ATRP法构建高转染类脂质体阳离子基因载体.pdf

本发明公开了一种基于脂质(胆固醇、磷脂酰肌醇等)结合一般所用的活性聚合方法得到的阳离子基因载体构建的一系列具有高转染、低毒性等优异性能的类脂质体基因载体。本方法简单易行，其聚合方法保证了分子量的有效可控，而且相对于一般的阳离子基因载体，此基因载体通过脂质基体有效的与细胞膜相容的特点，或者本身构建成为脂质体增加细胞的摄取量的特点，从而增加细胞的转染效率。通过本方法构建的一系列类脂质体的阳离子基因载体在HepG2、COS7、C6、SL、H9C2等细胞系中都有良好的转染效率，同时在高于国际上已经投入商业化使用的脂质体lipfect2000的转染效率，并且能够有效的解决脂质体lipfect2000在体内转染效率较差的难题，具有很高的商业化潜力。

权利要求书
1.  一种类脂质体阳离子基因载体的活性可控自由基聚合方法，其特征在于，该聚合方法的聚合反应体系包括脂质大分子引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr或CuBr与CuBr2的混合物；其中单体与脂质大分子引发剂的质量比为0.001-60，优选0.01-50，更优选0.05-40；配体与脂质大分子引发剂的质量比为0.01-1.2，优选0.01-1，更优选0.05-1；CuBr与脂质大分子引发剂的质量比为0.001-1.5，优选0.01-1，更优选0.05-0.08；CuBr与CuBr2的质量比为(3:1)-(5:1)；有机溶剂与脂质大分子引发剂的质量比为50-500，优选50-450，更优选70-400。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚合反应温度为0-60℃，优选5-55℃，更优选10-50℃；反应时间为10-500min，优选10-400min，更优选30-400min；所述的聚合反应在无氧环境下连续进行；所述的聚合反应体系中的各组分加入顺序为：先将脂质大分子引发剂溶于有机溶剂，然后加入水、单体，再加入配体，最后加入CuBr或CuBr与CuBr2的混合物引发活性可控自由基聚合。

3.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂质大分子引发剂为脂质上的羟基或羧基与溴通过酯化反应得到，或脂质上的氨基与溴经酰胺化反应得到。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的脂质为胆固醇、磷脂酰肌醇、脂溶性维生素。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单体为甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或者几种；
所述的配体为2,2’-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4’-联吡啶中的一种或者几种；
所述的有机溶剂选自砜类、亚砜类、酰胺类、醇类、二氯甲烷中的一种或者几种。

6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的醇类选自甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、异戊醇、正己醇中的一种或者几种；所述的砜类选自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二苄基砜、甲基苯基砜、环丁砜中的一种或者几种；所述的亚砜类选自二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、二己基亚砜中的一种或者几种。

7.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当有机溶剂为亚砜类时，反应体系中不包含水，此时各组分加入顺序为：将脂质大分子引发剂溶于有机溶剂，然后加入单体，再加入CuBr或CuBr与CuBr2的混合物，最后加入配体引发活性可控自由基聚合。

8.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当使用的单体不含甲基丙烯酸缩水甘油酯时，聚合反应完成后暴露在空气中终止聚合，再向产品中加入水，加水量与产物的比例为100-300mL/g，之后放入透析袋中透析以除去小分子，最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得到类脂质体阳离子基因载体。

9.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当使用单体包含甲基丙烯酸缩水甘油酯时，聚合反应完成后加入脂质大分子引发剂质量的100-300倍的水或者甲醇，或者暴露在空气中终止聚合；然后用乙醚、乙醇或者甲醇沉淀直到形貌变为固体；真空干燥除去乙醚、乙醇或者甲醇得到粉末状或者絮状的固体；将得到的粉末状或者絮状的固体进行开环反应：将得到的粉末状或者絮状的固体在30-35℃无氧环境下加入二甲基亚砜搅拌溶解，之后加入胺在80-90℃范围内进行开环反应；其中二甲基亚砜与得到的粉末状或者絮状的固体的质量比为200-500，优选150-450，更优选120-350；胺与得到的粉末状或者絮状的固体的质量比为20-50，优选15-45，更优选20-40；开环反应持续1-3天以后，用乙醚沉淀聚合物直到变为粘稠状固体，将固体放入真空干燥箱中抽干乙醚，随后加水，再冷冻干燥直至除去所有的水分，得到开环的类脂质体阳离子基因载体。

10.  根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的胺选自三乙胺、乙醇胺、或乙二胺。

说明书ATRP法构建高转染类脂质体阳离子基因载体
技术领域
本发明属于非病毒基因载体制备技术领域，具体涉及一种ATRP法构建一系列以脂质(胆固醇、磷脂酰肌醇等)为基体，具有高效基因转染效率的类脂质体阳离子基因载体。
背景技术
基因治疗在过去的二十年内被人们认定为一种全新有效的治疗手段，这种方法对于未来医疗有着举足轻重的作用，被广泛的用于治疗一系列遗传性疾病、人类癌症和心血管疾病等等。整个基因治疗从广义上讲就是通过基因载体将用于治疗的外源设计基因或者寡聚核苷酸片段引入病体中的病变细胞，从而表达以改善病变细胞的缺陷，从而达到治疗的目的。基因治疗的整个流程有三个重要环节，其中包括目的基因的设计、基因载体的研发以及目的基因是否能在细胞中特异性表达。其中，基因载体的研发是重中之重，正是因为缺乏安全高效的基因载体才导致了基因治疗实施的瓶颈。
基因载体作为将外源基因导入到细胞的工具，其本身应该低毒性并且不会引起免疫反应；其次，其要能跟基因形成具有稳定结构的复合物，同时也不会导致基因结构的变化；最后，这种载体最好能够具有一定的靶向和降解作用，这样可以针对特定的细胞进行治疗并且可以降低其由于滞留导致的副作用。目前人们广泛使用的基因载体包括两类：病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral vector)。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒。这种病毒载体一般能够轻易的克服细胞屏障和免疫防御机制，从而其具有很高的转染效率。但是这种载体缺乏安全性，很容易引起致癌作用与自身免疫反应(unexpected immune response)和白细胞的病毒变化，严重时会造成器官衰竭从而导致死亡。同时病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体携带基因的能力有限，不利于大规模工业生产。针对以上病毒载体的缺点，人们将更多的目光投向了非病毒载体。其本身安全性能高，很多具有生物相容性或者具有生物可降解能力的基因载体都是低毒性的，而且具有很低的免疫毒性。相对于病毒载体而言，虽然这种非病毒性载体的转染效率并不是很 高，有的时候很难克服细胞内外的各种屏障，但是其能够携带更多的基因，同时还能大规模工业化生产，具有很高的商业潜力。所以其发展潜力推动了非病毒载体的研究与开发。目前而言阳离子聚合物是人们使用频率最高的非病毒载体。这种阳离子非病毒性载体可以有效的通过电荷的相互作用络合上基因，从而形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而能够保护基因穿过细胞膜以防止被核酸酶所降解，从而保证基因的顺利表达。
近年来，活性/可控自由基聚合(living/controlled radical polymerization，LRP)逐渐开始成为聚合物合成的重点手段，其通过在聚合体系中引入特殊的化合物，使其与活性种链自由基进行可逆的链终止或者链转移，从而建立活性种与休眠种的动态平衡，以实现在较低温度和简易操作下聚合产品分子量和分子量分布的可控，具有很高的实用价值。LRP主要包括以下几种方式：引发转移终止剂活性自由基聚合(Initiator-Transfer agent-Terminator Living Radical Polymerization)、稳定自由基聚合(Stable Free Radical Polymerization，SFRP)、原子转移自由基聚合(Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP)、可逆加成-裂解链转移聚合(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization，RAFT)。其中，ATRP是通过交替的“活化-去活”的可逆反应，在降低体系中游离基浓度的情况下尽量的控制不可逆终止反应程度，而这个过程中链增长的反应则不受到影响，从而实现“活性”聚合。ATRP的引发剂一般为常见的卤化烷烃，其反应温度适中，适用于大部分单体，而且整个过程不需要复杂的合成路线，相对于其他的活性聚合具有更多的优势。
随着高分子科学的不断进步，如何将其与现代医学、生物学以及工程学等学科更好的相互交融与渗透成为人们现在重点解决的难题。而在基因治疗方面，高分子材料已经体现出了很高的利用价值。目前，文献报道过一系列的非病毒阳离子基因载体，包括聚-L-赖氨酸(Poly(L-Lysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(Poly(amid amine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(Poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)等。其中PEI是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述的阳离子聚合物仍然具有相当高的毒性，并且在体内的转染会受到严重的限制，大大限制了这些非病毒载体在临床医学中的应用。所以，开发低毒而高效 阳离子聚合物成为现在研究非病毒基因载体的核心内容。目前比较流行的方案是在阳离子聚合物中插入生物相容性的成分，最常见的是聚乙二醇(PEG)以增加基因载体在体内的循环时间，同时降低毒性。而另一种常见的思路就是构建类脂质体的阳离子基因载体，其中向基因载体中引入脂质例如胆固醇(Cholesterol)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol)、脂溶性维生素(Fat-soluble Vitamin)等。这些脂质的引入可以有效的增加生物相容性从而降低自身毒性，同时脂质可以促进整个体系形成类脂质体或者脂质体从而增加在体内的转染。但是，上述报道的非病毒载体的性能(比如安全性和转染效率)与实际的临床医学应用的要求还有相当大的距离。目前，已经商业化的基因载体只有脂质体lipfect2000和lipfect3000，但是其价格高昂，并且在体内的转染效率也很差，这两个缺陷导致了这种基因载体在临床治疗中无法有效应用。
近几年研究者致力于ATRP理论和应用的研究工作，已经能够熟练的利用这种活性聚合手段得到一系列能够用于现代生物医学方面的聚合物材料，例如改性过的PEGDMAEMA、PEGMA等等，都是最新的阳离子基因载体研究成果，同时促进了活性可控聚合在医用生物高分子中的应用。
脂质(Lipid)是指由脂肪酸和醇作用生成的酯及其衍生物，一般不溶于水而能被乙醚、氯仿、苯等非极性有机溶剂所溶解，包括油脂(甘油三酯)和类脂(磷脂、固醇类)。这类小分子物质通常化学结构有很大的差异，生理功能各不相同，但是都可以在水中相互聚集形成内部疏水的聚集体，而这种空腔型的结构就为现代医学的载药和基因携带提供了一定的条件。而且，脂类是人体所需要的重要营养素之一，与蛋白质、碳水化合物是产能的三大营养素，在供给人体能量方面起着重要作用。脂类也是人体细胞组织的组成部分，是细胞膜的骨架。同时它在体内还有多种作用，例如信号传递，参与免疫等等，是一种很好的生物相容性的分子。胆固醇是构成细胞膜的重要组成成分，利用其与相似相容的特点可以有效的提高细胞膜的通透性，从而增加细胞对于基因载体的摄取量，最终实现转染效率的提升。磷脂酰肌醇在细胞中对于细胞形态、代谢调控、信号传导和细胞的各种生理功能起着非常重要的作用，利用其作为信号分子的作用可以有效的提高基因载体的转染效率。脂溶性维生素在体内大量贮藏，而且本身主要存在于肝脏部分，利用脂溶性维生素可以有效的提高对于肝脏的靶向性，同时还能够通过形成脂质 体增加对于基因的转染。正是因为上述脂质具有良好的性质，并且结合阳离子非病毒载体能够有效的构建基因载体，同时可以有效的解决市售的脂质体材料不能体内转染的缺陷，逐渐成为人们新的研究重点。
细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成，而脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。磷脂双分子层是构成细胞膜的基本支架，具有一定的通透性和流动性。所以一些与细胞膜相似的脂质可以有效的改变细胞膜的流动性与通透性，从而保证细胞能够更多的摄取所需的物质。
乙醇胺是一种在室温下无色透明的粘稠液体，有一定的吸湿性和氨臭，被广泛用作化学试剂、农药、医药、溶剂、染料中间体、橡胶促进剂和表面活性剂等等。
脂质在现代医学的研究中已被引入医药的构建，得到了很多治疗不同疾病的药物。而脂质在基因载体中的作用还没有被人们完全的开发，所以这一研究方向正逐渐引起人们的关注。
利用活性可控聚合ATRP得到一系列类脂质体阳离子基因载体在研究的过程中还存在很多的问题，例如：这种阳离子载体随着分子量的增大，响应的转染效率更高，但是毒性更大，如何在保证毒性适中的情况下尽量提高转染效率成为人们关注的重点；不同的单体具有不同的特性，有些转染效率较高，有效毒性较小，如何筛选出高效高性能的单体也是人们需要考虑的问题；当然，相同的类脂质体基因载体对于不同的细胞系转染效率并不同，如何针对不同的细胞选择最适的基因载体也是需要研究的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种活性可控自由基聚合法(ATRP)构建的以脂质为基体的类脂质体阳离子基因载体，该类脂质体阳离子基因载体分子量可控，分布窄，可有效的增加细胞的摄取量从而增加细胞的转染效率，并且本身毒性较小，几乎不会引起免疫反应，具有很高的商业潜能，同时具备投入临床试验的可能。
在本发明的反应体系中，引发剂的合成从脂质本身开始，通过将脂质体上的羟基或者羧基基团进行修饰，使其整体上引入溴作为后续ATRP的引发点，从而得到一系列脂质引发剂；然后通过原子转移自由基活性聚合(ATRP)将各种单体接枝到脂质引发剂的引发点上得到具有提高基因转染效率以及生物相容性的基因 载体，并且对于这种基因载体后续有进一步的修饰。
本发明所述的类脂质体阳离子基因载体的活性可控自由基聚合方法，该聚合方法的聚合反应体系包括脂质大分子引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr或CuBr与CuBr2的混合物；其中单体与脂质大分子引发剂的质量比为0.001-60，优选0.01-50，更优选0.05-40；配体与脂质大分子引发剂的质量比为0.01-1.2，优选0.01-1，更优选0.05-1；CuBr与脂质大分子引发剂的质量比为0.001-1.5，优选0.01-1，更优选0.05-0.08；CuBr与CuBr2的质量比为(3:1)-(5:1)；有机溶剂与脂质大分子引发剂的质量比为50-500，优选50-450，更优选70-400。
所述的聚合反应温度为0-60℃，优选5-55℃，更优选10-50℃；反应时间为10-500min，优选10-400min，更优选30-400min。
所述的聚合反应在无氧环境下连续进行。
所述的聚合反应体系中的各组分加入顺序为：先将脂质大分子引发剂溶于有机溶剂，然后加入水、单体，再加入配体，最后加入CuBr或CuBr与CuBr2的混合物引发活性可控自由基聚合。
所述的脂质大分子引发剂为脂质上的羟基或羧基与溴通过酯化反应得到，或脂质上的氨基与溴经酰胺化反应得到。
所述的脂质为胆固醇、磷脂酰肌醇、脂溶性维生素。
所述的单体为甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、N-异丙基丙烯酰胺中的一种或者几种。
所述的配体为2,2’-联吡啶、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4,4’-联吡啶中的一种或者几种。
所述的有机溶剂选自砜类、亚砜类、酰胺类、醇类、二氯甲烷中的一种或者几种。
所述的醇类选自甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、异戊醇、正己醇中的一种或者几种；所述的砜类选自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二苄基砜、甲基苯基砜、环丁砜中的一种或者几种；所述的亚砜类选自二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、二己基亚砜中的一种或者几种。
当有机溶剂为亚砜类时，反应体系中不包含水。所述的聚合反应体系中不含 水时的各组分加入顺序为：将脂质大分子引发剂溶于有机溶剂，然后加入单体，再加入CuBr或CuBr与CuBr2的混合物，最后加入配体引发活性可控自由基聚合。
当使用的单体不含甲基丙烯酸缩水甘油酯时，聚合反应完成后暴露在空气中终止聚合，再向产品中加入水，加水量与产物的比例为100-300mL/g，之后放入透析袋中透析以除去小分子，最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得到类脂质体阳离子基因载体。
当使用单体包含甲基丙烯酸缩水甘油酯时，聚合反应完成后加入脂质大分子引发剂质量的100-300倍的水或者甲醇，或者暴露在空气中终止聚合；然后用乙醚、乙醇或者甲醇沉淀直到形貌变为固体；真空干燥除去乙醚、乙醇或者甲醇得到粉末状或者絮状的固体；将得到的粉末状或者絮状的固体进行开环反应：将得到的粉末状或者絮状的固体在30-35℃无氧环境下加入二甲基亚砜搅拌溶解，之后加入胺在80-90℃范围内进行开环反应；其中二甲基亚砜与得到的粉末状或者絮状的固体的质量比为200-500，优选150-450，更优选120-350；胺与得到的粉末状或者絮状的固体的质量比为20-50，优选15-45，更优选20-40；开环反应持续1-3天以后，用乙醚沉淀聚合物直到变为粘稠状固体，将固体放入真空干燥箱中抽干乙醚，随后加水，再冷冻干燥直至除去所有的水分，得到开环的类脂质体阳离子基因载体。
所述的胺选自三乙胺、乙醇胺、或乙二胺。
有益效果：本发明利用活性可控自由基聚合法制得分子量大小为3000-20000，分子量分布在1.2-1.5的聚合物。其中：(1)通过胆固醇引发剂引发活性聚合得到的一系列产物，其数均分子量(Mn)为4000-18000，分子量分布窄，分布系数(Mw/Mn)在1.2-1.4；其通过乙醇胺开环反应得到的基因载体的数均分子量(Mn)为8000-20000，分布系数(Mw/Mn)在1.6-2.0。(2)通过磷脂酰肌醇引发剂引发活性聚合得到的一系列产物，其数均分子量(Mn)为3000-20000，分子量分布窄，分布系数(Mw/Mn)在1.2-1.4；其通过乙醇胺开环反应得到的基因载体的数均分子量(Mn)为8000-20000，分布系数(Mw/Mn)在1.6-2.0。这种聚合手段得到的诸如上述的聚合物一般分布较窄，分子量可控，而且能够储存相当长的时间而不变性。而且相对于一般的阳离子基因载体，此基因载体通过脂质基体有效的与细胞膜相容的特点，或者本身构建成为脂质体增加细胞的摄取量的特点，从而增加细胞的转染效率。具体的这类类脂质体基因载体在HepG2、Hela、C6、COS7、SL、 H9C2细胞系中都有较好的转染效率，同时相对于国际上已经投入商业化使用的脂质体lipfect2000、lipfect3000等具有更高的转染效率，并且能够解决上述材料不能在体内转染的缺陷，和脂质体lipfect2000在体内转染效率较差的难题，操作简单，具有很高的商业化潜力。
附图说明
图1为转染效率图；CHO-PGEA的不同分子量产品为实施例1-6所得到的胆固醇接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生物得到的可增加细胞吞噬率和转染效率的类脂质体阳离子基因载体。
图2为细胞内毒性图；PEI为金标，CHO-PGEA的不同分子量产品为实施例1-6所得到的胆固醇接枝聚甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生物得到的可增加细胞吞噬率和转染效率的类脂质体阳离子基因载体。
具体实施方式
实施例1
取0.2g胆固醇引发剂CHO-Br完全溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，再将1.73mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和135μL的五甲基二乙烯三胺(PMDETA)溶于该溶液中，以鼓泡方式通氮气5min后迅速加入54mg的溴化亚铜(CuBr)，立即用橡皮塞密封。体系于27-30℃下无氧氮气保护环境下反应30min，开瓶塞静置2-3min，然后用甲醇沉淀，再用甲醇洗两次，以除去PDMETA，CuBr，以及未反应的GMA和大部分的溶剂DMSO。离心之后除去上层清液，并将下层沉淀中的残留甲醇吹干，之后再用1-2mLDMSO溶解，用去离子水沉淀并重复洗两遍。离心之后除去上层清液，加少量的纯水冻干。冻干后的产品为白色粉末。此粉末即为得到的聚合物，记为CHO-PGMA1。
聚合物(CHO-PGMA1)的数均分子量(Mn)为4600，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.21。
取0.15g得到的CHO-PGMA1溶解于4mL的DMSO中，向其中加入2mL的乙醇胺(EA)，以鼓泡方式通氮气5min后，体系于80℃，磁力搅拌下反应30min。之后用取少量滴加入纯水中发现产物溶解，则说明开环反应彻底完成。这时将反应液用乙醚沉淀并且用乙醚洗两遍，离心去除上层清液后吹干乙醚，得到黄色粘液。用少量纯水溶解，之后用1000的透析袋透析1天以除去EA，之后取出透析 袋中的液体冻干得到白色絮状产物，即为我们所需要胆固醇基体的阳离子基因载体，记为CHO-PGEA1。
聚合物(CHO-PGEA1)的数均分子量(Mn)为9000，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.90。
实施例2
取0.2g胆固醇引发剂，反应步骤和后处理如实施例1，只是加入的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的体积为3.46mL。此方法得到的聚合物记为CHO-PGMA2。聚合物(CHO-PGMA2)的数均分子量(Mn)为9365，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.23。
取0.15g得到的CHO-PGMA2溶解于4mL的DMSO中，反应步骤和后处理方式如实施例1，得到的絮状聚合物即为我们所需要胆固醇基体的阳离子基因载体，记为CHO-PGEA2。
聚合物(CHO-PGEA2)的数均分子量(Mn)为15000，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.85。
实施例3
取0.2g胆固醇引发剂，反应步骤和后处理如实施例1，只是加入的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的体积为5.19mL。此方法得到的聚合物记为CHO-PGMA3。聚合物(CHO-PGMA3)的数均分子量(Mn)为13500，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.30。
取0.15g得到的CHO-PGMA3溶解于4mL的DMSO中，反应步骤和后处理方式如实施例1，得到的絮状聚合物即为我们所需要胆固醇基体的阳离子基因载体，记为CHO-PGEA3。
聚合物(CHO-PGEA3)的数均分子量(Mn)为18000，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.80。
实施例4
取0.2g磷脂酰肌醇引发剂PI-Br完全溶解于5mL二甲基亚砜(DMSO)中，再将0.91mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和70μL的五甲基二乙烯三胺(PMDETA)溶于该溶液中，以鼓泡方式通氮气5min后迅速加入28mg的溴化亚铜(CuBr)，立即用橡皮塞密封。体系于27-30℃下无氧氮气保护环境下反应30min， 开瓶塞静置2-3min，然后用乙醇沉淀，以除去PDMETA，CuBr，以及未反应的GMA和大部分的溶剂DMSO。离心之后除去上层清液，在真空干燥箱中除去多余的乙醇。抽干后的产品为白色粉末。此粉末即为得到的聚合物，记为PI-PGMA1。
聚合物(PI-PGMA1)的数均分子量(Mn)为4500，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.31。
取0.15g得到的PI-PGMA1溶解于4mL的DMSO中，向其中加入2mL的乙醇胺(EA)，以鼓泡方式通氮气5min后，体系于80℃，磁力搅拌下反应30min。之后用取少量滴加入纯水中发现产物溶解，则说明开环反应彻底完成。这时将反应液用乙醚沉淀并且用乙醚洗两遍，离心去除上层清液后吹干乙醚，得到黄色粘液。用少量纯水溶解，之后用1000的透析袋透析1天以除去EA，之后取出透析袋中的液体冻干得到白色絮状产物，即为我们所需要胆固醇基体的阳离子基因载体，记为PI-PGEA1。
聚合物(PI-PGEA1)的数均分子量(Mn)为6500，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.81。
实施例5
取0.2g磷脂酰肌醇引发剂，反应步骤和后处理如实施例4，只是加入的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的体积为1.82mL。此方法得到的聚合物记为PI-PGMA2。
聚合物(PI-PGMA2)的数均分子量(Mn)为9100，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.21。
取0.15g得到的PI-PGMA2溶解于4mL的DMSO中，反应步骤和后处理方式如实施例4，得到的絮状聚合物即为我们所需要胆固醇基体的阳离子基因载体，记为PI-PGEA2。
聚合物(PI-PGEA2)的数均分子量(Mn)为13000，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.91。
实施例6
取0.2g磷脂酰肌醇引发剂，反应步骤和后处理如实施例4，只是加入的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的体积为2.73mL。此方法得到的聚合物记为PI-PGMA3。
聚合物(PI-PGMA3)的数均分子量(Mn)为14800，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.22。
取0.15g得到的PI-PGMA3溶解于4mL的DMSO中，反应步骤和后处理方式如实施例4，得到的絮状聚合物即为我们所需要胆固醇基体的阳离子基因载体，记为PI-PGEA3。
聚合物(PI-PGEA3)的数均分子量(Mn)为20000，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.92。
实施例7
取0.2g胆固醇引发剂CHO-Br完全溶解于2mL甲醇中，再向体系中加入4mL的去离子水、2.0mL的甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)和135μL的五甲基二乙烯三胺(PMDETA)溶于该溶液中，以鼓泡方式通氮气5min后迅速加入54mg的溴化亚铜(CuBr)，立即用橡皮塞密封。体系于27-30℃下无氧氮气保护环境下反应30min，开瓶塞静置2-3min，然后加入5mL的水，再用截留分子量为1000的透析袋进行透析，以除去PDMETA，CuBr，以及未反应的DMAEMA和大部分的溶剂甲醇。透析一天后冻干得到产品性状为白色絮状。此絮状产物即为得到的胆固醇为基体的另一种阳离子基因载体，记为CHO-PDMAEMA1。
聚合物(CHO-PGMA1)的数均分子量(Mn)为7850，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.22。
实施例8
取0.2g胆固醇引发剂，反应步骤和后处理如实施例7，只是加入的甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)的体积为4.0mL。此方法得到的阳离子基因载体记为CHO-PDMAEMA2。
聚合物(CHO-PDMAEMA2)的数均分子量(Mn)为15800，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.25。
实施例9
取0.2g胆固醇引发剂，反应步骤和后处理如实施例7，只是加入的甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)的体积为6.0mL。此方法得到的阳离子基因载体记为CHO-PDMAEMA3。
聚合物(CHO-PDMAEMA3)的数均分子量(Mn)为22000，分子量分布指数(Mw/Mn)为1.27。