶片外植体，还能有效地诱导其它木本植物包括七叶莲，榕树，沙漠玫瑰，长青藤等叶片外植体产生愈伤组织，促进愈伤组织生长。因此适应于多种植物。

1.一种木本药用植物愈伤组织的发生和生长的培养基，其特征在于所述培养基包括以下组分组成：无机盐A、无机盐B、有机化合物、1.0 mg/L 6苄基嘌呤和0.1 mg/L 萘乙酸、30000 mg/L蔗糖、7000 mg/L琼脂、50-150 mg/L水溶性碳纳米管，其中无机盐A、无机盐B和有机化合物分别由下表所示的组分构成：无机盐A ；无机盐B；有机化合物。 2.一种木本药用植物愈伤组织的发生和生长的培养基的应用，其特征在于利用权利要求1所述的培养基促进木本药用植物愈伤组织的发生和生长，培养基的pH值范围在5.5-6.0之间。

技术领域

本发明属于植物生长领域，尤其涉及一种促进植物愈伤组织发生和生 长的培养基。

背景技术

植物中含有丰富的次生代谢物质可以为人类提供药品、色素、调味品 、香料、兴奋剂、杀虫剂等。仅就药物而言，全球约75％的人口依靠 植物来防病治病。美国现有120多种处方药是植物药，欧洲也约有1／ 4的处方药来自植物。迅速兴起的植物细胞大规模培养技术是保存和发 展中药材的一种有效途径。使用细胞大规模培养技术可以在可控的和 可重复的条件下生产天然药物，而不会受到病虫害、地理、气候季节 等因素的影响，并且产物分离、提取操作简单。

细胞培养首先要从完整植物器官中分离出细胞，愈伤组织是得到细胞 的有效途径。愈伤组织培养是从母体植株的叶片、茎或其他器官得到 外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育。 愈伤组织的诱导就是使已分化的植物细胞脱离原来的发育轨道，失去 原有状态和功能，恢复到未分化的状态的过程。植物细胞形成愈伤组 织经历三个时期：诱导期、分裂期、分化期。诱导期是细胞正在准备 分裂的时期。其主要目的是通过一些刺激因子和激素的诱导使原本处 于静止期的细胞合成代谢活化，进而发生分裂。分裂期是指细胞通过 分裂不断增生子细胞的过程。从愈伤组织培养得到的细胞进行继代培 养、靠大量的细胞增殖来获得有用的次生代谢物质。继代培养可以在 固体或液体培养基中进行。

作为建立细胞培养的前提和基础，愈伤组织的诱导和生长至关重要。 在不同种类的药用植物中，木本植物愈伤组织的诱导和生长比草本植 物困难。本发明提供一种促进木本药用植物愈伤组织形成和生长含碳 纳米管的培养基。本发明的培养基含去离子水、无机盐、有机物、碳 管纳米，植物生长调节剂和培养体的支持材料，能够诱导100% 金银 花（Lonicera japonica ）和小桐子又名麻风树（Jatropha curc as）叶片外植体产生愈伤组织。金银花愈伤组织生长在含100 mg/L碳 纳米管培养基上的增殖比对照（同样培养基但不含碳纳米管）高58.6 %。小桐子愈伤组织在含100 mg/L碳纳米管的培养基增殖比对照高56 %。本发明为利用碳纳米管促进愈伤组织的发生和生长提供了新的信息 、为利用该培养基来培养大量细胞以及次生代谢物质打下了良好的基 础。

发明内容

本发明通过精心设计和多次筛选提供一种促进木本药用植物愈伤组织 发生和生长的培养基，克服了木本植物愈伤组织诱导难、生长慢、褐 化严重的技术缺陷，为大规模培养木本药用植物愈伤组织提供了技术 基础。

实现本发明目的的技术解决方案是： 一种木本药用植物愈伤组织的 发生和生长的培养基，所述的培养基包括以下成分：无机盐A、无机盐 B、有机化合物、1.0 mg/L 6苄基嘌呤(6BA)和0.1 mg/L 萘乙酸（ NAA）、30000 mg/L蔗糖、7000 mg/L琼脂、 50-150 mg/L水溶性 碳纳米管，其余为去离子水，其中无机盐A、无机盐B和有机化合物分 别由下表所示的组分构成：

表1. 无机盐A 

成分 浓度 (mg/L) 硝酸铵 1000 磷酸二氢钾 250 硝酸钾 1000 氯化钾 500 硝酸钙 1000 硫酸镁 500

表 2. 无机盐B

成分 浓度 (mg/L) 六水硝酸锌 15.0 一水硫酸锰 20.0 硼酸 5.0 五水硫酸铜 0.25 Na2-EDTA  40.0 七水硫酸铁 30.0 硅酸 50.00 钼酸钠 0.25 六水氯化钴 0.025 六水硫酸镍 0.005

表 3. 有机化合物

成分 浓度 (mg/L) 盐酸硫胺素（维生素B1） 0.1 盐酸吡哆醇（维生素B6） 0.5 烟酸（维生素B5） 0.5

一种木本药用植物愈伤组织的发生和生长的培养基的应用，所述的培 养基促进木本药用植物愈伤组织的发生和生长，培养基的pH值范围在 5.5-6.0之间。

本发明的创新在于：

1）实质性的将碳纳米管用于植物组织培养，开发出一种促进木本植物 愈伤组织发生和生长的培养基。碳纳米管在植物生物学上的应用是目 前纳米生物学研究的前沿课题之一。我们认为碳纳米管穿破外植体细 胞壁，加快了水分和植物生长调节剂进入细胞内的速度，加速了脱分 化过程，使脱分化的细胞尽快恢复其全能性，转变为分生细胞，继而 其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从愈伤组织诱导的结 果，即外植体愈伤组织诱导率达100%但愈伤组织发生的时间比对照提 前7天，证明了这一观点。至于促进愈伤组织生长，除了碳纳米管穿破 外植体细胞壁、碳纳米管巨大的表面积加快植物生长调节剂进入细胞 内促进细胞分裂外，本发明所创造的适应愈伤组织生长的营养和生长 激素环境也起到了很大作用。

2）本发明所创造的适应愈伤组织生长的营养环境是降低了硝酸铵，硫 酸、钙和锰的浓度，提供了植物各种必需和有益元素，包括镍、钴和 硅。它与常见的MS (Murishige and Skoog， 1962), WPM (Li oyd and McCown， 1981), DKW (Drive and Kuniyuki， 19 84)不同，对无机盐的浓度进行了特别筛选和搭配，使其环境特别适应 于木本植物愈伤组织形成和生长。

3）本发明所创造的适应愈伤组织生长的生长激素环境是通过对不同细 胞分裂素和生长素的筛选，得到并优化出1.0 mg/L 6-苄基嘌呤和0 .1 mg/L萘乙酸搭配。

本发明的有益效果在于：

1）开发出一种促进木本药用植物愈伤组织发生和生长的培养基，本培 养基制备方法简单，且制备过程无污染；

2）本发明所得到的培养基除了诱导药用植物金银花和小桐子叶片外植 体，还能有 效地诱导其它木本植物包括七叶莲，榕树，沙漠玫瑰，长青藤等叶片 外植体产生愈伤组织，促进愈伤组织生长。因此适应于多种植物。

3）本发明所得到的培养基将为细胞培养生产植物次生代谢物质提供了 良好的基础。

附图说明

图1为本发明所述培养基对小桐子愈伤组织生长的培养情况。

具体实施方式

本发明所述的促进木本药用植物愈伤组织发生和生长的培养基主要由 以下方法制得：以配1L培养基为例：取600ml去离子水，首先加入表1 所示无机盐A(硝酸铵、磷酸二氢钾、硝酸钾、氯化钾、硝酸钙、硫酸 镁)、表2所示无机盐B(六水硝酸锌、一水硫酸锰、硼酸、五水硫酸铜 、Na2-EDTA、七水硫酸铁、硅酸、钼酸钠、六水氯化钴、六水硫酸镍 )搅拌使之溶解，再加入30000 mg/L 蔗糖、50、100或150 mg/L水 溶性碳纳米管（市售）和加热溶解后的7000 mg/L 琼脂，补足去离 子水至1L，用1 M KOH调节pH值至5.8。将配置的培养基装入2L三角 瓶，封口，在121 oC， 0.1Mpa下灭菌20分钟。将灭菌后的三角瓶置 于加温水浴锅内（水浴锅温度设在50-60 oC）。将过滤灭菌后的植物 生长调节剂6-苄基嘌呤（最终浓度1.0 mg/L）和萘乙酸（最终浓度0 .1 mg/L）和表3所示有机化合物（盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸盐 酸硫胺素）加入高压灭菌过的尚未凝固的培养基中，混匀后分装于培 养皿或者培养瓶 （每培养皿或瓶20-30 mL）。这一过程应在超净工 作台中进行，避免培养基被污染。对照培养基配置不含水溶性碳纳米 管（见实施例1）。具体的配方见表4：

表4. 实施例中促进木本植物愈伤组织发生和生长的培养基组分及其 组成含量   

愈伤组织诱导：

（1）外植体：从金银花和小桐子树上取当年生嫩枝或一年生枝条，剪 下叶片，在自来水中冲洗1小时。在超净工作台中用75％酒精喷湿叶片 正反面，再用20%漂白液（含1.2%（NaOCl）浸泡20分钟，最后用无菌 水冲洗数次，将叶片剪成1平方厘米的方块。

以备接种。

（2）愈伤组织诱导：将外植体平面放在培养皿或者培养瓶的培养基上 ，封口，放在特定的组织培养室内，温度25 oC，暗培养两周，然后 置于光下培养： 50mol/m2/s的光照，12小时光周期。

（3）结果：金银花和小桐子叶片外植体愈伤组织诱导率达100%, 即 不管是外植体在对照培养基还是在含50-150 mg/L碳纳米管的培养基 上上培养，所有外植体都产生了愈伤组织。不同的是外植体培养在碳 纳米管培养基上产生愈伤组织的时间比对照提前7天。

愈伤组织生长：

各实施例在不同植物的愈伤组织生长结果见表5和6。

表5. 促进金银花愈伤组织生长

碳纳米管浓度（mg/L） 愈伤组织接种时重量 (g) 生长28天后的鲜重 （g） 28天后愈伤组织干重 (g) 实施例1 2.0 28.23 0.6245 实施例2 2.0 32.48 0.7345 实施例3 2.0 44.76 0.9946 实施例4 2.0 41.52 0.9458

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表 6. 促进小桐子愈伤组织生长

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表5总结的是金银花愈伤组织生长。以鲜重计算，金银花愈伤组织在对 照培养基（实施例1）上经过28天的生长增加了14.1倍；在含50 mg/ L 碳纳米管的培养基（实施例2）上增加了16.24倍；在含100 mg/L  碳纳米管的培养基（实施例3）上增加了22.38倍；在含150 mg/L  碳纳米管的培养基（实施例4）上增加了20.76倍。这说明碳纳米管浓 度150 mg/L并没有更进一步促进愈伤组织生长。金银花愈伤组织生长 数据表明，与对照相比，金银花愈伤组织生长在100 mg/L 碳纳米管 培养基上、鲜重增加了58.6%，干重增加了59.3%。

小桐子愈伤组织生长的数据展示在表6。图1中，愈伤组织在对照培养 基(实施例1)上经过21天生长其鲜重天生长其鲜重增加了17.5倍；在含 有50 mg/L碳纳米管培养基上鲜重增加到22.8倍；在含有100 mg/L碳 纳米管培养基(实施例2)上鲜重增加了27.4倍；在含有150 mg/L碳纳 米管培养基(实施例3)上鲜重增加了26.9倍。与金银花愈伤组织生长相 似，碳纳米管浓度升至150 mg/L(实施例4)并没有明显促进愈伤组织 生长。与对照相比，小桐子愈伤组织长在100 mg/L 碳纳米管培养基 鲜重和干重分别增加了56%。