技术领域
本发明涉及一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，属药物领域。
背景技术
自20世纪90年代以来，陆续发表的痴呆临床病理学研究证实，5-10％的65岁以上老年人患有某种认知衰退或痴呆，其中超过50％的病例原因是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，且女性多于男性。阿尔茨海默病，又称阿尔茨海默病，是一种在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。在1907年由德国医生Alois Alzheimer首次描述。其主要临床表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退，性格和行为改变，意识错乱，思考及判断力丧失，生活自理能力丧失，最终死亡。这种破坏性的大脑退行性疾病剥夺了受害者最具人类特征的品质——记忆、推理、抽象化和语言的能力。国际阿尔茨海默病学会于2005年12月在《柳叶刀》上发表了著名的“德尔非研究共识”，指出：全球有2430万人患痴呆，每年新增痴呆病例460万(每7秒新增1例患者)。患病人数每20年增加1倍，到2040年，全球痴呆病例将达到8110万。AD是一种中枢神经系统(CNS)进行性变性疾病，其特征性病理改变为老年斑(Senile plaques，SPs)、神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)，及区域性神经细胞死亡(神经元与神经突触异常丢失)等。NFTs为脑神经元内异常磷酸化的Tau蛋白聚集而形成，其多少与AD症状的严重程度有关。一个世纪以来，许多科学家就AD的确切病因及发病机制进行了不倦的探索和研究，但其致病因素复杂而至今尚不清楚。目前认为，AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多因素共同作用引起的一种病理过程。因此，AD迄今尚无特效、能中止和逆转病情进展的有效疗法。目前治疗主要在于改善病人标志性表现——记忆障碍及影响日常生活的症状等。
轻度认知功能损害(mildcognitiveimpairment,MCI)是老化和痴呆研究领域新近提出的概念,被认为是正常老年人与阿尔茨海默病(AD)或其他痴呆之间的一种过渡状态。研究和认识MCI将有助于对AD或其他痴呆采取有效预防和治疗措施，延缓疾病的发生发展。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物。本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法。
本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物，它含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：
益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份。
进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：
益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份。
更进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：
益智50份、菟丝子100份、远志100份、生地黄100份、五味子30份、川芎100份、栀子100份。
其中，所述的菟丝子为酒煮菟丝子。
本发明药物组合物是由益智、菟丝子、远志、生地黄、五味子、川芎、栀子的原生药材或水或有机溶剂提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
其中，所述的制剂是片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液。
本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：
a、称取各重量配比的原料药；
b、取益智、川芎，加水浸泡，提取挥发油，收集挥发油与提取液，待用，药渣备用；
c、取剩余药材，同b步骤的药渣混合，加水煎煮，合并b步骤制备的提取液，加入乙醇沉淀，静置，滤过，滤液浓缩，干燥；
d、取c步骤制备的干燥产物，加入b步骤的挥发油以及药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。
其中，b步骤为：取益智加入30倍量水浸泡1小时后，加入川芎，按水蒸汽蒸馏法提取挥发油4小时，分别收集挥发油与提取液，待用；c步骤所述的乙醇浓度为：65％-95％乙醇；优选地，乙醇浓度为：85％乙醇。
本发明还提供了所述的药物组合物在制备预防或/和治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。
本发明还提供了所述的药物组合物在制备补肾填精，宁心安神，开窍益智的药物中的用途。
本发明还提供了该药物组合物在制备治疗轻度认知功能损害的药物中的用途。
本发明药物原料组方以益智、五味子补肾安神，辅以菟丝子、远志、生地黄补肾填精，兼以川芎活血行气，栀子通泻三焦。全方配伍用于治疗阿尔茨海默病，达到补肾填精，宁心安神，开窍益智功效，药效明显，质量稳定，可控，为临床提供了一种新的选择。
附图说明
图1本发明药物口服液色谱图
图2对照品色谱图
具体实施方式
实施例1本发明药物口服液的制备
称取原料药：益智50g，菟丝子(酒煮)100g，远志100g，生地黄100g，五味子30g，川芎100g，栀子100g；制成1000ml
以上七味，取益智加入30倍量水浸泡1小时后，加入川芎，按水蒸汽蒸馏法提取挥发油4小时，分别收集挥发油与提取液，待用；药渣与其他药材合并，加10入倍量水，提取2次，每次提取时间2h，合并所有提取液，减压浓缩(温度不超过80℃，真空度为-0.04—0.08MPa)到比重为1.15-1.20，加入乙醇，使其含醇量为85％，静置24小时，滤过，取滤液，减压浓缩(温度不超过80℃，真空度为-0.04—0.08MPa)到相对比重1.25—1.30，减压干燥(温度不超过80℃，真空度为-0.04—0.08MPa)，粉碎，即得。
取纯化水1000ml，加热至沸腾，缓慢加入中间体，边加边搅拌，加完后再搅拌10-15min，冷至室温，冷藏(0-4℃)过夜。滤过，取滤液，取滤液加入4g甜菊素搅拌至溶解完全，取200mL滤液，加热至70℃，加入吐温-80约4ml，搅拌均匀，冷却至40-50℃，加入挥发油，搅拌5min，将剩余的800ml药液加热至20-30℃，再将加入了吐温80的滤液缓慢加入剩余的滤液中，边加边搅拌，加完再搅拌5min，冷至室温，冷藏12小时，滤过，滤液，灌封(10ml/支)，即得。
本品为口服液，内容物为棕黄色到棕褐色的澄清液体，味微苦。
实施例2本发明药物的制备
称取原料药：益智25g，菟丝子(酒煮)50g，远志50g，生地黄50g，五味子15g，川芎50g，栀子50g，加水煎煮，浓缩，加入矫味剂等制备成口服液。
实施例3本发明药物的制备
称取原料药：益智75g、菟丝子150g、远志150g、生地黄150g、五味子45g、川芎150g、栀子150g，直接打粉，压片，得片剂。
实施例4本发明药物的制备
称取原料药：益智75g、菟丝子50g、远志50g、生地黄150g、五味子45g、川芎50g、栀子50g，加入75％乙醇提取，收集醇提液，浓缩，浸膏加淀粉，制粒，装胶囊。
实施例5本发明药物原料提取工艺研究
1、药材中挥发油提取参数的研究
分别称取益智50g，75g两份，倒入烧瓶中并置于电热套中，并编号；于1号烧瓶中加入1500ml水，2号烧瓶中加入2250ml水。浸泡1小时后分别加入川芎100g，150g。接上冷凝管和挥发油提取器开始加热提取，收集挥发油。并记录时间及挥发油收集的量，实验结果如表1
表1挥发油收集量随时间的变化
实验结果表明，由于随着时间的增加，挥发油提取量先增加，从第四个小时开始，随着时间的增加，挥发油的量一直不再增加，故益智、川芎提取最佳时间为4个小时。
2验证实验
分别称益智50g，75g三份，倒入烧瓶中并置于电热套中，并编号。于1号烧瓶中加入1500ml水，2号烧瓶中加入1500ml水，3号烧瓶中加入2250ml水。浸泡一小时后分别加入川芎100g，100g，150g。接上冷凝管和挥发油提取器开始加热提取4小时，收集挥发油。实验结果如下表2：
表2验证试验挥发油收集结果
从上表可知，本处方中药材挥发油提取4个小时，可将挥发油提取完全，提取工艺稳定，重复性较好。
3水提取工艺参数研究
3.1因素水平的确定与考察指标
本发明药物原料处方中的原药材以水提取为主要工艺路线，并对其工艺参数进行研究。
由文献可知，中药提取工艺的影响因素有很多，本实验主要研究药材的加溶媒量、提取时间、提取次数及提取溶媒。以水为提取溶媒，选取加溶媒量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)为考察因素，以栀子苷含量及固含物量为考察指标，采用L9(34)正交表安排试验。提取工艺优选因素水平见表3。
表3提取工艺因素水平表
3.2试验方法与结果
分别称取9份药材，每份中含菟丝子100g，远志100g，五味子30g，生地黄100g，栀子100g。与提取益智50g、川芎100g4小时后的药渣，按表4安排试验。实验结束后收集提取液，混匀并测定固含物及栀子苷含量测定。
3.2.1栀子苷含量测定
对照品的制备：精密称定栀子苷标准品
样品的制备：取供试粹，加入适量加溶剂，定容，超声使溶解完全并混匀，备用。
流动相：C2H3N:H2O＝15：85流速：1ml/min检测波长：238nm；
计算公式，
其中，A1：样品峰面积(mv，sec)
CO:对照品浓度(mg/ml)
A0：对照品峰面积(mv，sec)
V总：提取液总体积(ml)
3.2.2固含物测定
取适量提取液于恒温蒸发皿中，在水浴锅上蒸至干膏状，再于105℃烘箱中干燥3小时。
本试验结果采用加权评分的方法来评定。由于栀子苷含量为主要指标，固含物为此，因此本试验规定栀子苷含量所占权重比例为70，固含物所占权重为30。
实验结果如表4及表5所示。
通过方差分析表可知，各因素影响顺序为A＞B＞C，其中提加水量对总权重有显著性影响，其它因素对总权重显著性差异不显著。根据正交试验直观分析，确定药材的最佳提取工艺为A3B3C3，但考虑到B因素显著性差异不显著，实验时间过长，故选择最佳工艺条件为A3B3C3，即加10倍量水，提取2次，每次提取时间2h。
3.2.3验证性试验
按正交试验所用的药材量称取药材，按最佳提取工艺参数即加10倍量水，提取2次，每次提取时间2h，进行重复验证性试验，实验结果如表6所示。
验证实验结果表明，本提取工艺参数较为稳定，可作为口服液的提取工艺。
表4正交试验安排及结果
表5正交试验方差分析表
表6验证性试验结果
4精制工艺研究
4.1仪器与试药
正交试验提取液：批号20121019
验证试验提取液：批号20121101
乙醇(95％)：分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂，批号20110823
95％乙醇：成都金山化学试剂有限公司，批号20120229
分析电子天平：FA2004型，上海良平仪器仪表有限公司生产
电子天平：BS-6KH型，上海友声衡器有限公司生产
循环水式真空泵：SHZ-D(III)型，北京科伟永兴仪器有限公司生产
电热恒温水浴锅：HH-S6型，北京科伟永兴仪器有限公司生产
真空干燥箱：DZF-6050型，北京中兴伟业仪器有限公司生产
酒精计：河北省武强县同辉仪表厂生产
超声波清洗器：KQ-100型，昆山市超声仪器有限公司生产
旋转薄膜蒸发仪：RE-52B型，上海亚荣生化仪器厂生产
烧杯，量筒，恒重蒸发皿，冷凝管，精密PH试纸(0.5～5.0)，PH试纸(0～14)，漏斗，干燥器，移液管，胶头滴管，玻璃棒，分液漏斗，滤纸，密度计，铁架台，坩埚钳，白瓷盘等
挥发油分离：由于收集的挥发油中含有较多的水，且挥发油与水难以分离，故将挥发油与水的混合溶液(约400ml)置于分液漏斗中，加入约140ml石油醚，静置，将水分离出来，再将石油醚-挥发油混合物放入蒸发皿中，于水浴锅上(55℃)蒸至无石油醚。得到挥发油约3ml。
4.2方法与结果
4.2.1浓缩液及醇沉液的处理
4.2.1.1浓缩液中栀子苷含量测定
将浓缩液超声处理30分钟，精密称取浓缩液约0.5g，加水适量超声使溶解，定容至100ml。取样品适量过滤，用1ml的注射器吸取溶液使其通过微孔滤膜注射到进样瓶中，用高效液相测定，计算栀子苷含量。
4.2.1.2转移率测定
取醇沉液适量(可适当稀释)，过滤，用1ml的注射器吸取溶液使其通过微孔滤膜注射到进样瓶中，用高效液相测定，计算栀子苷含量。
4.2.1.3醇沉液固含物测定
实验操作与3.2.4.2均相同。
4.2.1.4浓缩液水分测定及醇沉除杂率测定
将浓缩液超声处理30分钟，精密称取浓缩液适量于恒重蒸发皿中，以下实验操作自“水浴蒸至浸膏状”起与3.2.4.2均相同。
4.2.2纯化工艺
4.2.2.1提取液的浓缩
将正交试验提取液、验证试验提取液分别浓缩至密度为1.20左右，待冷却至室温后测定密度，称定重量。
4.2.2.2醇沉浓度研究
(1)浓缩液的醇沉
取试验浓缩液两份，每份约100g，缓慢加入95％乙醇适量，边加边搅拌，使成乙醇浓度为65％、85％。静置过夜，过滤，量取滤液体积。实验结果如表7所示。
(2)醇沉转移率测定
取各份正交试验醇沉液适量，实验结果如表7所示。
(3)醇沉液固含物及醇沉除杂率测定
取醇沉液适量，实验结果如表7所示。
表7正交试验醇沉转移率与醇沉液固含物及醇沉除杂率测定结果
实验结果表明，浓缩液的醇沉浓度为85％时醇沉转移率及醇沉除杂率最高。
4.2.2.3醇沉浓度验证性实验
取浓缩液缓慢加入95％乙醇适量，边加边搅拌，使成乙醇浓度为85％。静置过夜，过滤，量取滤液体积。实验结果如表8所示。
验证试验醇沉转移率，实验结果如表8所示。
表8验证试验醇沉转移率及醇沉液固含物测定结果
验证实验结果表明，本精制工艺参数较为稳定，口服液提取液的最佳醇沉浓度为85％。
4.2.3醇沉液的浓缩及干燥
将验证试验醇沉液于旋转蒸发仪中浓缩至密度1.25左右，铺展于白瓷盘中，水浴加热至浓缩液为浸膏状，于80℃减压干燥约12小时，冷却后称重，得棕黄色至棕红色中间体。
实施例6本发明药物口服液的质量控制
【鉴别】(1)取本品10ml，分别加入石油醚(60～90℃)10ml萃取3次，分取石油醚溶液，合并，挥干，残渣加入3ml无水乙醇溶液，使溶解，作为供试品溶液。取益智对照药材粉末1.0g，加石油醚(30～60℃)20ml，置超声提取器中超声提取50min，滤过，挥干，残渣加1ml无水乙醇溶液使溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯(253.7nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。
(2)取本品10ml，加乙醚20ml，加热回流1h，取上层乙醚溶液，挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试液。取川芎对照药材粉末1.0g，加乙醚20ml，加热回流1h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照液。照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯(253.7nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。
【含量测定】栀子苷照高效液相色谱法(附录ⅥD)测定
色谱条件与系统适应性采用C18柱(4.6mm×250mm，5um)，以乙氰-水(15:85)为流动相，检测波长为238nm，流速为1ml/min，进样量为10ul。
对照品溶液的制备精密称取适量的栀子苷，置于10ml棕色容量瓶中，取甲醇溶液溶解至刻度，制成1ml含0.403mg溶液，摇匀，滤过，即得。
供试品溶液的制备精密称取装量差异下的本发明药物口服液1ml，置于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每ml含栀子以栀子苷计不低于11.4mg/ml。色谱图见图1、图2
以下通过具体药效学试验及临床试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明药物口服液的药理试验
(一)本发明药物对东莨菪碱致记忆获得性障碍模型小鼠的影响
随着人类寿命的延长，越来越多老年人群受到AD的困扰，严重影响患者的生活质量。AD产生的机制非常复杂，迄今仍未完全清楚，但是越来越多证据表明，中枢胆碱能神经系统与认知功能密切相关。
1材料与方法
1.1实验动物
动物健康昆明种小鼠60只，清洁级，雌雄各半，体重(20±2)g，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(川)2008-24。
环境小鼠喂养在干净白色塑料鼠笼内，每笼5只。室内光照、湿度、温度适宜(空调控制室温20～26℃，相对湿度60～70％)，通风条件好。
饲料保持充足的饮水与营养饲料。动物饲养管理按照操作规程进行。1.2药物与试剂
本发明药物(由益智、菟丝子、远志、生地黄、五味子、川芎、栀子七味中药组成，由实施例1制备的口服液)：由四川蜀源博业医药科技有限公司提供，加工制成含生药1.2g/ml浓缩液，实验中给药剂量以水提液中所含生药的量计算。氢溴酸东莨菪碱，徐州莱恩药业有限公司。盐酸多奈哌齐，卫材(中国)药业有限公司。
1.3主要仪器和设备
VARIOSKAN FLASH3001全波长读数仪，美国Thermo公司，20PR-5型高速冷冻离心机为日本日立公司产品，HH-S型恒温水浴箱，德国Sartorius公司，WMT-100Morris水迷宫装置和XCS2小鼠跳台仪购于成都泰盟科技有限公司。
2方法
2.1动物分组及给药
经Morris水迷宫行为学测试，剔除学习、记忆能力较差或较强、游泳姿势不良者，筛选出学习、记忆能力正常小鼠。将初筛合格的小鼠按体重、性别随机分成6个组，分别是正常空白对照组，模型组，阳性对照药组，本发明药物高剂量组、中剂量组、低剂量组。每组10只小鼠，分笼适应性喂养1w。在测试前连续给药7d，按照高剂量组(0.76g/ml)，中剂量组(0.38g/ml)，低剂量组(0.19g/ml)，每天灌胃1次。正常组、模型组用生理盐水灌胃。阳性组给予安理申，灌胃1w后对小鼠进行水迷宫和跳台法测试。
(1)Morris水迷宫实验在测试的第6天造模，除空白组外各组给予腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(3mg/kg)后30min进行水迷宫实验。
(2)跳台实验水迷宫试验测试第6天，水迷宫实验结束后，对小鼠进行跳台法训练，第7天造模，除空白组外各组给予腹腔注射氢溴酸东莨菪碱
(3mg/kg)后30min进行跳台实验。
2.2行为学实验
2.2.1水迷宫实验
在给药结束后的第1天，各组小鼠开始在Morris水迷宫中进行行为学测试，测试前，让鼠自由游泳以熟悉环境。将小鼠分别从三个象限面对池壁放入水池，记录90s内该鼠找到平台所用的时间(逃避潜伏期)。如果超过90s还未找到平台，则由实验者用手引致平台，并在平台上停留20s，逃避潜伏期记为90s，连续6天，第7天，撤除平台，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，游泳90s。记录小鼠的运动轨迹，观察小鼠穿越原平台位置的次数，并汇总其停留在原平台象限的总时间。
2.2.2跳台实验
测试周期2天，训练与测试期间继续给予受试药物。于给药1h后开始训练，将动物放入反应箱内适应3min，立即通以36V交流电刺激小鼠。然后将小鼠放在绝缘平台上(计时开始)，记录各鼠第1次跳下平台的潜伏期、5min内每小鼠受到电击的次数(跳下平台的错误次数)，第2天进行测验，将小鼠放在绝缘平台上(计时开始)，记录第1次跳下平台的潜伏期、5min内的跳下平台的错误次数，以此作为学习成绩。
3统计学处理
数据用SPSS17.0软件处理，数据以x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验，P＜0.05为有统计学意义。
4结果
4.1Morris水迷宫实验
4.1.1定位航行实验
在3天训练期中，各组小鼠的平均逃避潜伏期呈逐渐下降趋势，表明各组小鼠学习寻找平台的能力在历次的学习训练中均有所提高。从第4天开始，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长(P﹤0.05)，盐酸多奈哌齐阳性对照组可缩短小鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)。本发明药物高、中、低剂量组均可缩短小鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)；此外本发明药物高、中、低剂量组均能使小鼠由于学习记忆能力下降引起的穿越平台次数增多(P﹤0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)。(见表9)
表9本发明药物对东莨菪碱致学习记忆障碍模型逃避潜伏期的影响(n＝10)
注：均与模型组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。下同。
4.1.2空间搜索
撤去平台后，模型组小鼠多围绕池壁游泳，在迷宫外环停留时间较长，较少游向平台附近，其运动轨迹随机分布在各个象限中，其穿越平台次数、有效区停留时间、有效区游泳路程，与空白组比较明显减少(P＜0.01)。盐酸多奈哌齐阳性对照组有效区域停留时间、有效游泳路程，与模型组比较延长(P＜0.01)，
本发明药物高、中、低剂量组均能延长小鼠有效区域停留时间，增加有效区域游泳路程(P＜0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)(见表10)。
表10本发明药物对东莨菪碱致学习记忆障碍模型空间搜索的影响(n＝10)
4.2跳台
模型组小鼠潜伏期明显高于对照组(P＜0.05)，盐酸多奈哌齐对照组可缩短小鼠潜伏期(P＜0.05)。本发明药物高剂量组可缩短小鼠潜伏期(P＜0.05)；此外本发明药物中剂量组能使小鼠由于学习记忆能力下降引起的错误次数次数减少(P＜0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)。(见表11)
表11本发明药物对东莨菪碱致学习记忆障碍模型空间搜索的影响(n＝10)
(二)本发明药物对Aβ致AD模型大鼠的影响
Aβ是SP的主要成分，脑内Aβ异常沉积是AD最主要的病理变化。经典Aβ毒性作用理论认为，Aβ由可溶状态到不可溶状态的转化是AD发病中的重要环节。大量沉积的Aβ具有神经毒性，最终导致患者临床症状的发生。1材料与方法
1.1实验动物
Sprague Dawley大鼠，SPF级，雄性，2月龄，体重(200±20)g，成都达硕生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24。室内保持12h光照，12h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，且控制室内温度为(22±1)℃、相对湿度约40％。
1.2药物与试剂
本发明药物(由实施例1制备的口服液)：由四川蜀源博业医药科技有限公司提供，加工制成含生药1.2g/ml浓缩液，实验中给药剂量以水提液中所含生药的量计算。盐酸多奈哌齐，卫材(中国)药业有限公司。
淀粉样蛋白片段(Aβ25－35，美国Sigma公司)，实验前用无菌生理盐水将其稀释成浓度为2μg·μL-1，37℃恒温箱中孵育72h，形成凝聚态后置于-20℃冰箱存放备用；一抗：Anti-Aβantibody、Anti-tau antibody(abcam公司)；β-Actin Antibody(武汉博士德生物)；Prestained Protein Marker(Fermentas公司)；二抗和DAB显示试剂盒(北京中山金桥生物有限公司)。
1.3主要仪器和设备
Labsolution5.5大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)；5μL微量进样器(上海安亭进样器厂)；SAESHIN90+102电动牙科钻(Saeshin PrecisionCo.Ltd)；WMT-100Morris水迷宫视频分析系统(成都泰盟科技有限公司)；BX43正置显微镜(OLYMPUS公司)；Image-Pro Plus图像分析系统(Media Cybernetics，Inc.公司)；VARIOSKAN FLASH3001全波长读数仪(Thermo公司)；BSA224S-CW电子分析天平(Sartorius公司)；美国Thermo高速离心机(Thermo公司)。
2方法
2.1动物模型制备
根据参考文献资料方法，各组动物均用10％乌拉坦(10mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，将大鼠平颅头位固定于脑立体定位仪上，剪去脑顶局部毛发，常规消毒后用无菌手术刀在大鼠头皮正中线处切开一长约1.5cm纵行切口，暴露前囟，钝性分离皮下组织及骨膜，根据大鼠脑立体定位图谱在颅骨前囟后3.4mm、脑正中线左右旁开2.0mm两处用无菌牙科钻钻开，用5μL微量进样器自颅骨开孔处进入大鼠两侧海马背部，进针深度2.7mm，缓慢匀速注射5μL凝聚态Aβ25-35，注射速度为1μL·min-1，5min注射完毕，留针2min，缓慢撤针，术后缝合创口，消毒，假手术组注射等容积的生理盐水，术后自由饲养1周。
2.2分组与给药
将造模后的60只模型大鼠按体重随机均分为模型组、盐酸多奈哌齐组(1.02mg·kg-1)和本发明药物高(7.2g·kg-1)、中(3.6g·kg-1)、低(1.8g·kg-1)剂量组。取12只假手术组大鼠作空白对照组，除假手术组和模型组大鼠给予等体积的生理盐水外，各治疗组给予相应的治疗药物，给药容积为10mL·kg-1，连续给药30d。
2.3观察指标
2.3.1Morris水迷宫
实验连续5天，分为定位航行实验和空间探索实验，前3天为训练期，第4天为定位航行实验，第5天为空间探索实验。设置程序将水桶“十”字分成四个象限，每个象限池壁边缘中点为入水点。站台置于第四象限中心，每日依次从第一、二、三象限入水点将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期。如未找到平台，潜伏期记录为120s。第5天撤除站台，依次从第一、二、三象限入水点将动物面向池壁放入水中，三次分别记录动物120s内经过逃逸平台次数、有效区(站台直径2倍范围)停留时间、有效区(站台直径2倍范围)游泳路程。
2.3.2病理HE染色
在末次行为学测试后，将大鼠麻醉灌流后，完整取出脑组织，置于4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋切片。二甲苯脱蜡，无水乙醇脱水后用苏木精、伊红染色，中性树胶封片。
2.3.3免疫组化
按照免疫组化试剂盒说明，采用SP二步法进行常规脱蜡、阻断内源性过氧化物酶、滴加一抗和二抗、DBA显色、苏木素复染、乙醇脱水、透明、中性胶封片。在400倍显微镜下观察，每张切片的每个测定部位随机选取3个视野，采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统进行分析，统计每组阳性表达目标数、目标总面积及累计光密度值(IOD)，取平均值进行结果比较。阳性为棕黄色-黄色表达于细胞浆和/或细胞核，阴性细胞核为蓝色。
3统计学方法
使用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用最小显著差异t检验(LSD)，不符合正态分布则用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
4结果
4.1行为学实验
4.1.1定位航行实验
在3天训练期中，各组小鼠的平均逃避潜伏期呈逐渐下降趋势，表明各组大鼠学习寻找平台的能力在历次的学习训练中均有所提高。从第4天开始，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P﹤0.05)，多奈哌齐阳性对照组可缩短大鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)。第4天，本发明药物高、中剂量组均可缩短大鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)。(见表12)
表12本发明药物对Aβ致AD模型大鼠逃避潜伏期的影响(n＝10)
4.1.2空间搜索实验
撤去平台后，模型组大鼠多围绕池壁游泳，在迷宫外环停留时间较长，较少游向平台附近，其运动轨迹随机分布在各个象限中，其穿越平台次数、有效区停留时间、有效区游泳路程，与假手术组比较明显减少(P＜0.05)。盐酸多奈哌齐阳性对照组有效区域停留时间、有效游泳路程，与模型组比较延长(P＜0.05)，
本发明药物高、中、低剂量组均能延长小鼠有效区域停留时间(P＜0.05)，中、低剂量组均增加有效区域游泳路程(P＜0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)(见表13)。
表13本发明药物对Aβ致AD模型大鼠空间搜索的影响(n＝10)
4.2HE病理变化
假手术组大鼠脑内神经细胞排列整体，少数细胞浓染，部分灶性神经细胞减少。模型组大鼠脑内小胶质细胞增多，神经细胞数量明显减少，排列不成行细胞核固缩，部分细胞消失，仅见空泡存在。各治疗组大鼠脑内神经元病变均明显轻于模型组，可见部分神经元胞浆内虎斑减少或消失，尤以本发明药物高剂量组改善最为明显，大多数形态完好，散在胶质细胞。
4.3免疫组织化学法观察脑组织tau蛋白表达
光镜下观察细胞浆着棕褐色为tau蛋白染色阳性。实验结果表明，模型对照组海马tau较假手术组显著高表达，着色较深，阳性目标数、阳性目标面积及平均光密度值显著增高(P<0.01)。本发明药物治疗组可见阳性染色神经元数目及染色程度与假手术组相接近，较模型对照组表达减少，着色较浅，阳性目标数、阳性目标面积及平均光密度值明显降低(P<0.05)。(见表14)
表14本发明药物对Aβ模型大鼠海马tau表达的影响
(三)结论
本发明药物具有一定益智作用，可用于治疗阿尔茨海默病。
试验例2本发明药物治疗轻度认知功能损害的临床试验
1.研究内容
1.1本发明药物对MCI患者精神心理学测试量表积分的影响
1.2本发明药物对MCI患者中医证候积分的影响
1.3本发明药物安全性评价研究
2.研究方案
2.1诊断标准
2.1.1西医诊断标准
根据1999年Petereson制定的MCI诊断标准及DMS-IV的诊断标准，拟定诊断标准如下:
①患者自述记忆力明显下降，并有家属可以证实；
②认知功能下降，主要是记忆功能下降，记忆量表检测得分在年龄和教育匹配对照组1.5SD以下，
③其他认知功能如定向力，判断力，计算力，空间，视觉等下降不明显或轻度下降；
④不能达到痴呆的诊断标准，CDR＝0.5；
⑤没有影响或者轻微影响正常生活，生活可自理；
⑥不能用其他的精神神经系统疾病解释这种认知障碍，如抑郁症，缺血行脑卒中等。
2.1.2中医证候诊断标准
参照郑筱萸主编的《中药新药临床研究指导原则》及周仲瑛主编的《中医内科学》，拟定诊断标准如下：
①主症：智能减退，腰膝酸软，倦怠思卧，头重如裹，痰多吐涎，面色晦暗或口唇爪甲青紫。
②次症：思维迟钝，脑转耳鸣，体胖臃肿，痛处不移，眼睑青黑，小便失禁。
具备以上主症两项(智能减退必备)，另外次症至少具备两项以上者即可临床辨证为肾虚痰瘀证。
2.2纳入标准
①年龄在65-80岁之间，男女均可；
②符合MCI诊断标准，且记忆力减退症状持续在六个月以上；
③临床痴呆评定量表评定等级为可疑痴呆(CDR＝0.5分)；
④MMSE量表评分在24至27分之间；
⑤汉密尔顿抑郁量表评分<8分；
⑥自愿者，并签订知情同意书；
⑦有一定文化程度，既往能阅读简单的报纸文章和写简单的小文章；
⑧对药物研究意义有正确认识，对研究人员的观察和评价有良好的依从性。2.3排除标准
①CDR评定为正常或者痴呆者；
②汉密尔顿抑郁量表评分>8分；
③目前患者有精神分裂症、分裂情感性障碍或原发性成人情感性障碍，包括先前成人情感性障碍病史者。或伴有严重的神经缺损患者，如各种失语，失认者；
④患者有AD、VaD、中枢神经系统感染、创伤后痴呆、中毒代谢性脑病、Huntington氏病、多发性硬化、Parkinson氏病的诊断在记忆衰退之前，精神发育不全、原发的未经治疗的内分泌疾病如Qishing或原发的下丘脑功能减退(治好的甲状腺机能减退不除外)；
⑤合并有心、脑、肝、肾和造血系统等严重原发疾病患者；
⑥有严重消化不良，或胃肠道梗阻，或胃和十二指肠溃荡的病人，以及影响药物吸收的其他胃肠道疾病的病人；
⑦年龄在65岁以下或80岁以上者；
⑧对本研究药物过敏者；
⑨近期曾系统接受过中、西医益智药物治疗的患者。
2.4剔除标准
①不能按要求完成本实验者；
②试验过程中，受试者依从性差，影响有效性和安全性评价者；
③对本药不耐受，出现药物不良反应者。
2.5病例的脱落与处理
2.5.1脱落病例标准
①发生严重不良事件、并发症和特殊生理变化，不宜继续接受试验者或对本研究所用药物过敏者；
②试验过程中自行退出者；
③因其它各种原因疗程未结束退出试验、失访或死亡的病例；
④资料不全，影响有效性和安全性判断者；
2.5.2脱落病例的处理:
患者脱落后，研究者应根据患者填写的联系方式，如电话，地址等与患者取得联系，记录最后一次用药时间、完成所能完成的评估项目，并询问退出理由，做好相应记录。
妥善保管脱落病例的相关研究资料，以备进行试验统计分析。
2.6试验方法
2.6.1病例和药物来源
观察病例来自成都某三甲医院与成都市某社区医院。
本发明药物，由实施例1制备。
2.6.2治疗方案
对符合纳入标准的研究对象，做自身前后对照观察，给予本发明药物智能免煎颗粒，日一剂。治疗过程中予以基础保健支持[包括四方面：一般健康宣教(积极调治旧疾，保持心情舒畅)；适度运动(散步：1000米，早晚各1次)；肢体运动(手球:30分钟/日，Bid)；一般合理的营养支持]，不使用其它具有扩血管、益智作用的中西药物。疗程为12周。
2.7观察指标
2.7.1一般资料
①人口学资料:包括年龄、性别、种族、职业、受教育程度、身高、体重、用药史和患病史等。
②一般体格检查:如呼吸、心率、血压、脉搏等。
2.7.2疗效性指标
①精神心理学测试量表(表15)评分：
表15本研究所采用的测试量表
②中医证候积分评价：
表16MCI肾虚痰瘀证候分级量化表
以上由专职人员(经专业培训通过疗效测定一致性检验)在安静环境中进行测试。精神心理学量表测试于治疗前后各观测一次；中医证候积分于治疗前及治疗后第1周、第4周、第8周、第12周各记录一次。
2.7.3安全性指标
血、尿、便常规，肝肾功能，心电图，并随时记录不良反应及不良事件发生情况，采取的措施及转归。治疗前与治疗12周结束后各检测一次。
2.8疗效判定标准
①精神心理学测试量表评分：
以临床记忆量表得分为主要参考指标，通过比较治疗前后的测试量表得分变化，来评价记忆认知功能的改善情况，采用改善率表示，即：
改善率＝[(治疗后得分-治疗前得分)/治疗前得分]×100％
显效：改善率≥20％；
有效：10％≤改善率＜20％；
无效：改善率<10％。
有效率(％)＝(显效人数+有效人数)/总人数×100％
②中医证候积分评价：
根据中医证候分级量化表计算疗效指数，根据疗效指数进行中医证候疗效评价。
疗效指数(尼莫地平法)＝[(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分]×100％
临床痊愈：疗效指数≥80％，症状、体征消失或基本消失；
显效：50％≤疗效指数＜80％，症状、体征明显改善；
有效：20％≤疗效指数＜50％，症状、体征均好转；
无效：疗效指数＜20％，症状、体征无明显改善或加重。
有效率(％)＝(痊愈人数+显效人数+有效人数)/总人数×100％
③安全性评价标准
1级：安全，无任何不良反应。
2级：比较安全，如有不良反应，不需做任何处理可继续给药。
3级：有安全性问题，有中等程度的不良反应，做处理后可继续给药。
4级：因不良反应中止试验。
2.9统计方法
所有数据采用“均数±标准差”表示，用EXCEL工作表建立数据库并使用SPSS19.0统计学软件进行统计学检验。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有显著意义，P＜0.01为差异有非常显著意义。
3研究结果
3.1脱落、剔除病例
脱落病例5例。3例失访。1例糖尿病病史10余年，并发眼底病变，因住院手术而停药。1例因自觉病情较轻，不愿继续服药。
3.2一般资料
本研究最终观察MCI患者85例，其中男46例，女39例(55～78岁)，平均年龄69.23±3.63岁；最短病程0.8年，最长10年，平均病程7.72±2.72年；文化程度小学42人，初中31人，高中及以上学历12人；右利手80人，左利手5人；体力劳动72人，包括工人、农民、军人等，非体力劳动13人，包括管理、会计、飞行员等；合并高血压病45人，冠心病3人，高血脂43人，失眠病史30人，有吸烟、饮酒史18人。
3.3认知功能疗效评估
用药3个月后，对患者总体认知水平变化进行评估，分别对MMSE量表(总体认知功能)、临床记忆量表(记忆力)、连线检测(执行功能)、Boston命名量表(语言能力)、画钟检测量表(视空间结构能力)、日常生活能力ADL量表及GDS量表(总体衰退量表)进行评估。
1)总体认知水平评估
MMSE量表用于评价总体认知功能，可分为定向力、记忆力、语言能力等小单元，但除定向记忆外，其他各项并不能代表各自相应领域的认知功能。
表17MMSE评分
经配对符号秩和检验，治疗后，定向力积分较治疗前有明显提高，双侧P﹤0.05，定向力积分治疗前后有差异；MMSE量表总积分双侧P﹤0.05，有统计学意义。
2)记忆能力评估
临床记忆量表，为本次研究主要观察量表，用于评价记忆力水平，其中包括指向记忆、联想学习、图像自由回忆等。
表18临床记忆量表评分
采用配对符号秩和检验，治疗前后临床记忆量表总评分，双侧P﹤0.05说明临床记忆量表总分治疗前后有差异，疗效显著。指向记忆、图像自由回忆、无意义图形再认评分均采用配对符号秩和检验，双侧P﹤0.05，说明指向记忆评分、图像自由回忆、无意义图形再认评分治疗前后有差异，疗效显著。联想学习、人像特点联系回忆，结果显示P﹥0.05，无统计学差异。
连线测验评估患者执行功能，分为A和B两部分，A部分反映知觉运动速度，而B部分除包含知觉运动速度外，还包含概念和注意转换能力，对额叶功能减退的筛选有一定帮助。
表19连线测验A-B量表评分
治疗前后连线测验A和B均采用配对t检验，A部分P﹤0.05，治疗前后有显著差异，B部分P﹥0.05，无统计学差异。
Boston命名量表用于检测患者语言能力，用配对符号秩和检验，结果示P﹥0.05，治疗前后积分无统计学差异。
表20Boston命名量表评分
画钟测验用于检测患者视空间结构能力，应用配对符号秩和检验，结果示P﹥0.05，不能认为治疗前后积分有差异。
表21画钟量表评分
3.4中医证候疗效分析结果
根据证候积分方法，获取证候积分，并分别在用药前、用药后12周分别记录。计量资料均采用均数±标准差(ⅹ±S)表示，采用配对t检验，结果如下表所示：
记录所得证候总积分分别与用药前证候总积分比较，采用配对t检验，结果显示，治疗12周后与用药前比较，P﹤0.000，有统计学意义。
3.5安全性评价
本研究85例患者中，1例患者在服药一周后合并感冒出现头胀痛，伴有咳嗽、流涕等不适。嘱暂停本发明药物，10天后患者感冒症状消失，自主继续服用本发明药物，未出现头胀痛等特殊不适，按照上述安全性评价标准，不属于不良反应事件，余患者均未诉服药期间有任何不适。
4.结论
本发明药物治疗阿尔茨海默病前期阶段MCI有效。
本发明药物在传统中医药理论指导下，结合现代医学的研究进展，选择AD极早期阶段作为干预切入点，针对MCI本虚标实的病机特点，采用具有补肾安神，逐痰通络功效的本发明药物作为治疗药物，并结合基础保健支持，拟通过规范化的随机对照临床试验，利用多个国际公认的精神心理学测试量表及中医证候评分表作为疗效性观察指标，结合三大常规、肝肾功、心电图等安全性指标，揭示本发明药物治疗MCI(肾虚痰瘀证)的有效性和安全性作用。为临床治疗MCI提供疗效确切、稳定可靠的治疗药物，以改善患者智力减退、记忆力下降、反应迟钝等症状，延缓或中止MCI发展为AD的进程，减轻由此造成的经济、社会和心理负担，提高患者的行为能力和生活水平。