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1、10申请公布号CN104059378A43申请公布日20140924CN104059378A21申请号201410302036522申请日20140627C09B57/02200601C09K11/06200601G01N21/6420060171申请人安徽大学地址230601安徽省合肥市经济技术开发区九龙路111号72发明人孟祥明尹海静王训明郭蒙蒙韦新洁朱满洲冯燕74专利代理机构安徽省合肥新安专利代理有限责任公司34101代理人乔恒婷54发明名称一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法57摘要本发明公开了一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料，其结构通式为其中R为CH3O或CH。
2、32N。本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构，具有有效的双光子吸收截面，可以被双光子激发产生荧光，具有低的细胞毒性，可以进入细胞，用于细胞生物成像。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图3页10申请公布号CN104059378ACN104059378A1/1页21一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料，其特征在于其结构通式为其中R为CH3O或CH32N。2一种权利要求1所述的六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的制备方法，其特征在于按以下步骤操作1将96ML浓度为1M的ICL冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中。
3、，加入008MOL水杨醛，40反应48H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体1；2将20MMOL中间体1、24MMOL丙二酸二乙酯、02ML哌啶以及5滴冰乙酸加入50ML乙醇中，回流反应5H，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体2；3将6MMOL中间体2、72MMOL化合物A、006MMOLPDCL2PPH32以及012MMOLCUI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ML三乙胺和30ML四氢呋喃，室温搅拌反应3H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离得到目标产物；所述化合物A为对甲氧基苯乙炔。
4、或4二甲基氨基苯乙炔。权利要求书CN104059378A1/4页3一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法一、技术领域0001本发明涉及一种荧光染料及其制备方法，具体地说是一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法，属于双光子荧光生物成像领域。二、背景技术0002荧光成像技术相对其他成像技术如核磁共振成像，正电子发射断层成像，超声成像等具有极大的优越性，能够无损实时动态监测活体体内的活动及反应，在基因表达，肿瘤监测药物筛选等方面具有很大应用潜力。0003双光子荧光显微成像具有红外激发，成像深度深，降低组织自发荧光干扰，避免荧光漂白和光致毒等特点而显著的优于单光子荧光显微成。
5、像。0004香豆素衍生物具有水溶性好，低细胞毒性，生物兼容性好，斯托克位移大等优点，经常被于生物荧光成像信号系统。但是在双光子荧光领域还很少被报道。因此设计并合成香豆素衍生物的双光子荧光染料具有很好的应用前景。三、发明内容0005本发明旨在提供一种六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法，本发明香豆素衍生物双光子荧光染料具有低的细胞毒性，可以用于双光子荧光生物成像。0006本发明六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的结构通式如下00070008其中R为CH3O或CH32N。0009本发明六位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的制备方法如下00101将ICL溶于冰乙酸中配制得到1M的ICL。
6、冰乙酸溶液，将96ML配制的ICL冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入976G008MOL水杨醛，40反应48H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体1；00112将5G20MMOL中间体1、39G24MMOL丙二酸二乙酯、02ML哌啶以及5滴冰乙酸加入50ML乙醇中，回流反应5H，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体2；00123将2G6MMOL中间体2、72MMOL化合物A、42MG006MMOLPDCL2PPH32以及23MG012MMOLCUI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ML三乙胺和30ML。
7、四氢呋说明书CN104059378A2/4页4喃，室温搅拌反应3H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析分离洗脱液按体积比为乙酸乙酯石油醚13得到目标产物；0013所述化合物A为对甲氧基苯乙炔或4二甲基氨基苯乙炔。0014合成路线如下00150016与已有技术相比，本发明的有益效果体现在0017本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构，具有有效的双光子吸收截面，可以被双光子激发产生荧光，低的细胞毒性，可以进入细胞，进行细胞成像。四、附图说明0018图1A是实施例1制备的荧光染料1的单晶结构图。图1B是实施例2制备的荧光染料2的单晶结构图。0019图2是本发明荧光染料1图A和荧光染料2图。
8、B在细胞培养24小时后的细胞存活率。从图2中可以看出，浓度为10M时，细胞存活率还有90左右，说明了本发明荧光探针分子对细胞无毒性作用，因此可以用来做细胞成像。0020图3是本发明荧光染料的双光子荧光共聚焦成像照片，其中图A为荧光染料110M在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液PH74冲洗3次，在双光子荧光共聚焦显微成像，在700NM激发下，荧光发射收集范围450490NM；图B为CHO细胞明场；图C为荧光染料210M在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液PH74冲洗3次，在双光子荧光共聚焦显微成像，在740NM激发下，荧光发射收集范围500540NM。图D为CHO细胞明场。五、具体实施方式00。
9、21实施例100221、中间体1的合成0023将ICL溶于冰乙酸中配制得到1M的ICL冰乙酸溶液，将96ML配制的ICL冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入976G008MOL水杨醛，40反应48H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体1178G0072MOL，产率90。00241HNMR400MHZ,CDCL31095S,1H,983S,1H,784D,J20HZ,1H,776DD,J88,20HZ,1H,680D,J88HZ,1H13CNMR101MHZ,CDCL319540,16120,14528,14185,12256,12。
10、019,8038说明书CN104059378A3/4页500252、中间体2的合成0026将5G20MMOL中间体1、39G24MMOL丙二酸二乙酯、02ML哌啶以及5滴冰乙酸加入50ML乙醇中，回流反应5H，反应结束后冷却至室温，析出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体264G188MMOL，产率94。00271HNMR400MHZ,CDCL3842S,1H,794D,J18HZ,1H,789DD,J87,19HZ,1H,713D,J87HZ,1H,442Q,J71HZ,2H,141T,J71HZ,3H13CNMR101MHZ,CDCL316265,15595,15467,14695,14265。
11、,13766,11989,11930,11875,8743,6222,142100283、目标产物的合成0029将2G6MMOL中间体2、092G72MMOL对甲氧基苯乙炔、42MG006MMOLPDCL2PPH32以及23MG012MMOLCUI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ML三乙胺和30ML四氢呋喃，室温搅拌反应3H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析100200目硅胶，洗脱液按体积比为乙酸乙酯石油醚13，得到目标产物194G，产率96，记为荧光染料1，结构式如下003000311HNMR400MHZ,CDCL3848S,1H,774D,J18HZ,1H,772S,1H74。
12、8D,J84HZ,2H,733D,J91HZ,1H,690D,J84HZ,2H,443Q,J71HZ,2H,384S,3H,142T,J71HZ,3H13CNMR101MHZ,CDCL316292,16004,15631,15434,14792,13704,13317,13194,12080,11900,11792,11704,11449,11415,9074,8583,6214,5536,14230032实施例200331、中间体1的合成0034将ICL溶于冰乙酸中配制得到1M的ICL冰乙酸溶液，将96ML配制的ICL冰乙酸溶液置于圆底烧瓶中，加入976G008MOL水杨醛，40反应48H，。
13、反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将余下的液体倒入硫代硫酸钠的水溶液中，析出淡黄色固体，抽滤并干燥后得到中间体1178G0072MOL，产率90。00351HNMR400MHZ,CDCL31095S,1H,983S,1H,784D,J20HZ,1H,776DD,J88,20HZ,1H,680D,J88HZ,1H13CNMR101MHZ,CDCL319540,16120,14528,14185,12256,12019,803800362、中间体2的合成0037将5G20MMOL中间体1、39G24MMOL丙二酸二乙酯、02ML哌啶以及5滴冰乙酸加入50ML乙醇中，回流反应5H，反应结束后冷却至室温，析。
14、出白色固体，抽滤并干燥后得到中间体264G188MMOL，产率94。说明书CN104059378A4/4页600381HNMR400MHZ,CDCL3842S,1H,794D,J18HZ,1H,789DD,J87,19HZ,1H,713D,J87HZ,1H,442Q,J71HZ,2H,141T,J71HZ,3H13CNMR101MHZ,CDCL316265,15595,15467,14695,14265,13766,11989,11930,11875,8743,6222,142100393、目标产物的合成0040将2G6MMOL中间体2、105G72MMOL4二甲基氨基苯乙炔、42MG006M。
15、MOLPDCL2PPH32以及23MG012MMOLCUI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ML三乙胺和30ML四氢呋喃，室温搅拌反应3H，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析100200目硅胶，洗脱液按体积比为乙酸乙酯石油醚13，得到目标产物206G，产率95，记为荧光染料2，结构式如下004100421HNMR400MHZ,CDCL3848S,1H,773D,J79HZ,1H,772S,1H,741D,J83HZ,2H,731D,J86HZ,1H,667D,J83HZ,2H,443Q,J71HZ,2H,301S,6H,142T,J71HZ,3H13CNMR101MHZ,CDCL31。
16、6299,15644，15405,15040，14807,13697,13283,13161,12143,11885,11789,11693,11178,10893,9213，8520，6210,4018,14240043实施例3单晶培养0044将实施例1、2制备的荧光染料1和荧光染料2分别溶于二氯甲烷中，浓度接近饱和03MOL/L，缓慢加入甲醇，二氯甲烷和甲醇的体积比为14，室温培养48H。0045实施例4细胞毒性测试0046MTT34，5二甲基噻唑22，5二苯基四氮唑溴盐实验是根据已报道的文章，做细胞毒性测试。分别在两批细胞中加入10，30，50M的荧光染料1和荧光染料2，在37、含5CO。
17、2的细胞培养箱中孵育24小时，根据细胞存活度的公式细胞存活率OD570样品/OD570对照组100，可算得细胞存活率图2。从图2中我们可以看出，浓度为10M时，加入荧光染料1和荧光染料2的细胞存活率还有90左右，说明了荧光染料1和荧光染料2对细胞无毒性作用，因此可以用于双光子荧光成像。0047实施例5双光子荧光共聚焦成像0048CHO细胞由DEMEINVITROGEN培养液培养，成像前一天，CHO细胞种于荧光成像平底表面皿中，贴壁之后向两皿CHO细胞分别加入10M的荧光染料1和荧光染料2的DMSO溶液，于37、含5CO2的细胞培养箱中孵育05小时，用中性的PBS缓冲溶液或无血清培养基充分洗涤后，用荧光共聚焦成像，得图3A，3C。说明荧光染料1和荧光染料2可以进入细胞，被双光子激发，成像细胞。说明书CN104059378A1/3页7图1A图1B说明书附图CN104059378A2/3页8图2A图2B说明书附图CN104059378A3/3页9图3说明书附图CN104059378A。