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1、10申请公布号CN104069836A43申请公布日20141001CN104069836A21申请号201310106745122申请日20130329B01J20/26200601B01J20/28200601G01N1/4020060171申请人中国科学院大连化学物理研究所地址116023辽宁省大连市中山路457号72发明人张丽华杨开广刘键熙吴琪邓楠赵群周愿梁振张玉奎74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人马驰54发明名称一种基于聚合物相反转自组装分子印迹微球材料及其应用57摘要本发明涉及一种用于目标蛋白质选择性识别的分子印迹微球材料及其制备过程。所述的分子印迹微球材。
2、料是以高分子材料为基质材料，目标蛋白质上的一段肽段为模板分子，采用聚合物相反转自组装的方式制备微球。并且将该制备材料用于复杂样品中蛋白质的选择性识别。51INTCL权利要求书1页说明书4页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页10申请公布号CN104069836ACN104069836A1/1页21一种基于聚合物相反转自组装分子印迹微球材料，其特征在于采用聚合物为基质材料，以含有240个氨基酸的肽段为模板分子，通过聚合物相反转自组装制备肽段印迹的聚合物微球材料，并用于含240个氨基酸的肽段对应的蛋白质的选择性识别。2按照权利要求1所述的分子印迹。
3、微球材料，其特征在于作为基质材料的聚合物为聚醚砜、聚砜、聚醚砜酮中的一种或二种以上。3按照权利要求1所述的分子印迹微球材料，其特征在于作为模板分子的240个氨基酸的肽段为天然存在的蛋白质上的一段序列或者为天然存在的蛋白质上的抗原决定基肽段序列。4按照权利要求1所述的分子印迹微球材料，其特征在于聚合物相反转自组装过程，将聚合物、模板分子分散于有机溶液中，通过75M10MM的针头将溶液逐滴滴入聚合物的非溶剂相中，进而起到对聚合物、模板分子固化成球的作用；随后用水将有机溶液置换出来，并用醇类或者醇类与乙酸混合溶液（醇类体积百分数为40100）从固化微球把模板分子洗脱出来，进而制得了分子印迹材料。5按。
4、照权利要求4所述的分子印迹微球材料，其特征在于所述的有机溶液为对聚合物的溶解度大于1的有机溶液；并且能够与聚合物的非溶剂任意比例互溶的有机溶液；有机溶液为二甲基亚砜，N，N二甲基甲酰胺，N，N二甲基乙酰胺，N甲基吡咯烷酮以及以上物质两种及多种混合物。6按照权利要求4所述的分子印迹微球材料，其特征在于所述的聚合物、模板分子和有机溶液组成的三元体系中，按质量计聚合物占三元体系的150；模板分子占三元体系的0525；有机溶液占三元体系的3090。7按照权利要求4所述的分子印迹微球材料，其特征在于所述的非溶剂相特征在于可以为单一溶液也可以为混合溶液，且能够与聚合物的非溶剂能够任意比例互溶。聚合物的非溶。
5、剂为水，甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，1,4丁二醇中一种或以及以上物质两种以上的混合物。8一种权利要求1所述的基于聚合物相反转自组装分子印迹微球材料用于生物样品中目标蛋白质的选择性富集。权利要求书CN104069836A1/4页3一种基于聚合物相反转自组装分子印迹微球材料及其应用技术领域0001本发明属于高分子材料制备技术及其在蛋白质识别中的应用，具体的说是一种基于聚合物相反转自组装分子印迹微球材料。背景技术0002分子印迹技术是通过模仿生命过程中的分子识别过程，采用人工合成方法，制备对目标分子具有高选择性识别能力的材料的技术。自1993年KLAUSMOSBACH等在NATURE上发表有关利。
6、用非共价键合成茶碱分子印迹聚合物的报道之后，分子印迹材料作为一种人工合成高选择性材料迅速进入全球众多科学家的视野。目前，针对有机小分子和金属离子的印迹工作已取得了巨大的进展，实验方法和评价标准渐趋成熟，并已开始应用于临床分析、催化合成等领域（CHENLX,CHEMICALSOCIETYREVIEWS,40,2011,29222942）。在这些方面，分子印迹材料和天然分子识别系统相比，不仅具有高效选择性，并且对各种物理和化学影响因素具有很高的耐受力，而且还可以重复使用，弥补了天然识别体系在使用过程中的诸多不足。与此同时，当小分子印迹的研究逐渐成熟的时候，分子印迹的研究开始转向生物大分子（尤其是蛋。
7、白质）印迹。这向其最初创立时的梦想，“人工合成抗体”，又迈进了一步。目前文献报道的蛋白质印迹聚合物制备方法主要包括3D分子印迹法（包埋法）、2D分子印迹法（表面印迹法）、金属螯合印迹方法、LANGMUIR单层膜印迹法、表面微接触印迹方法等（YANGKGETAL,ANALYTICALANDBIOANALYTICALCHEMISTRY,403,2012,217383）。但是，当前这些分子印迹材料都以聚合反应为基础形成印有蛋白质识别位点的聚合物材料。由于聚合反应中常常涉及热、紫外光照、强氧化还原反应等易将蛋白质分子变性的条件，从而降低印迹聚合物的特异识别性。此外，在这些印迹中常常以蛋白质为模板分子，。
8、但是由于蛋白质模板分子难以获得、价格昂贵，因此限制了蛋白质印迹材料的使用SELLERGREN,BNATURECHEMISTY,2,2010,7。0003因此，我们以蛋白质上的抗原决定基肽段或者蛋白质序列上的连续氨基酸序列为参照，人工合成相同的多肽，并以此为模板，通过条件温和的聚合物相反转自组装技术，在常温下制备用于蛋白质选择性识别的分子印迹微球材料。发明内容0004采用聚合物为基质材料，以蛋白质序列上的一段肽段序列为模板分子，通过聚合物相反转自组装技术制备肽段印迹的聚合物微球材料，并将此肽段印迹的聚合物微球材料用于肽段对应蛋白质的选择性识别。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为0005（1）。
9、制备聚合物模板分子有机溶液组成的三元分散体系，其中聚合物占三元体系的150；模板分子占三元体系的0525；有机溶液占三元体系的1090。0006（2）在室温下，将聚合物模板分子有机溶液组成的三元分散体系通过75M10MM的针头将溶液逐滴滴入聚合物的非溶剂相中，由于聚合物在非溶剂相中不溶，非溶剂与溶解聚合物的有机溶液可以互溶，因此聚合物和模板分子相反转固化成球。说明书CN104069836A2/4页40007（3）将制得的微球放入水中以除去其中残留的有机溶剂。0008（4）并用醇类溶液/乙酸（醇类体积百分数为40100）将模板从固化微球中洗脱出来，并且更换浸提液，直至在紫外可见分光光度计上检测不。
10、到模板分子为止，以得到印迹微球（MIP）。以相同的步骤，在预组装体系中不加入模板，制得非印迹微球（NIP）。0009（5）将该微球材料用于标准模板以及对应蛋白质的识别，并用于实际样品中模板肽段对应蛋白质的选择性识别。0010本发明具有如下优点00111本发明采用条件温和的相反转自组装技术制备分子印迹材料，有利于保持生物分子的构象。00122本发明采用人工合成肽段，而不是蛋白，作为模板分子制备识别蛋白的材料，解决了蛋白质印迹中模板分子难以获得、价格昂贵的问题。00133相反转自组装技术制备肽段印迹微球材料，制备过程简易、重现性好、有利于蛋白质分子印迹材料的大规模制备和使用。00144以聚醚砜、聚。
11、砜、聚醚砜酮等聚合物作为自组装的基质材料，不仅有利于自组装微球的形成；更因其优异的生物相容性，有利于降低基质材料对蛋白质的非特异性吸附。附图说明0015图1聚合物相反转自组装分子印迹微球材料（MIP）（A,B,C）以及非印迹微球材料（NIP）（D,E,F）的电镜照片；0016图2聚合物相反转自组装分子印迹微球材料（MIP）以及非印迹微球材料（NIP）对模板（A）以及转铁蛋白（B）的吸附动力学曲线。具体实施方式实施例0017（1）基于聚合物相反转自组装分子印迹微球材料的制备0018在自组装法制备抗原决定基印迹聚醚砜（PES）微球的过程中，200MGPES、30MG转铁蛋白抗原决定基（MRLAVG。
12、ALL），23MG粒径为20NM的磁球，分散于800MGDMAC中形成混合溶液。然后，在室温下，将PES转铁蛋白抗原决定基DMAC预组装体系逐滴滴入水中中自组装成球。之后，将制得的微球放入水中以除去其中残留的DMAC。然后，用甲醇/乙酸溶液（醇类体积百分数为90）将模板分子从微球中提取出来，并且经常更换浸提液，直至在紫外可见分光光度计（CARY60,AGILENT公司）上检测不到模板分子为止，以得到印迹微球（MIP）。以相同的步骤，在预组装体系中不加入模板，制得非印迹微球（NIP）。图1（A,B,C）是MIP横截面的扫描电镜照片,在图A中，看到了在PES内部的多孔结构，许多大孔分布其间。在图B。
13、中，微球边缘部位被放大1000倍，看到PES的皮层，以及在皮层下面的指状结构，这是典型的PES相分离自组装结构。在图1C中，微球内部被放大5000倍，我们看了微球微观的多孔结构。图1（D,E,F）是NIP的扫描电镜照片，分别对应其横截面大孔、皮层下相分离指状结构、以及微观多孔结构。00192自组装分子印迹微球材料对抗原决定基及对应蛋白质的识别性能考察0020自组装印迹微球对转铁蛋白抗原决定基以及转铁蛋白的识别实验在25C，水中进行的。在实验中，将15MG的印迹微球和空白对照微球分别加入到3ML，025MG/ML的转铁说明书CN104069836A3/4页5蛋白抗原决定基以及转铁蛋白溶液中，在不。
14、同时间，检测溶液中相应分子浓度。如图2显示了自组装MIP对抗原决定基（A）以及对应蛋白（B）的识别能力，在孵育70小时后，对抗原决定基的识别因子能够达到412，对转铁蛋白的识别因子能够达到295，MIP对蛋白的吸附容量可以达到2062MG/G。00213自组装分子印迹微球材料在混合蛋白中的选择性0022在含有转铁蛋白（TRF）、核糖核酸酶B（RNB）、细胞色素C（CYC）以及乳球蛋白（LACT）混合水溶液中（各种蛋白的浓度均为025MG/M），吸附90小时，验证分子印迹微球的选择性。实验结果显示（如表1所示）自组装印迹微球对TRF，RNB，CYC以及LACT的识别系数分别是014,005,24。
15、3,125。印迹材料对TRF的最大识别系数，说明了由抗原决定基位点的位点对相应蛋白质的选择性。0023（4）自组装分子印迹微球材料在实际样品中对目标蛋白质的识别0024将自组装分子印迹微球材料（MIP）以及非印迹微球材料（NIP）分别与3ML稀释了50倍的人血浆蛋白共同孵育72小时。分别取1ML孵育结束的上清液，首先通过90C热变性，随后二硫苏糖醇还原，碘代乙酰胺烷基化，再后按照蛋白/酶251的比例加入胰蛋白酶，在37C过夜酶解后，对酶解肽段进行除盐，随后用RPLCESIMS/MS对酶解肽段进行分离鉴定。随后，用基于二级谱峰强度的丰度表示方法，SIN，对鉴定到的蛋白质进行无标定量。如表2所示，。
16、通过对上清液中前十种高丰度蛋白质进行定量分析，发现印迹材料在实际样品体系中对目标蛋白质有着显著的选择性，印迹材料致使的目标蛋白质SIN变化是空白材料引起的目标蛋白质SIN变化的616倍，远高于血浆中其他蛋白质。0025表1聚合物相反转自组装分子印迹微球材料（MIP）以及非印迹微球材料（NIP）在蛋白质混合溶液中的选择性吸附00260027吸附量材料吸附蛋白量/原始溶液中蛋白量0028表2聚合物相反转自组装分子印迹微球材料（MIP）以及非印迹微球材料（NIP）0029说明书CN104069836A4/4页60030用于实际样品（人血浆）中模板分子对应蛋白质（转铁蛋白）的识别，以及前十种高丰度蛋白质的量的变化（二级谱峰强度（SIN）表示）。说明书CN104069836A1/1页7图1图2说明书附图CN104069836A。