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1、(10)申请公布号 CN 102228016 A (43)申请公布日 2011.11.02 CN 102228016 A *CN102228016A* (21)申请号 201110096959.6 (22)申请日 2011.04.18 A01N 1/02(2006.01) C12N 5/0797(2010.01) (71)申请人 上海安集协康生物技术有限公司 地址 201203 上海市浦东新区张江高科技园 区蔡伦路 720 弄 2 号 503-A 室 (72)发明人 金宜强 姚静 杨立敏 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 封新琴 张红春 (54) 发明名称 一种神。
2、经干细胞冻存复苏的方法 (57) 摘要 本发明提供了一种神经干细胞冻存、 复苏的 方法， 并提供了通过该方法制备的细胞存活率在 90以上的冻存、 复苏的神经干细胞溶液。同时， 本发明还提供了用于上述神经干细胞冻存复苏方 法所用的冻存液和复苏液。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 102228017 A1/3 页 2 1. 一种神经干细胞冻存复苏的方法， 包括以下步骤 ： 1) 冻存步骤 ： 包括向神经干细胞悬液中加入冻存液和在液氮中冻存的步骤 ； 2) 复苏步骤 ： 包括向从液氮中取出的冻。
3、存细胞中加入复苏液使细胞复苏的步骤 ； 3) 将复苏的细胞液洗涤后制备成细胞悬液备用。 2. 权利要求 1 的方法， 其中所述冻存液包含表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生 长因子 (bFGF)。 3. 权利要求 2 的方法， 其中所述 EGF 在冻存液中的终浓度为 0.005-0.04g/ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml。 4. 权利要求 2 的方法， 其中所述 bFGF 在冻存液中的终浓度为 0.005-0.04g/ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml。 5. 权利要求 1-4 任一项的方法。
4、， 其中所述冻存步骤包括将加入冻存液的神经干细胞悬 液低温， 优选在 -15至 -25， 更优选在 -18至 -22， 最优选在 -20放置一段时间， 然 后在-65至-75， 优选在-68至-72， 最优选在-70放置12-16个小时， 再转入液氮 中冻存。 6. 权利要求 1-5 任一项的方法， 其中所述冻存液为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.6-2.4mM 丙酮酸钠， 终浓度为 0.8-1.2mM N- 乙酰半胱氨酸 (NAC)， 终浓度 0.8-1.2mM EGF， 终浓度 0.005-0.04g。
5、/ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml bFGF， 终浓度 0.005-0.04g/ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml 二甲基亚砜 (DMSO)， 终浓度 7-8 (v/v) 牛血清白蛋白 (BSA)， 终浓度 0.08-0.12g/ml。 7. 权利要求 6 的方法， 其中所述冻存液为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM NAC， 终浓度 1.0mM EGF， 终浓度 0.01g。
6、/ml bFGF， 终浓度 0.01g/ml DMSO， 终浓度 7.5 (v/v) BSA， 终浓度 0.1g/ml。 8. 权利要求 6 的方法， 其中所述冻存液为 DMEM 或 DMEM/F 12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM 权 利 要 求 书 CN 102228016 A CN 102228017 A2/3 页 3 NAC， 终浓度 1.0mM EGF， 终浓度 0.02g/ml bFGF， 终浓度 0.02g/ml DMSO， 终浓度 7.5 (v/v) BSA， 终浓度 0.1g/。
7、ml。 9. 权利要求 1-8 任一项的方法， 其中所述复苏液为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.6-2.4mM 丙酮酸钠， 终浓度为 0.8-1.2mM NAC， 终浓度 0.8-1.2mM BSA， 终浓度 0.008-0.012g/ml。 10. 权利要求 9 的方法， 其中所述复苏液为 DMEM 或 DMEM/F 12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM NAC， 终浓度 1.0mM BSA， 终浓度 0.。
8、01g/ml 11. 权利要求 1-10 任一项的方法， 其中复苏的过程包括 ： 将液氮中的冻存细胞取出， 在 35至 45， 优选在 38至 42， 最优选在 40水浴中 温育 1.5-2.5 分钟， 然后加入复苏液重悬。 12. 一种用于神经干细胞冻存复苏的冻存液， 其为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.6-2.4mM 丙酮酸钠， 终浓度为 0.8-1.2mM N- 乙酰半胱氨酸 (NAC)， 终浓度 0.8-1.2mM EGF， 终浓度 0.005-0.04g/ml、 优选 0.008-0.03g/m。
9、l， 最优选 0.01-0.02g/ml bFGF， 终浓度 0.005-0.04g/ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml 二甲基亚砜 (DMSO)， 终浓度 7-8 (v/v) 牛血清白蛋白 (BSA)， 终浓度 0.08-0.12g/ml。 13. 权利要求 12 的冻存液， 其为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM NAC， 终浓度 1.0mM EGF， 终浓度 0.01g/ml 权 利 要 求 书 CN 1022280。
10、16 A CN 102228017 A3/3 页 4 bFGF， 终浓度 0.01g/ml DMSO， 终浓度 7.5 (v/v) BSA， 终浓度 0.1g/ml。 14. 权利要求 12 的冻存液， 其为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM NAC， 终浓度 1.0mM EGF， 终浓度 0.02g/ml bFGF， 终浓度 0.02g/ml DMSO， 终浓度 7.5 (v/v) BSA， 终浓度 0.1g/ml。 15. 一种用于神经干细胞冻存复苏的复苏液， 其。
11、为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.6-2.4mM 丙酮酸钠， 终浓度为 0.8-1.2mM NAC， 终浓度 0.8-1.2mM BSA， 终浓度 0.008-0.012g/ml。 16. 权利要求 15 的复苏液， 其为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2mM 丙酮酸钠， 终浓度为 1mM NAC， 终浓度 1.0mM BSA， 终浓度 0.01g/ml。 17. 通过权利要求 1-11 任一项的方法制备的冻存复苏的神经。
12、干细胞悬液， 其中该细胞 悬液中具有活性的神经干细胞在 90以上。 权 利 要 求 书 CN 102228016 A CN 102228017 A1/6 页 5 一种神经干细胞冻存复苏的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物制品领域， 具体涉及一种神经干细胞冻存复苏的方法。本发明通 过添加 EGF 和 bFGF 两种细胞因子， 使得神经干细胞冻存复苏率大大提高， 由现有技术中的 40左右达到 90以上， 本发明对神经干细胞成功地进行了冻存、 复苏， 对临床择期进行干 细胞移植手术和建立 “干细胞库” 具有重要的意义。 背景技术 0002 神经干细胞 (Neural Stem Cell， NS。
13、C) 是存在于胚胎或成体脑、 脊髓等组织中的 一种干细胞， 是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞， 可通过不对等的分裂方式分 化成神经元、 星形胶质细胞、 少突胶质细胞等神经组织的各类细胞， 也可转分化成血细胞和 骨骼肌细胞。 在脑、 脊髓等所有神经组织中， 不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不 同， 分布也不同。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞， 用于生命科学研 究、 药物筛选测试、 临床应用研究等领域。 由于神经干细胞冻存后复苏率直接影响着神经干 细胞的质和量， 为获得来源方便的神经干细胞， 改进神经干细胞冻存复苏技术、 建立一种能 够长期储存干细胞的方法对促进神经干。
14、细胞的研究和应用具有重要意义。 0003 目前， 神经干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类， 由于血清具有成 分复杂、 质量不稳定、 价格昂贵等缺点， 无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。目前神经干 细胞无血清冻存液的主要成分是70的无血清培养基、 20牛血清白蛋白(BSA)和10二 甲基亚砜 (DMSO)。 0004 冻存程序一般是梯度降温的方法， 降温速度大约是 1 / 分钟。 0005 对冻存的细胞进行复苏时， 一般是将冻存管直接置于 37迅速解冻， 然后加入完 全生长培养基重悬细胞， 离心弃上清后， 再加入完全生长培养基继续培养， 以供后续的研究 或测试使用。 0006 结合上述。
15、无血清冻存和复苏技术对神经干细胞进行冻存和复苏， 冻存后复苏率仅 有 40左右， 远低于含血清的冻存技术。 0007 因此， 本领域需要新的对神经干细胞进行冻存和复苏的方法， 以提高神经干细胞 的冻存复苏率， 从而获得优质的神经干细胞冻存复苏产品， 为以后神经干细胞移植手术和 建立 “干细胞库” 等应用奠定良好的基础。 发明内容 0008 本发明涉及一种神经干细胞冻存复苏的方法， 该方法对冻存液、 复苏液、 冻存程 序、 复苏程序等进行了改进和优化， 使神经干细胞的复苏率相对于现有技术的方法大大提 高， 从现有技术所获得的 40左右的复苏率提高到 90以上。 0009 具体地， 本发明的神经干。
16、细胞冻存复苏方法包括以下步骤 ： 冻存步骤、 复苏步骤和 洗涤步骤， 其中冻存步骤包括向神经干细胞悬液中加入冻存液和在液氮中冻存的步骤 ； 复 苏步骤包括向从液氮中取出的冻存细胞中加入复苏液使细胞复苏的步骤 ； 洗涤步骤包括将 说 明 书 CN 102228016 A CN 102228017 A2/6 页 6 复苏的细胞液洗涤后制备成细胞悬液备用。 0010 本发明在传统的冻存液配方中添加了生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生长因 子 (bFGF)。所述 EGF 在冻存液中的终浓度为 0.008-0.04g/ml、 优选 0.009-0.03g/ ml， 最优选 0.01-0.02g/m。
17、l ； 所述 bEGF 在冻存液中的终浓度为 0.008-0.04g/ml、 优选 0.009-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml。 0011 在一个具体实施方案中， 所述冻存液为 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.6-2.4mM， 丙酮酸钠， 终浓度为 0.8-1.2mM， N- 乙酰半胱氨酸 (NAC)， 终浓度 0.8-1.2mM， EGF( 表皮生长因子 )， 终浓度 0.005-0.04g/ ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml， 碱性。
18、成纤维细胞生长因子 (bFGF)， 终浓度 0.005-0.04g/ml、 优选 0.008-0.03g/ml， 最优选 0.01-0.02g/ml， 二甲基亚砜 (DMSO)， 终浓度 7-8 (v/v)， 牛血清白蛋白 (BSA)， 终浓度 0.08-0.12g/ml。上述 DMEM 培养 液、 DMEM/F12 培养液、 B27 添加剂和 N2 添加剂是培养神经干细胞的常用公知添加剂， 购自 Invitrogen公司， 它们也可以从其它商业渠道购买得到。 在配制过程中， 将上述B27添加剂 (Invitrogen， 50 倍浓度 (50)、 N2 添加剂 (Invitrogen， 100。
19、 倍浓度 (100) 加入 DMEM 或 DMEM/F12 培养液 (Invitrogen， 1 倍浓度 (1) 中， 使 B27 添加剂、 N2 添加剂的终浓度 分别为 0.8-1.2 浓度， 优选 Invitrogen 公司建议使用的 1 倍浓度 B27 添加剂 (1B27 添加剂 ) 终浓度和 1 倍浓度 N2 添加剂 (1N2 添加剂 ) 终浓度。 0012 在具体的实施方案中， 前述的 DMEM 培养液可以用本领域培养细胞常用的其它细 胞培养液替代， 优选用 DMEM/F12 培养液代替。DMEM 培养液是本领域常用的公知细胞培养 液， 包含 ： 甘氨酸， 0.4mM， L- 精氨酸。
20、， 0.398mM， L- 胱氨酸， 0.201mM， L- 谷氨酰胺， 4mM， L- 组 氨酸， 0.2mM， L- 异亮氨酸， 0.802mM， L- 亮氨酸， 0.802mM， L- 赖氨酸， 0.798mM， L- 蛋氨酸， 0.201mM， L- 苯丙氨酸， 0.4mM， L- 丝氨酸， 0.4mM， L- 苏氨酸， 0.798mM， L- 色氨酸， 0.0784mM， L- 酪氨酸， 0.398mM， L- 缬氨酸， 0.803mM， 氯化胆碱， 0.0286mM， D- 泛酸钙， 0.00839mM， 叶 酸， 0.00907mM， 烟酰胺， 0.0328mM， 维生素 B6，。
21、 0.0194mM， 核黄素， 0.00106mM， 盐酸硫胺， 0.0119mM， 肌醇， 0.04mM， 氯化钙， 1.8mM， 硝酸铁， 0.000248mM， 硫酸镁， 0.814mM， 氯化钾， 5.33mM， 碳酸氢钠， 44.05mM， 氯化钠， 81.9mM， 磷酸二氢钠， 0.906mM， 葡萄糖， 25mM， 羟乙基哌 嗪乙磺酸， 25.03mM。 0013 DMEM/F 12 培养液是本领域常用的公知细胞培养液， 包含 ： 甘氨酸， 0.25mM， L- 丙 氨酸， 0.05mM， L- 精氨酸， 0.699mM， L- 天冬酰胺， 0.05mM， L- 天冬氨酸， 0.。
22、05mM， L- 半胱 氨酸， 0.0998mM， L- 胱氨酸， 0.1mM， L- 谷氨酸， 0.05mM， L- 谷氨酰胺， 2.5mM， L- 组氨酸， 0.15mM， L- 异亮氨酸， 0.416mM， L- 亮氨酸， 0.451mM， L- 赖氨酸， 0.499mM， L- 甲硫氨酸， 0.116mM， L-苯丙氨酸， 0.215mM， L-脯氨酸， 0.15mM， L-丝氨酸， 0.25mM， L-苏氨酸， 0.449mM， L- 色 氨 酸， 0.0442mM， L- 酪 氨 酸， 0.214mM， L- 缬 氨 酸， 0.452mM， 生 物 素， 0.0000143mM， 。
23、氯化胆碱， 0.0641mM， D- 泛酸钙， 0.0047mM， 叶酸， 0.00601mM， 烟酰胺， 0.0166mM， 吡哆醇， 0.00971mM， 核黄素， 0.000582mM， 盐酸硫胺， 0.00644mM， 维生素 B12， 0.000502mM， i- 肌醇， 0.07mM， 氯化钙， 1.05mM， 硫酸铜， 0.0000052mM， 硝酸铁， 0.000124mM， 硫酸铁， 0.0015mM， 氯 化镁， 0.301mM， 硫酸镁， 0.407mM， 氯化钾， 4.16mM， 碳酸氢钠， 14.29mM， 氯化钠， 120.61mM， 磷 酸氢二钠， 0.5mM， 。
24、磷酸二氢钠， 0.453mM， 硫酸锌， 0.0015mM， 葡萄糖， 17.51mM， 4- 羟乙基哌 嗪乙磺酸， 15.02mM， 次黄嘌呤钠， 0.015mM， 亚油酸， 0.00015mM， 硫辛酸， 0.00051mM， 酚红， 说 明 书 CN 102228016 A CN 102228017 A3/6 页 7 0.0215mM， 腐胺， 0.000503mM， 丙酮酸钠， 0.5mM， 胸苷， 0.00151mM。 0014 上述 B27 添加剂包含 ： 生物素， 肾上腺皮质酮， 孕酮， 乙酸维生素 A， 人重组胰岛素， 三碘甲腺原氨酸， 维生素 E， 乙酸维生素 E， 还原谷胱。
25、甘肽， 过氧化物歧化酶， 盐酸肉碱， 盐酸 乙醇胺， D- 半乳糖， 盐酸腐胺， 亚油酸， 亚麻酸， 牛血清白蛋白 ( 无脂肪酸 )， 人转铁蛋白， 亚 硒酸钠。上述 N2 添加剂包含 ： 胰岛素 5mg/L， 孕酮 20nM， 腐胺 100uM， 亚硒酸钠 30nM， 转铁蛋 白 100mg/L。 0015 在一个具体的实施方案中， 所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM， 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM， NAC， 终浓 度 1.0mM， EGF， 终浓度 0.01g/ml， bFGF， 终浓度。
26、 0.01g/ml， DMSO， 终浓度 7.5 (v/v)， BSA， 终浓度 0.1g/ml。在另一个具体实施方案中， 所述冻存液为 DMEM 或 DMEM/F 12 培养液 中包含 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM， 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM， NAC， 终浓度 1.0mM， EGF， 终浓度 0.02g/ml， bFGF， 终浓度 0.02g/ml， DMSO， 终浓度 7.5 (v/v)， BSA， 终浓度 0.1g/ml。 0016 向神经干细胞悬液中加入适量的冻存液， 使细胞终浓度在 0.8-1.2106 个细胞 /ml， 。
27、然后进行降温冻存。以前的降温方法是用程序降温仪以每分钟降 1 摄氏度的速度对 细胞均匀梯度降温， 然后保存到液氮中。本发明的方法是将细胞悬液在低温， 优选在 -15 至 -25， 更优选在 -18至 -22， 最优选在 -20放置一段时间， 优选 20-40 分钟， 更优选 25-35 分钟， 最优选 30 分钟， 然后在 -65至 -75， 优选在 -68至 -72， 最优选在 -70 放置 12-16 个小时， 然后转入液氮中长期冻存。 0017 传统的神经干细胞冻存复苏方法不用复苏液， 而是把冻存的细胞从液氮中取出， 直接放到 37 摄氏度解冻， 然后用完全培养基洗涤， 再放到完全培养基。
28、中培养。本发明的复 苏步骤采用了在 DMEM 或 DMEM/F12 培养液中包含如下成分的复苏液 ： 1B27 添加剂， 1N2 添加剂， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.6-2.4mM， 丙酮酸钠， 终浓度为 0.8-1.2mM， NAC， 终浓度 0.8-1.2mM和BSA， 终浓度0.008-0.012g/ml。 在一个具体的实施方案中， 所述复苏液在DMEM 或DMEM/F12培养液中包含 ： 1B27添加剂， 1N2添加剂， L-谷氨酰胺， 终浓度为2.0mM， 丙 酮酸钠， 终浓度为 1.0mM， NAC， 终浓度 1.0mM 和 BSA， 终浓度 0.01g/ml。 0018 上。
29、述复苏液中所使用的 DMEM 培养液、 DMEM/F12 培养液、 B27 添加剂和 N2 添加剂 购自 Invitrogen 公司， 它们也可以从其它商业渠道购买得到。在配制过程中， 将上述 B27 添加剂 (Invitrogen， 50)、 N2 添加剂 (Invitrogen， 100) 加入 DMEM 或 DMEM/F12 培养液 (Invitrogen， 1) 中， 使 B27 添加剂、 N2 添加剂的终浓度分别为 0.8-1.2 浓度， 优选 Invitrogen 公司建议使用的 1B27 添加剂终浓度和 1N2 添加剂终浓度。 0019 在具体的实施方案中， 本发明的复苏过程中增。
30、加了激活的步骤， 该激活的温度为 35至 45， 优选为 38至 42， 最优选为 40。传统的复苏方法是将装有冻存的神经 干细胞的冻存管从液氮中取出， 直接置于 37 摄氏度， 而我们的方法是从液氮中取出后先激 活 1.5-2.5 分钟， 再置于 37 摄氏度。具体地， 该复苏过程包括将液氮中的冻存细胞取出， 在 35至 45， 优选在 38至 42， 最优选在 40水浴中温育 1.5-2.5 分钟 ； 加入 8-12 倍体 积的37预热的复苏液重悬， 离心去上清， 再用DMEM或DMEM/F 12培养液洗涤。 洗涤时， 可 加入4-6倍体积的DMEM或DMEM/F12培养液重悬， 离心去上。
31、清 ； 重复前一步用DMEM或DMEM/ F12 再次洗涤 ； 加入 1-1.5 倍体积的 Hibernation 培养基 ( 该培养基的成分 ： KCl 2.24g/L、 说 明 书 CN 102228016 A CN 102228017 A4/6 页 8 NaOH 0.2g/L、 NaH2PO4.2H2O 0.78g/L、 MgCl2.6H2O 0.1g/L、 丙酮酸钠 2.2g/L、 葡萄糖 1.0g/L 和山梨 ( 糖 ) 醇 36.4g/L) 重悬。所获得的细胞悬液用于之后的研究测试。 0020 通过本发明的冻存复苏方法， 活神经干细胞占 90以上， 也就是说复苏率在 90 以上。 。
32、这样的神经干细胞是临床应用， 例如通过神经干细胞移植治疗神经系统疾病， 和建立 “干细胞库” 所期望的。 附图说明 0021 图 1a-b ： 该图为 CountessTM全自动细胞计数仪 (CountessTM antomated cell counter) 记录的实验结果。其中， 图 1a 为实施例 1 的方法获得的实验结果， 自动细胞计 数仪显示活细胞浓度 (Viable cell concentration)9.6105 个细胞 /ml， 与冻存前的 1.0106 个细胞 /ml 相比， 复苏率达 96。图 1b 为对比例 1 的方法获得的实验结果， 自 动细胞计数仪显示活细胞浓度3.。
33、5105个细胞/ml， 与冻存前的1.0106个细胞/ml相 比， 复苏率为 35。 0022 图 2a-b ： 该图为 CountessTM全自动细胞计数仪记录的实验结果， 其中图 2a 为实施 例 2 的方法获得的实验结果， 自动细胞计数仪显示活细胞浓度 9.4105 个细胞 /ml， 与冻 存前的 1.0106 个细胞 /ml 相比， 复苏率达 94。图 2b 为从对比例 2 的方法获得的实验 结果， 自动细胞计数仪显示活细胞浓度 4.0105 个细胞 /ml， 与冻存前的 1.0106 个细 胞 /ml 相比， 复苏率为 40。 具体实施方式 0023 实施例 1 ： 0024 获取鼠。
34、脑组织皮层神经干细胞 1.0106 个细胞， 加入一定体积的冻存液， 使细 胞悬液的最终浓度为 1.0106 个细胞 /ml， 将细胞悬液在 -20放置 30 分钟， 在 -70放 置 12-16 个小时， 然后转入液氮中冻存。 0025 1 周后将液氮中的冻存细胞取出， 在 40水浴锅中温育 2 分钟 ； 加入 10 倍体积的 37预热的复苏液重悬， 离心去上清 ； 加入 5 倍体积的 DMEM 培养液重悬， 再次离心去上清 ； 重复该洗涤步骤 ； 然后加入 1 倍体积的 Hibernation 培养基 ( 购自 Invitrogen 公司 ) 重 悬， 经自动细胞计数仪计数， 获得 9.6。
35、105 个细胞 /ml， 复苏率为 96 ( 参见图 1a)。 0026 本实施例中， 冻存液的成分是在 DMEM 培养液 (Invitrogen) 中含有 ： 0027 1B27 添加剂 (Invitrogen)， 0028 1N2 添加剂 (Invitrogen)， 0029 L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM， 0030 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM， 0031 NAC， 终浓度 1.0mM， 0032 EGF( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.01g/ml， 0033 bFGF( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.01g/ml， 0034 。
36、DMSO， 终浓度 7.5 (v/v)， 0035 BSA( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.1g/ml。 0036 复苏液的成分是在 DMEM 培养液 (Invitrogen) 中含有 ： 说 明 书 CN 102228016 A CN 102228017 A5/6 页 9 0037 1B27 添加剂 (Invitrogen)， 0038 1N2 添加剂 (Invitrogen)， 0039 L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM， 0040 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM， 0041 NAC， 终浓度 1.0mM， 0042 BSA， 终浓度 0.01g/ml。 00。
37、43 对比例 1 ： 0044 获取鼠脑组织皮层神经干细胞 1.0106 个细胞， 加入一定体积的冻存液， 使细 胞悬液的最终浓度为 1.0106 个细胞 /ml， 将细胞悬液在程序降温仪中以 1 / 分钟的速 度降温至 -150， 然后转入液氮中冻存。 0045 1 周后将液氮中的冻存细胞取出， 在 37水浴锅中解冻， 加入 5 倍体积的 DMEM 培 养液重悬， 离心去上清 ； 重复该洗涤步骤 ； 然后加入 1 倍体积的 DMEM 培养液重悬， 经自动细 胞计数仪计数， 获得 3.5105 个细胞 /ml， 复苏率为 35 ( 参见图 1b)。 0046 对照方法中， 冻存液的成分是在 D。
38、MEM 培养液 (Invitrogen 公司产品 ) 中含有 ： 0047 1B27 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0048 1N2 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0049 L- 谷氨酰胺， 终浓度为 2.0mM， 0050 丙酮酸钠， 终浓度为 1.0mM， 0051 NAC， 终浓度 1.0mM， 0052 DMSO， 终浓度 7.5 (v/v)， 0053 BSA( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.1g/ml。 0054 实施例 2 ： 0055 获取鼠脑组织皮层神经干细胞 1.0106 个细胞， 加入一定体积的冻存液， 使细 胞悬。
39、液的最终浓度为 1.0106 个细胞 /ml， 将细胞悬液在 -20放置 30 分钟， 在 -70放 置 12-16 个小时， 然后转入液氮中冻存。 0056 1 周后将液氮中的冻存细胞取出， 在 40水浴锅中温育 2 分钟 ； 加入 10 倍体积的 37预热的复苏液重悬， 离心去上清 ； 加入 5 倍体积的 DMEM 培养液重悬， 再次离心去上清 ； 重复前一步用 DMEM 再次洗涤 ； 加入 1 倍体积的 Hibernation 培养基 ( 购自 Invitrogen 公 司)重悬， 经自动细胞计数仪计数， 获得9.4105个细胞/ml， 复苏率为94(参见图2a)。 0057 本实施例中。
40、， 冻存液的成分是在 DMEM 培养液 (Invitrogen 公司产品 ) 中含有 ： 0058 0.91B27 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0059 0.91N2 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.82mM 0060 丙酮酸钠， 终浓度为 0.91mM， 0061 NAC， 终浓度 0.91mM， 0062 EGF( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.02g/ml， 0063 bFGF( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.02g/ml， 0064 DMSO， 终浓度 7.5 (v/v)， 。
41、0065 BSA( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.1g/ml。 0066 复苏液的成分是在 DMEM 培养液 (Invitrogen 公司产品 ) 中含有 ： 说 明 书 CN 102228016 A CN 102228017 A6/6 页 10 0067 0.95B27 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0068 0.95N2 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0069 L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.9mM， 0070 丙酮酸钠， 终浓度为 0.95mM， 0071 NAC， 终浓度 1.0mM， 0072 BSA， 终浓度 0.01g/m。
42、l。 0073 对比例 2 ： 0074 获取鼠脑组织皮层神经干细胞 1.0106 个细胞， 加入一定体积的冻存液， 使细 胞悬液的最终浓度为 1.0106 个细胞 /ml， 将细胞悬液在程序降温仪中以 1 / 分钟的速 度降温至 -150， 然后转入液氮中冻存。 0075 1 周后将液氮中的冻存细胞取出， 在 37水浴锅中解冻， 加入 5 倍体积的 DMEM 培 养液重悬， 离心去上清 ； 重复该洗涤步骤 ； 然后加入 1 倍体积的 DMEM 培养液重悬， 经自动细 胞计数仪计数， 获得 4.0105 个细胞 /ml， 复苏率为 40 ( 参见图 2b)。 0076 对照方法中， 冻存液的成。
43、分是在 DMEM 培养液 (Invitrogen 公司产品 ) 中含有 ： 0077 0.91B27 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0078 0.91N2 添加剂 (Invitrogen 公司产品 )， 0079 L- 谷氨酰胺， 终浓度为 1.82mM， 0080 丙酮酸钠， 终浓度为 0.91mM， 0081 NAC 终浓度 0.91mM， 0082 DMSO， 终浓度 7.5 (v/v)， 0083 BSA( 购自 Invitrogen 公司 )， 终浓度 0.1g/ml。 说 明 书 CN 102228016 A CN 102228017 A1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102228016 A CN 102228017 A2/2 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102228016 A 。